專利名稱：新的調節存活蛋白的抗老化肽及包括其的組合物的制作方法
新的調節存活蛋白的抗老化肽及包括其的組合物本發明涉及化妝品和藥物領域。本發明涉及通式(I) R1- (AA)n-X1-X2-Arg-Glu - Met - Asn - Trp - X3 - (AA)p - R2的肽化合物，其是存活蛋白的調節物，還涉及它們在化妝品和/或藥物中的應用以(i)預防和/或校正皮膚老化的跡象和皮膚及角質附件中光老化，(ii)預防和/或限制脫發和/或刺激毛發生長，及(iii)保護皮膚抗外部侵害，包括UV輻射導致的那些。
老化相應于一系列生理和心理過程，在一定年齡后它們改變機體的結構和功能。老化有兩種類型，即一方面是內在老化，另一方面是外在老化。內在老化是由于遺傳因素、生化變化導致，所述生化變化在疲勞、壓力、激素變化如妊娠期間等的條件下發生。另一方面，外在老化是由在整個生命期間機體所處的環境因素導致，所述環境因素如污染、太陽、疾病等。這是一種緩慢逐漸的過程，通過各種方式影響機體的每一個細胞并且以不同方式表現。例如，在皮膚情況中，其表觀由各種類型的內部或外部侵害修飾，可以觀察到皺紋和細紋的出現、色素沉著斑點和色素減少斑點、皮膚干燥或甚至脫水、皮膚變薄、彈性組織變性(6lastose)、瑕疵(des imperfections)、老年斑等等。在毛發情況中,老化主要表現在頭發變白(變灰)，但是也表現在頭發密度降低，頭發稀疏，其可以導致甚至更廣泛的毛發脫落，已知為脫發。在哺乳動物特別是人類中，皮膚和眼睛是持續更新的器官。例如，皮膚表面脫落現象必須被表皮更新補償，其由基底層中的角質形成細胞保證，所述角質形成細胞主動分裂和分化成角質層細胞。毛發更新周期也可以分為3個明顯階段，稱作生長期、退化期和毛發生長終期。在毛發生長終期中形成新的毛球并起始新的毛發生長周期。這些更新活性以及損傷情況中如由UV照射或創傷導致的損傷情況中的皮膚或指甲修復活性依賴于體干細胞的存在，在皮膚中稱為表皮成體干細胞，在毛發情況中稱為毛囊成體干細胞。這些細胞是有些獨特的，它們具有顯著的自我更新和分化能力。它們已經通過一系列分子標記如￠1-整聯蛋白、a 6-整聯蛋白、角蛋白K15、角蛋白K19等在基底層中鑒別。細胞增殖和分化是依賴于細胞周期的過程。控制正確細胞周期功能的機制基本上基于一系列互補蛋白結構，如“染色體乘客復合體(chromosomal passenger complex)”(CPC)。CPC在有絲分裂進程和胞質分裂階段起關鍵作用。CPC由4個蛋白質組成，它們是INCENP (著絲粒內蛋白)、Borealin、Aurora B激酶和存活蛋白。存活蛋白以細胞周期依賴方式在點G2/M表達。已經示出存活蛋白或者Aurora B激酶由siRNA的失活誘導主要有絲分裂缺陷(Lens SM et al.，EMB0.J. 2003，22 (12): 2934-47)。其它實驗證實存活蛋白、其Crm-I載體(或核輸出蛋白I)及其CPC配偶體在控制有絲分裂期間的關鍵作用。最后，其它研究允許存活蛋白被分類為是屬于凋亡抑制劑蛋白家族的分子，也稱為“凋亡蛋白抑制劑”(IAP)。事實上，存活蛋白看起來通過抑制caspase-9的信號傳導途徑而保護細胞免于凋亡。但是，看起來存活蛋白的有絲分裂活性優于其抗凋亡活性。已經確認與老年對象表皮中存在的相比，位于年輕對象表皮基底層中的成體干細胞中存在更高水平的存活蛋白。另外，已經證明胎兒組織含有大量存活蛋白，而其在分化的組織中基本上不存在(Adida et al. ,Am J Pathol. 1998，152:43-49)。這就是怎么建立了所述干細胞中存活蛋白的量與皮膚老化之間的關系(Marconi etal. , Stem Cells 2007;25:149-55)。正是基于這些發現，申請人令人驚奇地證實下述通式
(I)的妝化合物=R1 - (AA) J1-X1-X2- Arg - Glu - Met - Asn - Trp -X3- (AA) p - R2 是存活蛋白的非常好的調節物及因此是CPC復合體的非常好的調節物并且對于治療和/或預防皮膚老化跡象以及保護皮膚抗外部侵害如UV照射以及脫發具有顯著作用。目前尚沒有具有這種類型作用的化合物被建議用于治療老化或脫發。一些類型的肽化合物已被建議通過調節存活蛋白表達而作為抗腫瘤治療(專利EP1913947、EP1931376)。使用存活蛋白抑制劑肽的其它治療已經被公開，例如抑制毛發生長(專利EP1841401)，或者輔助鑒別腫瘤(專利EP2119726)等。專利申請FR 2 932 086的一部分描述了選自 Coleus Forskolii、Lepechinia caulescens、Limnophila conferta、Danielliaoliveri、Nostoc Commune>Scenedesmus dimorphus、Curcuma longa 或 Crocus sativus 的提取物的化妝品制劑作為存活蛋白促進劑以預防或延遲皮膚老化跡象的出現或者用于促進毛發生長。但是，尚沒有使用調節存活蛋白(及CPC蛋白)的化合物的治療被建議用于(i)對抗皮膚老化跡象，(ii)保護皮膚抗外部侵害，包括UV照射導致的那些，及(iii)限制脫 發或者激活毛發生長。然而，在這一領域真正需要創新治療。因此，本發明描述的肽化合物可以提供新類型的有效治療以對抗老化，其是通過直接作用于表皮成體干細胞的直接環境(environnement proche)以保護它們并且使它們最好地保證它們在更新和保護皮膚細胞過程中的作用。肽化合物具有保護表皮成體干細胞的環境及調節這些細胞中存活蛋白的量的優點，但是不增加它們的克隆發生。通常，本發明的肽通過保護干細胞的緊密環境及限制它們可能的耗竭而有助于保持干細胞的“干細胞勢(Sternness Potential)”。通過對表皮和毛囊成體干細胞的保護作用，本發明的化合物也可以預防脫發和刺激毛發生長。因此，本發明的第一個目的是提供下述通式(I)的肽化合物R1 - (AA) J1-X1-X2- Arg - Glu - Met - Asn - Trp -X3- (AA) p - R2其中X1是亮氨酸、丙氨酸或者無氨基酸，X2是賴氨酸、脯氨酸或者無氨基酸，X3是亮氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸或者無氨酸，AA是任意氨基酸，且n和p是0到2之間的整數，R1是^末端氨基酸伯胺官能團，其是游離的或者是用具有飽和或非飽和的C1-C3tl烴基鏈的酰基類型基團取代的，酰基類型基團可以選自乙酰基或者芳香基，其中后者可以選自苯甲酰基、甲苯磺酰基或者芐氧羰基類型，R2是C-末端氨基酸羧基官能團的羥基，其是未取代的或者是用可以選自C1-C3tl烴基鏈或者NH2、NHY或者NYY基團的基團取代的，其中Y是C1-C4烴基鏈，所述通式(I)的序列由5-12個氨基酸殘基組成，且其中所述通式(I)的序列可以包括AA、X1, X2或X3氨基酸的衍生物或AA、Xp X2或X3氨基酸用其它化學等價氨基酸的取代。本發明的第二個目的是提供化妝品組合物，其包含所述通式(I)的肽化合物作為活性成分。另外，本發明的第三個目的是包含所述通式(I)的肽化合物的化妝品組合物的用途，用于(i)預防和/或治療皮膚老化跡象和光老化及促進組織再生，(ii)保護皮膚抗外部侵害，特別是UV照射所致的那些，(iii)恢復存活蛋白最佳水平及保證“染色體乘客復合體”的更好發揮功能，及(iV)預防和/或限制脫發和/或刺激毛發生長。最后，本發明的第四個目的是提供一種方法，使用包含所述通式(I)的肽化合物的組合物對待治療的皮膚或角質附件進行化妝品治療。本發明的第一個目的涉及通式(I)的肽化合物R1 - (AA) J1-X1-X2- Arg - Glu - Met - Asn - Trp -X3- (AA) p - R2 (I)其中X1是亮氨酸、丙氨酸或者無氨基酸，X2是賴氨酸、脯氨酸或者無氨基酸， X3是亮氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸或者無氨酸，AA是任意氨基酸，且n和p是0到2之間的整數，R1是^末端氨基酸伯胺官能團，其是游離的或者是用具有飽和或不飽和的C1-C3tl烴基鏈的酰基類型基團取代的，所述酰基類型基團可以選自乙酰基或者芳香基，其中后者可以選自苯甲酰基、甲苯磺酰基或者芐氧羰基類型，R2是C-末端氨基酸羧基官能團的羥基，其是未取代的或者是用可以選自C1-C3tl烴基鏈或者NH2、NHY或者NYY基團的基團取代，其中Y是C1-C4烴基鏈，所述通式(I)的序列由5-12個氨基酸殘基組成，且其中所述通式(I)的序列可以包括kk、\、\或X3氨基酸的衍生物或者kk、\、\或X3氨基酸用其它化學等價氨基酸的取代。術語“肽化合物”或“肽”是指由肽鍵或者修飾的肽鍵連接在一起的兩個或更多個
氨基酸的鏈。“肽化合物”或“肽”是指如上所述的本發明的天然發生的或者合成的肽，或者至少是其通過蛋白酶解或者合成獲得的片段之一，或者也是其序列完全或者部分由上述肽序列組成的任何天然發生的或合成的肽。組成本發明肽化合物的氨基酸可以呈左旋構型，即L-構型，和/或可以呈右旋構型，即D-構型。本發明的肽因此可以是L-、D-或者DL-形式。為了改善對降解的抗性，可能需要使用被保護形式的本發明的肽。保護形式顯然必須是生物學相容形式，并且應該與化妝品和藥物領域應用相容。優選地，為保護N-末端氨基酸伯胺官能團，使用由具有C1-C3tl飽和或不飽和烴基鏈取代的酰基類型的基團R1，其可以選自乙酰基團或者芳香基團。優選地，為保護C-末端氨基酸羧基官能團，用C1-C3tl烴基鏈類型或者NH2、NHY或NYY基團取代基團R2，其中Y是C1-C4烴基鏈。本發明的肽可以在N-末端、C-末端或者這兩個末端被保護。在第一個優選的實施方案中，在式(I)中，X1是亮氨酸或者無氨基酸，X2是賴氨酸或者無氨基酸，X3是酪氨酸或者無氨酸，在AA中，整數n和p等于0，R1是^末端氨基酸伯胺官能團，其是游離的或者是用具有飽和或不飽和的C1-C3tl烴基鏈的酰基類型基團取代，所述酰基類型基團可以選自乙酰基或者芳香基，其中后者可以選自苯甲酰基、甲苯磺酰基或者芐氧羰基類型，R2是C-末端氨基酸羧基官能團的羥基，其是游離的或者是用可以選自C1-C3tl烴基鏈或者NH2、NHY或者NYY基團的基團取代，其中Y是C1-C4烴基鏈。在第二個優選的實施方案中，所述肽化合物相應于下式之一(SEQ ID No I) Ile - Leu - Arg - Glu - Met - Asn - Trp - Gly - NH2(SEQ ID No 2) Arg - Glu - Met - Asn - Trp - NH2(SEQ ID No 3) Asp - Ala - Arg - Glu - Met - Asn - Trp - Asp - Thr(SEQ ID No 4) Leu - Arg - Glu - Met - Asn - Trp - Tyr - NH2 (SEQ ID No 5) Arg - Glu - Met - Asn - Trp-Phe - Met - Val(SEQ ID No 6) Leu - Lys-Arg - Glu - Met - Asn - Trp - Tyr - NH2。本發明還涉及這些序列的同源形式。本發明“同源”是指與選自序列SEQ ID No I至SEQ ID No 6的所述肽序列至少50%、或者優選至少80%及更優選至少90%相同的任何肽序列。“至少X%相同的肽序列”是指經過兩個序列的最佳對比后獲得的進行比較的兩個序列的氨基酸殘基之間的百分比或相似性。最佳對比是用局部同源性算法如得自NCBI網站的BLAST P計算機軟件中使用的那些算法獲得的。術語“同源”也可以指肽，其由于化學等價氨基酸的取代即由于由具有相同特征的另一殘基取代一個殘基而與序列SEQ ID No I至SEQ ID No 6的肽序列不同。傳統的取代因此在Ala、Val、Leu和Ile之間進行；在Ser和Thr之間進行；在酸性殘基Asp和Glu之間進行；在Asn和Gln之間進行；以及在堿性殘基Lys和Arg之間進行或在芳香殘基Phe和Tyr之間進行。本發明的通式(I)的肽可以通過傳統化學合成(固相或者液體均質相中)或者通過酶合成(Kullman et al. , J. Biol. Chem. 1980, 225, 8234)從其組成氨基酸或衍生物獲得。本發明的肽可以是天然發生的或者合成的。優選地，根據本發明，肽通過化學合成獲得。最后，活性成分可以是單個肽、肽混合物或者肽衍生物和/或由氨基酸衍生物組成。本發明的肽化合物可以用作藥物。根據本發明的一個有利的實施方案，本發明的肽化合物溶解在一或多種本領域技術人員常規使用的生理學適合的溶劑中，如水、乙醇、丙二醇、丁二醇、雙丙二醇(dipropylSne glycol)、乙氧基二甘醇或丙氧基二甘醇(diglycols ethoxyles orpropoxyl6s)、環狀多元醇(polyols cycliques)或者這些溶劑的任意混合物。根據本發明另一個有利的實施方案，本發明的肽化合物溶解在化妝品或藥物載體如脂質體中，或者吸附到粉末狀有機聚合物、礦物支持物如滑石粉和膨潤土上，更通常溶解于或固定于任何生理學合適載體。本發明肽化合物特征在于其允許存活蛋白的量和/或CPC活性被調節。“允許存活蛋白的量被調節”的肽化合物是指能夠通過增加或降低CPC和/或存活蛋白的合成(經直接或間接調節基因表達)或者通過其它生物學過程如RNA信使轉錄物的穩定化或不穩定化而增加或降低CPC復合體和/或存活蛋白的活性的任何肽或生物學活性衍生物。
本發明的第二個目的涉及包含所述通式(I)的肽化合物作為活性成分的化妝品組合物。優選地，本發明的組合物呈適于局部應用的形式，其包含化妝品可接受的介質。“化妝品可接受的”是指適于與皮膚或人類角質附件接觸、無任何毒性、不相容性、不穩定性、過敏反應等風險的介質。用于應用于皮膚的組合物可以是乳霜(C^me)、水包油或油包水乳液或復乳(6mulsion multiple)、溶液、懸液、微乳液、水性凝膠或無水凝膠、精華素(s6rum)形式，或者也可以是小泡分散液、貼(patch)、噴霧、軟膏、發膏、乳液、膠體、乳(lait)、化妝水(lotion)、口紅，或者也可以是粉末，所有均適用于應用于皮膚、嘴唇和/或角質附件。優選地,所述肽化合物以在大約0. 0005和500ppm之間的濃度、優選大約0. 01和5ppm之間的濃度存在于組合物中。更優選地，本發明的組合物進一步含有至少一種其它活性成分，其促進所述肽化合物的作用。例子包括但不限于下列類別成分其它活性肽物質、植物提取物、愈合、抗老 化、抗皺、舒緩(apaisants)、自由基清除劑和抗UV物質,刺激真皮大分子合成或能量代謝的物質、水合、抗細菌、抗真菌、抗炎物質、麻醉劑、調節皮膚分化、色素沉積或色素脫失的物質，刺激指甲或毛發生長的物質等等。優選地，使用具有抗皺活性的物質如自由基清除劑或抗氧化劑或者刺激真皮大分子合成物質或者刺激能量代謝的物質。特別地，活性成分選自維生素、植物留醇、黃酮類化合物、DHEA和/或其前體或者其化學或生物學衍生物、金屬蛋白酶抑制劑或者類視黃醇。在一個更特別的實施方案中，本發明的組合物除了通式(I)的肽化合物之外還包含，-一 (或多個)細胞色素c促進劑化合物；和/或-一 (或多個)水通道蛋白促進劑化合物；和/或；-一 (或多個)sirtuine促進劑化合物；和/或-一 (或多個)刺激細胞粘附的化合物；和/或-一(或多個)增加膠原型基質蛋白、層粘連蛋白等產生的化合物；-一 (或多個)調節蛋白酶體活性的化合物；-一 (或多個)調節晝夜節律的化合物；-一 (或多個)調節hsp蛋白的化合物；-一 (或多個))增加細胞能量的化合物；- 一 (或多個)調節色素沉積的化合物；-一 (或多個)誘導輔酶QlO的化合物；-一 (或多個)改善皮膚屏障功能的化合物；-一 (或多個)線粒體保護化合物。上述化合物可以是天然發生的，如植物肽水解物或者是合成來源的，如肽化合物。另外，添加劑如溶劑、稀釋劑、染料、防曬劑、仿曬劑(agents
料、填充劑、防腐劑、氣味吸收劑、增稠劑、乳化劑、濕潤劑、軟化劑、香料、抗氧化劑、成膜劑、螯合劑、掩蔽劑(s6questrants)、調節劑(conditionnants)等可以加入組合物中。在所有情況中，本領域技術人員會保證選擇這些佐劑及其比例以不損害本發明組合物的有利性質。例如，這些佐劑可以以組合物總重量的0.01-20%的量存在。當本發明的組合物是乳液時，脂肪相可以占組合物總重量的5-80% (重量)并且優選地占5-50% (重量)。組合物中使用的乳化劑和輔助乳化劑選自本領域常用的那些。這些可以例如組合物總重量的0. 3-30% (重量)的量使用。本發明的第三個目的涉及包含本發明的肽化合物的組合物的應用，用于恢復皮膚、毛發和角質附件的細胞中存活蛋白的最佳水平，以及保證“染色體乘客復合體”更好發揮功能。“恢復存活蛋白的最佳水平”是指本發明化合物增加或降低皮膚細胞特別是表皮和毛囊成體干細胞中存在的存活蛋白的量的能力，從而后者可以最佳控制它們的有絲分裂，因此最佳滿足表皮細胞更新的需求。本發明的另一個目的涉及包含所述肽化合物和化妝品可接受的介質的化妝品組合物的應用，用于預防和/或治療皮膚老化跡象和光老化及促進組織再生。“皮膚老化跡象”包括但不限于由皮膚老化導致的所有明顯表現。特別地，這表示皺紋、深粗皺紋、細紋、裂痕(crevasses)、皮膚和皮下組織的下垂(relachement)、皮膚彈性喪失、呆滯(sluggishness)、緊致性和色調喪失(la perte de fermeteet de tonicit6)以及真皮萎縮。另外，“皮膚老化跡象”還指毛孔增大、瑕疵、褪色(decoloration)、老年斑、角化病、膠原喪失和真皮及表皮中的其它變化，也指皮膚、毛發和指甲由于老化所致的任何外觀變化，例如角質層表面粗糙，也指不系統性表現為改變的外觀的皮膚的任何內部改變，例如真皮變薄。“光老化”是指由長期和累積暴露于太陽導致的皮膚過早老化。“組織再生”是指從一或多個細胞的組織重建。組織再生過程特別涉及傷口和愈合。本發明的肽化合物可以促進這種再生過程，特別是通過保護表皮和毛囊成體干細胞的環境而進行。體外進行的測試顯示形成特異于這種干細胞的緊密環境的蛋白質表達增加。表達被增加的蛋白質是P I-整聯蛋白、a 6-整聯蛋白、角蛋白K15以及角蛋白K19，后者是高度特異于毛球中成體干細胞的角蛋白。本發明的另一目的涉及本發明的組合物保護皮膚抗外部侵害特別是UV照射所致那些侵害的用途。“外部侵害”是指能由環境導致的侵害。例子包括如污染、UV照射或者也包括刺激性化學物如表面活性劑、防腐劑或香料，機械侵害如磨損、刮或脫毛。氣氛的干燥也是表皮侵害的主要因素。所有這些現象導致基底層厚度降低。因為后者變薄并含有較少的表皮成體干細胞，皮膚再生以更不合適方式發生，老化加速。體外進行的測試顯示應用包含本發明肽化合物的組合物使得由于UV照射組成基底層的細胞所致的侵害的影響受到限制，原因是這種化合物的保護作用。在一個特別優選的實施方案中，本發明涉及包含所述肽化合物的組合物預防和/或限制脫發和/或刺激毛發生長的用途。在皮膚和毛囊活檢樣品上進行的測試顯示本發明的活性成分對毛囊有保護作用，特別是當暴露于UVA和UVB照射時。本發明的化合物因此對于毛囊細胞產生了抗外部侵害特別是抗UV照射的保護作用。最后，本發明的最后一個目的涉及化妝品治療方法，特征在于包含有效量的本發明肽化合物的組合物被局部應用于待治療的皮膚或角質附件，以預防和/或治療皮膚老化跡象和光老化及促進組織再生。下述實施例描述和證實了肽化合物的功效如本發明描述的那些，但是不應被理解為限制本發明。、
圖I是顯示在富含表皮成體干細胞的細胞級分上進行的comets測試結果的柱形圖。實施例I :細胞級分的制備和存活蛋白的定量為研究CPC蛋白質在各種類型應激下維持和保護表皮成體干細胞的作用，制備若干人類表皮原代細胞級分。分級分離基于細胞對膠原IV的粘附時間小于20分鐘相應于快速粘附(級分RA)，小于5小時相應于慢粘附No I (級分SAl )，小于16小時相應于慢粘附No 2 (級分SA2)，最后無粘附角質形成細胞(級分NA)。細胞級分RA含有最快粘附及因此分化更少的細胞，結果是RA是富含表皮成體干細胞的 級分。相反，級分SA1、SA2和NA分別是含有越來越少干細胞的級分。之后，用Western印跡鑒定存活蛋白水平。結果這個鑒定之后，可見存活蛋白在RA細胞中過表達，表達水平在SA1、SA2細胞中逐漸降低直至在NA細胞中數值接近為O。實施例2 :肽SEQ ID No 2對細胞級分RA和SAl中存活蛋白表達的促進作用的證實肽SEQ ID No 2調節作用的研究通過在培養的細胞級分RA和SAl上經Western印跡評估存活蛋白的表達而進行。Western印跡技術是常規的半定量方法，用于評估細胞中蛋白質的比例。方案級分RA和SAl在直徑IOOmm的盒子中于37°C、含有5%C02的濕潤氣氛下生長48小時，含有或不含有稀釋至3%(從KT4M溶液稀釋)的化合物。漂洗細胞，然后用提取緩沖液(25mM Tris-HCl pH 7. 6，150mM NaCl, 1%NP_40, 1%脫氧膽酸鈉和0. 1%SDS)在蛋白酶抑制劑組合(Halt蛋白酶抑制劑PIERCE)存在下從載體分離。如此提取的蛋白質以10，OOOrpm在4°C離心10分鐘，之后用BCA蛋白質測定試劑盒(Pierce)測定。細胞裂解物與變性緩沖液混合，進行SDS-PAGE電泳。所用凝膠是4-12%Nupage (invitrogen)。蛋白質然后用Iblot轉移儀器(Invitrogen)轉移到膜上。膜用5%TBS_乳/0. l%Tween 20在室溫飽和2小時，然后與稀釋至l/1000th的抗存活蛋白第一抗體(Cell signaling #2808-rabbit)在4°C保溫過夜，隨后在TBS，0. l%Tween中洗滌3次，接著與稀釋至l/5000th的偶聯過氧化物酶的抗兔第二抗體(Immunotech)保溫。用化學發光底物進行顯色。用Chemiimager軟件(AlphaInnotech Corporation USA)進行細胞中蛋白質的定量評估。蛋白質的量表示為與未接受處理的對照條件相比的光密度的百分比。結果肽SEQ ID No 2使得非常富含表皮成體干細胞的那些級分(RA)以及較不富含表皮成體干細胞的那些級分(SAl)中存活蛋白表達增加。實施例3 :在細胞級分RA上的Comets測試Comets測試是允許在細胞水平定量DNA損傷的測試。為此，為了證實本發明的肽化合物的保護作用，將RA類型的細胞與濃度為1%的序列SEQ ID No 2的肽化合物培養24小時，然后用60mJ/cm2的UVB照射。對照條件為使用無肽活性成分存在。細胞然后通過胰蛋白酶化從它們的載體移除，然后在900rpm離心5分鐘，之后濃縮和計數。
然后特定細胞計數(25000個細胞)摻入0. 75%低熔點瓊脂糖凝膠中，然后沉積在預先用1%瓊脂糖包被的玻片上。玻片然后浸沒在裂解緩沖液中4°C、I. 5小時，然后在堿性溶液中4°C、20分鐘。然后裂解細胞，變性DNA。玻片浸沒在電泳溶液中，之后施加電場(20V- 250mA)。如此變性的DNA在瓊脂糖凝膠中在4°C遷移。在玻片上施加DNA熒光染料(2 u g/ml碘化丙唳)使得在DNA被損傷情況中DNA以comets形式被觀測到。使用定量軟件確定應用于每種被測條件的平均尾矩(Tail moment)O這個參數提供了 DNA損傷水平的信息。結果結果示于圖I。當施加肽時尾矩降低44. 7%，即細胞比施加UVB照射的對照條件遭受更少損傷。結果確實證實SEQ ID No 2的肽化合物對衍生自富含表皮成體干細胞的級分(RA)的細胞的保護作用。實施例4 MIT0S0X測試 Mitosox 是由 Invitrogen 銷售的反應物(molecular probes M36008)。其在 UV和H2O2氧化應激期間使用。其使用顯微成像測量細胞中線粒體產生的自由基(R0S)。更特別地，Mitosox特異于超氧陰離子,其是ROS的主要形式。Mitosox應用于活細胞其穿透細胞膜，并且在細胞內，其迅速并特異性地在線粒體內擴散。一旦在線粒體中，Mitosox被超氧陰離子氧化成提供紅色熒光的化合物。這個反應物很容易被超氧陰離子氧化但是不容易被其它自由基氧化，也不被活性氮(NOS)氧化。方案RA和總角質形成細胞(其中“總”表示完整細胞級分)每天用濃度為1%和3%的SEQID No 3的肽化合物處理3次，共48小時。在第二步中，細胞被置于應激下，所述應激如下導致-暴露于5mMH2O2溶液30分鐘；-或者以100mJ/cm2進行UVB照射。施加應激后，漂洗細胞，然后返回到合適培養基中，置于培養箱中，37°C、1小時。然后用Hanks培養基洗漆2次,施加Mitosox溶液5分鐘,最后用相同培養基進行新的洗漆。細胞用甲醛固定10分鐘，施加DAPI 5分鐘，之后用PBS漂洗2次。結果用熒光顯微鏡讀取。結果使用熒光顯微鏡術，注意到在對照條件下，被UV照射和H2O2損傷的細胞數非常高。在這些條件下熒光確實非常強，表明自由基的高度產生。相反，當在暴露于應激之前將肽加入細胞時，注意到突光細胞數極其低。這暗示肽保護細胞抗自由基的過量產生。實施例5 :肽化合物SEQ ID No 2對維持培養的并用角蛋白K19標記的毛囊的作用毛囊培養和包涵(inclusions):用解剖刀和細鉗從活檢樣品中取樣毛囊，然后用William’ s E培養基在抗生素(0. 2%Primocin)、10 u g/ml胰島素、10ng/ml氫化可的松和2mmol/LL_谷氨酰胺存在下于24孔板中培養。毛囊用或不用在Williams’培養基中的1%肽化合物SEQ ID No 2處理，然后保溫24小時。然后施加UV照射(UVA :5J/cm，UVB 200mJ/cm2)，然后再培養毛囊24小時。在實驗結束時，毛囊被摻入到OCT中并在-196°C (液氮)中冷凍。毛囊然后置于低溫恒溫器中以在-23°C制備6-ym切片。含有切片的玻片置于丙酮浴中10分鐘(固定)，然后漂洗。角蛋白K19的免疫標記固定的切片用PBS漂洗一次5分鐘，然后包裹在Pappen中。每個切片與5 yl5%-BSA保溫30分鐘。然后加入50iU稀釋至1/5(^的抗細胞角蛋白K19第一抗體(Progen，Mouse monoclonal)，在恒濕箱中攪拌保溫I小時。用PBS漂洗30分鐘后，加入50 U I熒光標記的第二抗體，在恒濕箱中黑暗下攪拌放置I小時。玻片然后在PBS中漂洗，在FluoromountG中封固玻片和蓋玻片，用落射熒光顯微鏡進行觀測。結果 UV照射毛囊導致在所述毛囊中角蛋白K19的熒光強度有-48%的降低(通過圖像分析定量)。在照射前用肽化合物SEQ ID No 2處理的毛囊具有的角蛋白K19熒光值為+102. 7%。這意味著本發明的肽化合物使得細胞的損傷表觀特別是以角蛋白K19產生而言被防止和避免。實施例6:組合物I.防曬組合物
權利要求
1.下述通式(I)的肽化合物 R1 - (AA) n _ X1 _ X2 _ Arg - Glu - Met - Asn - Trp _ X3 _ (AA) p _ R2 其中 X1是亮氨酸、丙氨酸或者無氨基酸， X2是賴氨酸、脯氨酸或者無氨基酸， X3是亮氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸或者無氨酸， AA是任意氨基酸，且η和P是O到2之間的整數， R1是N-末端氨基酸的伯胺官能團，是未取代的或者是用具有飽和或不飽和的C1-C3tl烴基鏈的酰基類型基團取代的，所述酰基類型基團可以選自乙酰基或者芳香基，其中后者可以選自苯甲酰基、甲苯磺酰基或者芐氧羰基類型， R2是C-末端氨基酸的羧基官能團的羥基，是未取代的或者是用可以選自C1-C3tl烴基鏈或者ΝΗ2、NHY或者NYY基團的基團取代的，其中Y是C1-C4烴基鏈， 所述通式(I)的序列由5-12個氨基酸殘基組成，且其中所述通式(I)的序列可以包括AA、Xp X2或X3氨基酸的衍生物或者AA、Xp X2或X3氨基酸用其它化學等價氨基酸的取代。
2.權利要求I的肽化合物，特征在于在通式(I)中 X1是亮氨酸或者無氨基酸， X2是賴氨酸或者無氨基酸， X3是酪氨酸或者無氨酸， 在AA中，整數η和P等于O, R1是N-末端氨基酸的伯胺官能團，是未取代的或者是用具有飽和或不飽和的C1-C3tl烴基鏈的酰基類型基團取代的，所述酰基類型基團可以選自乙酰基或者芳香基，其中后者可以選自苯甲酰基、甲苯磺酰基或者芐氧羰基類型， R2是C-末端氨基酸的羧基官能團的羥基，是未取代的或者是用可以選自C1-C3tl烴基鏈或者ΝΗ2、NHY或者NYY基團的基團取代的，其中Y是C1-C4烴基鏈。
3.權利要求I或2的肽化合物，特征在于其相應于下式之一 (SEQ ID No :I) lie - Leu - Arg - Glu - Met - Asn - Trp - Gly - NH2 (SEQ ID No 2)Arg - Glu - Met - Asn - Trp - NH2(SEQ ID No 3) Asp - Ala - Arg - Glu - Met - Asn - Trp - Asp - Thr(SEQ ID No 4) Leu - Arg - Glu - Met - Asn - Trp - Tyr - NH2(SEQ ID No 5) Arg - Glu - Met - Asn - Trp - Phe - Met - Val - NH2(SEQ ID No 6) Leu - Lys - Arg - Glu - Met - Asn - Trp - Tyr - NH2。
4.前述權利要求之一的肽化合物，特征在于其溶解在一或多種生理學合適的溶劑中，如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、雙丙二醇、乙氧基二甘醇或丙氧基二甘醇、環狀多元醇或者這些溶劑的任意混合物。
5.前述權利要求之一的肽化合物，用作藥物。
6.一種化妝品組合物，其包含權利要求1-4之一的所述肽化合物作為活性成分。
7.權利要求6的化妝品組合物，特征在于其呈適合局部應用的形式，包含化妝品可接受的介質。
8.權利要求6或7的組合物，特征在于所述肽化合物以大約O.0005和500ppm之間的濃度、優選大約O. Ol和5ppm之間的濃度存在于組合物中。
9.權利要求6-8之一的組合物，特征在于其進一歩含有至少ー種促進所述肽化合物作用的其它活性成分。
10.權利要求9的組合物，特征在于所述活性成分是具有抗皺活性的物質，如自由基清除劑或抗氧化劑，或者是刺激真皮大分子合成的物質，或者還是刺激能量代謝的物質。
11.包含權利要求1-4之一定義的所述肽化合物和化妝品可接受介質的化妝品組合物的應用，用于恢復皮膚、毛發和角質附件細胞中存活蛋白的最佳水平，以及保證“染色體乘客復合體”更好發揮功能。
12.權利要求11的化妝品組合物的應用，用于預防和/或治療皮膚老化跡象和光老化以及促進組織再生。
13.權利要求12的化妝品組合物的應用，特征在于皮膚老化跡象是指皺紋、深粗皺紋、細紋、裂痕、皮膚和皮下組織下垂、皮膚彈性喪失、呆滯、緊致性和色調喪失以及真皮萎縮。
14.權利要求11的組合物的應用，用于保護皮膚抗外部侵害，特別是由于UV照射所致的侵害。
15.權利要求11的組合物的應用，用于預防和/或限制脫發和/或刺激毛發生長。
16.前述權利要求的組合物的應用，用于刺激眼眉生長。
17.化妝品治療方法，特征在于在早晨和/或晚上將包含有效量的權利要求1-4之一的肽化合物的組合物局部施用于待治療的皮膚或角質附件上，以預防和/或治療皮膚老化跡象和光老化，促進組織再生，預防和/或限制脫發，和/或促進毛發生長。
全文摘要
本發明涉及調節存活蛋白的通式(I)R1–(AA)n–X1–X2–Arg–Glu–Met–Asn–Trp–X3–(AA)p–R2的肽化合物。而且，本發明涉及化妝品或藥物組合物，其包括在生理學可接受的介質中的至少一種通式(I)的肽，以及涉及其預防和/或治療表皮老化跡象和光老化和保護皮膚免受外部侵害的用途。另外，本發明的組合物可以用于預防和/或限制毛發脫落和/或刺激毛發生長。最后，本發明涉及用于預防和/或控制表皮老化跡象和光老化的化妝品治療方法。
文檔編號C07K7/08GK102762587SQ201180009473
公開日2012年10月31日 申請日期2011年1月13日 優先權日2010年1月14日
發明者C·達爾法拉, J-M·博托, N·東洛熱 申請人:Isp投資公司