編碼rantes的核酸分子、包含其的組合物以及其使用方法

專利名稱：編碼rantes的核酸分子、包含其的組合物以及其使用方法
技術領域：
本發明涉及編碼RANTES的核酸分子。本發明涉及包含編碼RANTES的核苷酸序列的疫苗，以及預防性和/或治療性免疫個體以對抗免疫原的方法，還涉及包含編碼RANTES的核苷酸序列的免疫治療組合物，以及免疫治療方法。
背景技術：
本申請要求美國臨時申請第61/302，324號的優先權，其以引用方式整體并入本文。RANTES,其為活化時調節的、正常T細胞表達和分泌的(Regulated uponActivation, Normal T-cell Expressed, and Secreted)的縮寫，是被分類為趨化細胞因 子或趨化因子的8kDa蛋白質。RANTES被鑒定為在T細胞活化后的幾天表達的基因。已發現在許多人類疾病中表達的ACC趨化因子，RANTES,在T淋巴細胞中被Kruppel樣因子13 (KLF13)所調節。與趨化因子受體CCR3、CCR5和CCRl相互作用的RANTES對T細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞具有趨化性。其參與白細胞向炎性位點的募集。RANTES與由T細胞釋放的細胞因子IL-2和IFN-Y的結合誘導某些天然殺傷(NK)細胞的增殖和活化。這樣的細胞被稱作CHAK (CC-趨化因子激活的殺傷)細胞。以引用方式并入本文的美國申請第09/622，452號公開了使用編碼RANTES的核酸分子作為免疫治療劑和疫苗組分的組合物和方法。當用作免疫治療劑時RANTES的表達改變了在表達其的個體內免疫系統的某些方面。類似地，當用作疫苗的一部分時RANTES的表達增強了對抗疫苗免疫原的免疫反應的某些方面。免疫治療是指調節人的免疫反應以賦予所期望的治療作用。免疫治療劑是指當施用于個體時調節個體的免疫系統足以最終減少與不期望的免疫反應相關的癥狀或足以通過增強所期望的免疫反應來最終減輕癥狀的那些組合物。在有些情況中，免疫治療是疫苗接種規程的一部分，在所述疫苗接種規程中對個體施用所述疫苗，該疫苗使個體暴露于在此情況下個體為對抗其而產生免疫反應的免疫原，免疫治療劑增強免疫反應和/或選擇性增強對治療或預防特定病況、感染或疾病而言所需的免疫反應的部分(例如細胞免疫(cellular arm)或體液免疫(humoral arm))。疫苗規程可通過遞送調節人免疫反應以誘導改善的免疫反應的試劑來改善。在對個體施用使個體暴露于個體對抗其產生免疫反應的免疫原的疫苗的一些接種規程中，提供增強免疫反應和/或選擇性增強對治療或預防特定病況、感染或疾病而言所需的免疫反應的部分(例如細胞免疫或體液免疫)的試劑。疫苗對于免疫個體以對抗靶抗原例如變應原、病原體抗原或與參與人類疾病的細胞相關的抗原是有用的。與參與人類疾病的細胞相關的抗原包括癌相關的腫瘤抗原和與參與自身免疫病的細胞相關的抗原。在設計這樣的疫苗時，已認識到在接種疫苗個體的細胞中產生靶抗原的疫苗在誘導免疫系統的細胞免疫中是有效的。具體地，使用無毒性載體和DNA疫苗的減活疫苗、重組疫苗各自在接種疫苗的個體的細胞中導致抗原的產生，這導致對免疫系統的細胞免疫的誘導。另一方面，盡管死疫苗或滅活疫苗和僅包含蛋白質的亞單位疫苗可誘導有效的體液反應，但不誘導良好的細胞免疫反應。細胞免疫反應對于提供對抗病原體感染的防護和對于提供用于治療病原體感染、癌癥或自身免疫疾病的有效的免疫介導的治療通常是必須的。因此，在接種疫苗的個體的細胞中產生靶抗原的疫苗例如使用無毒性載體的減活疫苗、重組疫苗和DNA疫苗通常是優選的。已研究了直接施用核酸序列來遞送蛋白質或針對動物和人疾病來進行疫苗接種并且大量努力集中于核酸遞送的有效和高效手段以便產生治療/佐劑蛋白質和/或期望抗原的必要表達。DNA疫苗具有許多優于較傳統的基因遞送和疫苗接種方法(例如減活病毒和重組蛋白質類疫苗)的優點。DNA疫苗安全、穩定、易于生產，并且在人類中良好耐受，其中臨床前試驗表明質粒整合跡象較少[Martin, T.等，Plasmid DNA malaria vaccine: the potential for genomic integration after intramuscular injection.Hum Gene Therj 1999. 10(5):第 759-68 頁；Nichols，W. W.等，Potential DNA vaccineintegration into host cell genome. Ann N Y Acad Sci，1995. 772:第 30-9 頁]。另夕卜，由于疫苗的效力不受預先存在的抗體滴度對載體的影響，DNA疫苗非常適合于反復施用[Chattergoon, M. , J. Boyerj 和 D. B. Weiner，Genetic immunization:a new era invaccines and immune therapeutics. FASEB J，1997. 11(10):第 753-63 頁]。然而，臨床釆用DNA疫苗的一個主要障礙是當轉移到較大動物時平臺(platform)免疫原性的降低[Liu, M. A.和 J. B. Ulmer，Human clinical trials ofplasmid DNA vaccines. AdvGenet, 2005. 55:第25-40頁]。DNA疫苗免疫原工程的最新技術進步，如密碼子優化、RNA優化和免疫球蛋白前導序列的添加已改善了 DNA疫苗的表達和免疫原性[Andre，S.，等，Increased immune response elicited by DNA vaccination with a syntheticgp 120sequence with optimized codon usage. J Virol, 1998. 72 (2):第 1497-503頁；Deml，L，等，Multiple effects of codon usage optimization on expression andimmunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiencyvirus type IGag protein.J Virol,2001.75 (22):第 10991-1001 頁；Laddy，D.J.，等，Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines against avianinfluenza. Vaccine，2007. 25 (16):第 2984-9 頁；Frelin，L 等，Codon optimization andmRNA amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitisCvirus nonstructural 3/4A gene. Gene Therj 2004. 11 (6):第 522-33 頁]，以及質粒遞送系統中最近開發的技術，如電穿孔[Hirao，L. A.，等，Intradermal/subcutaneousimmunization by electroporation improves plasmid vaccine delivery and potencyin pigs and rhesus macaques. Vaccine，2008. 26 (3):第 440-8 頁;Luckay, A.等，Effectofplasmid DNA vaccine design and in vivo electroporation on the resultingvaccine-specific immune responses in rhesus macaques. J Virol，2007. 81 (10):第5257-69 頁；Ahlen，G.，等，In vivo electroporation enhances the immunogenicity ofhepatitis C virus nonstructural 3/4A DNA by increased local DNA uptake, proteinexpression, inflammation, and infiltration of CD3+T cells. J Immunol, 2007. 179(7):第4741-53頁]。另外，研究已表明使用共有免疫原(consensus immunogen)與單獨的天然抗原相比，能夠增強細胞免疫反應的寬度[Yan, J.等，Enhanced cellular immuneresponses elicited by an engineered HIV-Isubtype B consensus-based envelopeDNA vaccine. Mol Ther, 2007. 15 (2):第 411-21 頁；Rolland，M.等，Reconstructionand function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus typelproteins. J Virol, 2007. 81(16):第 8507-14 頁]。用于遞送核酸序列例如質粒DNA的一種方法是電穿孔(EP)技術。該技術已被用于人臨床試驗以遞送抗癌癥藥物，例如爭光霉素，和用于大量動物物種的許多臨床前研究。雖然疫苗對于預防性或治療性地免疫個體以對抗病原體感染或人類疾病通常是有效的，但是仍存對具有改善的疫苗的需求。需要產生增強的免疫反應的組合物和方法。同樣地，雖然一些免疫治療劑對于調節患者內的免疫反應是有用的，但仍存在對具有改善的免疫治療組合物和方法的需求。 發明概述本發明涉及包含選自由以下組成的組的核苷酸序列的核酸分子SEQ ID NO: USEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID N0:7、與 SEQ ID NO: 195% 同源的核酸序列、與 SEQ IDNO:395%同源的核酸序列、與SEQ ID NO:595%同源的核酸序列、與SEQ ID N0:795%同源的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: I的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQID NO:3的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 7的功能片段、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: I的功能片段95%同源的核酸序列、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 3的功能片段95%同源的核酸序列、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段95%同源的核酸序列和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO:7的功能片段95%同源的核酸序列。本發明還涉及組合物，所述組合物包含多個一種或多種核酸分子，其包含選自由以下組成的組的一種或多種核酸序列1)選自由下述序列組成的組SEQ ID NO: I、SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:7、與 SEQ ID NO: 195% 同源的核酸序列、與 SEQ ID NO:395%同源的核酸序列、與SEQ ID N0:595%同源的核酸序列、與SEQ ID NO:795%同源的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: I的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID N0:3的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQID NO: 7的功能片段、與包含至少60個核苷酸的SEQ IDN0:1的功能片段95%同源的核酸序列、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 3的功能片段95%同源的核酸序列、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段95%同源的核酸序列和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 7的功能片段95%同源的核酸序列；和b)編碼一種或多種免疫原的一種或多種另外的核酸序列。本發明另外涉及調節免疫反應的方法，所述方法包括向個體施用核酸分子或組合物的步驟，所述核酸分子包含選自由下述組成的組的核苷酸序列SEQ ID NO: U SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:7、與 SEQ ID NO: 195% 同源的核酸序列、與 SEQ ID NO:395%同源的核酸序列、與SEQ ID NO:595%同源的核酸序列、與SEQ ID NO:795%同源的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: I的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 3的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO:7的功能片段、與包含至少60個核苷酸的SEQ IDNO: I的功能片段95%同源的核酸序列、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 3的功能片段95%同源的核酸序列、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 5的功能片段95%同源的核酸序列和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 7的功能片段95%同源的核酸序列；所述組合物包含多個一種或多種核酸分子，其包含選自由以下組成的組的一種或多種核酸序列1)選自由下述組成的組SEQID NO: I、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、與 SEQ ID NO: 195% 同源的核酸序列、與SEQ ID NO:395%同源的核酸序列、與SEQ ID NO:595%同源的核酸序列、與SEQ ID NO:795%同源的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: I的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 7的功能片段、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: I的功能片段95%同源的核酸序列、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 3的功能片段95%同源的核酸序列、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 5的功能片段95%同源的核酸序列和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO:7的功能片段95%同源的核酸序列；和b)編碼一種或多種免疫原的一種或多種另外的核酸序列。
本發明進一步涉及包含選自由以下組成的組的核苷酸序列的重組病毒載體SEQID N0:USEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7、與SEQ ID NO: 195%同源的核酸序列、與SEQ ID NO:395%同源的核酸序列、與SEQ ID NO:595%同源的核酸序列、與SEQ IDNO:795%同源的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: I的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 7的功能片段、與包含至少60個核苷酸的SEQ IDNO: I的功能片段95%同源的核酸序列、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 3的功能片段95%同源的核酸序列、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 5的功能片段95%同源的核酸序列和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 7的功能片段95%同源的核酸序列。本發明還涉及調節個體內的免疫反應的方法，所述方法包括向所述個體施用重組病毒載體，所述重組病毒載體包含選自由以下組成的組的核苷酸序列SEQ ID N0:USEQ IDNO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:7、與 SEQ ID NO: 195% 同源的核酸序列、與 SEQ ID NO:395%同源的核酸序列、與SEQ ID NO:595%同源的核酸序列、與SEQ ID NO:795%同源的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: I的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID N0:3的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQID NO: 7的功能片段、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: I的功能片段95%同源的核酸序列、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID N0:3的功能片段95%同源的核酸序列、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 5的功能片段95%同源的核酸序列和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 7的功能片段95%同源的核酸序列。本發明另外涉及包含選自由以下組成的組的核苷酸序列的減活病原體SEQ IDN0:USEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:7、與SEQ ID NO: 195%同源的核酸序列、與SEQID NO:395%同源的核酸序列、與SEQ ID NO:595%同源的核酸序列、與SEQ ID N0:795%同源的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: I的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 7的功能片段、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: I的功能片段95%同源的核酸序列、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 3的功能片段95%同源的核酸序列、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 5的功能片段95%同源的核酸序列和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO:7的功能片段95%同源的核酸序列。本發明還涉及免疫個體以對抗病原體的方法，所述方法包括向所述個體施用減活病原體，所述減活病原體包含選自由以下組成的組的核苷酸序列SEQ ID NO: I、SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:7、與 SEQ ID NO: 195% 同源的核酸序列、與 SEQ ID NO:395%同源的核酸序列、與SEQ ID NO:595%同源的核酸序列、與SEQ ID NO:795%同源的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: I的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID N0:3的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQID NO: 7的功能片段、與包含至少60個核苷酸的SEQ IDN0:1的功能片段95%同源的核酸序列、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID N0:3的功能片段95%同源的核酸序列、與包含至少 60個核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段95%同源的核酸序列和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO:7的功能片段95%同源的核酸序列。附圖
簡述圖Ia-Ie示出表明在用EP進行DNA接種后強烈細胞免疫反應的誘導的數據。每次免疫后對SIVgag (白色帶)、env(灰色帶)和pol (黑色帶)的總反應顯示為疊加組平均反應土 SEM。使用杜克事后檢驗(Tukey post hoc test)和鄧尼特T3事后檢驗(DunnettT3post hoc)來分別測定第三和第四次免疫的組之間的差異顯著性。圖2a_2c示出DNA免疫后離體(ex_vivo)的增殖能力。將在第四次免疫后兩周分離的新鮮PBMC用CFSE染色并用SIVgag (白條帶)、env(灰色帶)和pol (黑色帶)肽活體外刺激5天以測定抗原特異性細胞的增殖能力。圖2a中，示出了代表性動物的點圖。總SIV增殖反應作為疊加組平均反應土 SEM對于⑶4+T細胞區室示于圖2b且對于⑶8+T細胞區室示于圖2c中。通過進行配對曼-惠特尼檢驗(pair-wise Mann-ffhitney test),用邦費羅尼(Bonferroni)校正來測定各組之間的統計學差異，p值〈0. 017為顯著。圖3a_3d示出免疫后SIVpoI反應的多功能圖譜。在第四次免疫后2周分離的PBMC在活體外用SIVpol肽庫混合物(peptide pool mix)刺激5小時。對細胞染色以分析細胞內IFNy、TNF a和IL-2的產生以及通過⑶107a的脫粒。圖3a示出對于細胞內細胞因子染色的代表性設門分析(gating analysis)。通過使用前向散射高度(FSC-H)和前向散射面積(FSC-A)來區分單態群體(singlet population)。隨后我們通過FSC-A使用側向散射面積(SSC-A)來分離淋巴細胞群體。活T細胞對于針對生存力、⑶14、⑶16和⑶19的Pacific Blue清除設門(dump gate)(包括鮮紫色染料(Violet Vivid Dye))鑒定為陰性染色，而對于⑶3為陽性染色。此后，在相對于IFN y的⑶8+和⑶4+事件上連續設門事件證明下調。在該實施例中示出為鑒定⑶8+T細胞的設門。第一⑶3+⑶8+T細胞通過陽性⑶8染色和陰性⑶4染色，以排除活化后可具有上調的⑶8的任何⑶4+T細胞來鑒定。⑶28和⑶95染色從分析中排除天然⑶8+T細胞。然后對于在我們的小組⑶107a、IL_2、IFNy和TNFa中四個功能中的每一個設門所得經歷抗原的CD8+T細胞。圖3a和3b中的條形圖描述了 15種功能組合中每一種的頻率。圖3b示出CD4+T細胞反應。圖3c示出CD8+T細胞反應。圓餅圖示出具有4種功能(紫色或黑灰色)、3種功能(黃色或淡灰)、2種功能(綠色或中等黑灰色)或I種功能(淺藍或灰色)的Sivpol特異性⑶4+T細胞的比例。疊加于圓餅圖上的數字表示SIVpol反應的總頻率。圖3d涉及IFN y +單功能⑶8+T細胞的記憶表型。IFNy +單功能(黑灰色)的點圖通過⑶95密度圖疊加于⑶28上以測定該群體的記憶表型。示出在DNA+12組中的來自代表性動物的染色。圖4a和4b示出多功能記憶T細胞群體的維持。在最后免疫(SIVmac251激發之日)后八個月分離的PBMC用SIVpol肽庫混合物活體外刺激5小時。對細胞染色以在細胞內產生IFN Y、TNFa和IL-2以及通過CD107a脫粒。圖4a和4b中的條形圖描述了 15種功能組合中每一種的頻率。圖4a示出⑶4+T細胞反應。圖4b示出⑶8+T細胞反應。圓餅圖示出具有4種功能(紫色或黑灰色)、3種功能(黃色或淡灰色)、2種功能(綠色或中等黑灰色)或I種功能(淺藍色或灰色)的SIVpol特異性⑶4+T細胞的比例。疊加于圓餅圖上的數字表示SIVpol反應累頻。 圖5a_5d示出來自SIVmac251粘膜激發的數據。圖5a示出在激發前、激發后第2周(峰)、第14周(設定點)和第35周(長期)時接種(或淡灰色)和未接種(籲或黑灰色)的動物之間的病毒載量的比較。圖5b示出通過組天然( 或黑灰色)、DNA ( 或灰色)、DNA+12( 或中等黑灰色)、DNA+RANTES( 或淡灰色)的激發前、峰、設定點和長期病毒載量的比較。圖5c示出曲線圖下的面積。示出組平均值。圖5d示出了在峰、設定點和長期感染期間的保護性I類等位基因、Mamu-B*03和Mamu_B*017 (藝或淡灰色)和非對照等位基因(■或黑灰色)動物之間的病毒載量的比較。進行雙尾T檢驗以測定對于圖5a和5d的組之間的差異的顯著性，并且在圖5b中使用具有雙尾鄧尼特事后檢驗(Dunnett posthoc test)的 ANOVA0圖6a_6e示出在SIVmac251粘膜激發后的⑶4+T細胞損耗。示出在激發后外周CD4+T細胞計數的變化。CD4+T細胞計數的相對變化描述為基線計數的百分比，和對于天然(■ )、DNA( ▲ ) ,DNA+12 (▼)和 DNA+RANTES( # )組示出組平均土SEM。激發后個別 CD4+T細胞損耗的時間過程。在各組中突出顯示具有與保護相關的單體型的動物。除了在具有Mamu-B^O17等位基因的DNA+12組中的4394之外全部具有Mamu_B*003等位基因。圖7a和7b示出免疫后CCR5+T細胞的誘導。在第三次免疫(S卩，用于誘導分子佐劑的最后一次免疫)后分離的冷凍保存的PBMC用SIVpol肽刺激，并通過由ICS動員的IFNy、TNF a、IL-2或⑶107a的產生來鑒定抗原特異性細胞。測定對于⑶8+T細胞區室(數據示于圖7a)和⑶4+T細胞區室(數據示于圖7b)的SIVpol特異性，CCR5+細胞的頻率。在總⑶8或⑶4群體中數據顯示為頻率。IFNy和TNF a結合到相同熒光基團上，以在該小組中適應另外的染色。詳細描述提供編碼人RANTES的核酸分子，其具有設計為在人細胞中產生高表達水平的核苷酸序列(SEQ ID NO: I)。由核苷酸序列編碼的RANTES的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 2中。核苷酸序列可以可操作地連接到在人細胞中表達所需的調控元件。可提供另外的元件和序列以進一步增強表達水平。包含SEQ ID NO: U SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:5或SEQ IDNO:7的質粒、病毒載體或細胞可施用于個體并在個體的細胞中表達，以將功能RANTES蛋白質遞送到個體。另外，可對用 SEQ ID NO: I、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5 或 SEQ ID NO:7 轉化的宿主細胞進行培養以產生RANTES蛋白質。
當作為免疫治療劑或疫苗的一部分遞送時，編碼RANTES及其功能片段的核酸分子調節免疫反應。因此，編碼RANTES及其功能片段的核酸分子可作為免疫治療劑和/或與疫苗組合或作為疫苗的組分遞送，所述疫苗組分還包括編碼需要免疫反應對抗的免疫原性革巴標的核酸分子。雖然不受科學理論束縛，但用于調節免疫反應的免疫治療劑可包含核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7。可用于激發對抗免疫原的增強的免疫反應的疫苗可包含下述中的一種或多種1)包含SEQ ID NOiUSEQIDNO:3,SEQ ID N0:5或SEQ ID NO:7和編碼靶標免疫原的核苷酸序列的核酸分子；2)包含SEQ ID N0:USEQ ID NO:3,SEQ ID N0:5或SEQ ID NO:7的第一核酸分子和包含編碼靶標免疫原的核苷酸序列的第二核酸分子。
可使用這樣的核酸分子來進行免疫治療和免疫方法。為了實現RANTES的高水平表達，可將免疫治療劑和疫苗制備為具有可操作地連接到SEQ ID NO: I、SEQ ID N0:3、SEQID N0:5或SEQ ID NO:7的調控元件。將編碼RANTES或其功能片段的核酸序列遞送到個體來調節個體內的免疫反應。當作為免疫治療劑遞送時，編碼RANTES或其功能片段的核酸序列調節個體內的免疫反應以緩解涉及免疫系統的各種疾病、病況和病癥的癥狀或病因。當作為疫苗的組分與編碼免疫原的核酸序列一起遞送到個體時增強對抗免疫原的免疫反應。當編碼RANTES或其功能片段的核酸分子施用于個體時，RANTES被細胞吸收并表達于細胞中，因此，將RANTES蛋白質遞送到個體。就疫苗而言，也施用編碼免疫原的核酸序列，其被細胞吸收和表達，由此產生免疫原性蛋白質。遞送蛋白質編碼序列的方法可包括遞送多個單核酸分子或多個多種不同的核酸分子。蛋白質的編碼序列可以是例如質粒的一部分、重組疫苗或減毒疫苗。提供對個體進行預防性和/或治療性免疫以對抗病原體或異常、疾病相關的細胞的組合物和方法。所述疫苗可以是諸如減活疫苗、重組疫苗或核酸或DNA疫苗的任何疫苗類型。通過遞送編碼免疫原和RANTES或其功能片段的核酸分子，可以調節由疫苗誘導的免疫反應。當經由可表達的核酸分子，例如作為質粒或者重組載體或減活病原體或細胞的一部分遞送時RANTES是特別有用的。當在未感染或無疾病個體內為了誘導保護性免疫反應而預防性遞送時，RANTES是特別有用的。編碼RANTES的核酸分子可在不含細胞的組合物中遞送。在一些實施方案中，可施用編碼RANTES的核酸分子而無任何其它細胞因子。使用標準技術和易于獲得的原料可以制備編碼RANTES蛋白質的核酸分子。提供用于遞送RANTES的組合物、使用所述組合物的方法，以及疫苗和免疫方法。所述組合物包含核酸分子，所述核酸分子包括可操作地連接到調控元件的編碼RANTES或其功能片段的核苷酸序列。當為疫苗的一部分時，所述組合物包括可操作地連接到調控元件的編碼免疫原的核苷酸序列。可將包含該組合物的可注射藥物組合物施用于個體。I.定義本文使用的術語僅為了描述特定實施方案，并非旨在限定。如說明書和所附權利要求書中使用的單數形式“一個”、“一種”和“該”除非上下文明確規定否則包括復數個指示物。對于本文數值范圍的引用，明確地包含具有相同精確度的介于其間的數。例如，對于6-9的范圍，除了 6和9之外，還包括數7和8，對于6. 0-7. 0的范圍，明確地包括數字6. 0、6. 1、6. 2、6. 3、6. 4、6. 5、6. 6、6. 7、6. 8、6. 9 和 7. 0。a.佐劑如本文使用的“佐劑”指添加到本文所述的DNA質粒疫苗以增強由下文所述DNA質粒和編碼核酸序列編碼的抗原的免疫原性的任何分子。b.抗體如本文使用的“抗體”指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE類抗體，或者其片段、片段或衍生物，包括Fab、F(ab’) 2、Fd和單鏈抗體、雙鏈體、雙特異性抗體、雙功能抗體及其衍生物。所述抗體可以是從哺乳動物的血清樣品分離的抗體、多克隆抗體、親和純化的抗體或對期望的表位或由其衍生的序列顯示足夠的結合特異性的這些抗體的混合物。c.編碼序列如本文使用的“編碼序列”或“編碼核酸”指包括編碼蛋白質的核苷酸序列的核酸 (RNA或DNA分子)。編碼序列可進一步包含可操作的連接到調節元件的起始信號和終止信號，包括能夠指導在施用所述核酸的個體或哺乳動物的細胞內表達的啟動子和多聚腺苷酸
化信號。d.互補如本文使用的“互補(complement) ”或“互補性(complementary) ”指核酸能夠在核酸分子的核苷酸或核苷酸類似物之間形成沃森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或胡斯坦(Hoogsteen)堿基配對。e.恒定電流如本文使用的“恒定電流”指在將電脈沖傳送到相同組織期間，由所述組織或界定所述組織的細胞所接受或經歷的電流。電脈沖由本文所述的電穿孔設備傳送。由于本文提供的電穿孔設備具有反饋元件，優選具有瞬時反饋，所以在電脈沖周期內該電流在所述組織內保持于恒定安培數。反饋元件可測量貫穿脈沖期間組織(或細胞)的電阻，并引起電穿孔設備改變其電能輸出(例如，增加電壓)因此貫穿電脈沖(大約幾微秒)和從脈沖至脈沖在相同組織內的電流保持恒定。在一些實施方案中，反饋元件包括控制器。f.電流反饋或反饋“電流反饋”或“反饋”可交換使用，并且是指提供的電穿孔設備的主動響應，其包括測量電極之間的組織內的電流和相應地改變由EP設備傳送的能量輸出以便保持電流于恒定水平。該恒定水平由使用者在引發脈沖序列或電處理之前進行預設。反饋可伴隨有電穿孔設備的電穿孔組件，例如控制器，因為其中的電路能夠連續地監控電極之間的組織內的電流和比較監控的電流(或組織內的電流)與預設的電流并連續地使能量輸出調節以保持監控的電流于預設水平。由于它是模擬閉環反饋，所以反饋回路可以是瞬間的。g.分散電流本文使用的“分散電流”指從本文所述的電穿孔設備的各種針電極陣列傳送的電流模式，其中所述模式最小化，或優選消除在待電穿孔的組織的任何區域上的電穿孔相關的熱應力的發生。h.電穿孔如本文可交換使用的“電穿孔”、“電透化”或“電動力增強”(“EP”)指使用橫跨膜電場脈沖來誘導生物膜中的微觀通路(孔)；它們的存在允許生物分子例如質粒、寡核苷酸、S iRNA、藥物、離子和水從細胞膜的一側通過到另一側。i.反饋機制如本文使用的“反饋機制”指通過軟件或者硬件(或固件)進行的處理，該處理接受并將所需組織(能量脈沖傳送之前、期間和/或之后)的阻抗與預定值，優選電流進行比較，并調節傳送的能量脈沖以達到預定值。可通過模似閉環電路進行反饋機制。j.功能片段如本文使用的“功能片段”對于SEQ ID NO: I是指以下核酸分子1)具有與小于全長SEQ ID NO: I的SEQ ID NO: I的一部分對應的核苷酸序列(即除其全長SEQ ID NO: I之夕卜)的核酸分子，和2)編碼具有RANTES活性(即當在人類中表達時，其作為當SEQ ID NO: I在人類中表達時產生的RANTES發揮作用)的多肽的核酸分子。功能片段的大小可以是90或以上、120或以上、150或以上、180或以上、210或以上或240或以上的長度。DNA片段可 小于10個核苷酸、小于20、小于30、小于40、小于50、小于60、小于75、小于90、小于120、小于150、小于180、小于210或小于240。為了本文公開的目的，期望本文所述的大小也構成大小的范圍例如DNA功能片段的大小可以是20-90、20-120、20-150、20-180、20-210、20-240、30-90、30-120、30-150、30-180、30-210、30-240、40-90、40-120、40-150、40-180、40-210、40-240、50-90、50-120、50-150、50-180、50-210、50-240、60-90、60-120、60-150、60-180、60-210、60-240、75-90、75-120、75-150、75-180、75-210、75-240、90-120、90-150、90-180、90-210、90-240、20-90、120-150、120-180、120-210、120-240、150-180、150-210、150-240、180-210、180-240 和 210-240 的長度。“功能片段”對于多肽序列指由作為非全長SEQ ID N0:2，即除SEQ ID N0:2之外的功能片段核酸分子編碼的多肽。多肽片段可以是30個或以上的氨基酸長度、35或以上、40或以上、45或以上、50或以上、55或以上、60或以上、65或以上、70或以上、75或以上、80或以上、85或以上或90或以上的長度。多肽片段可以小于10個氨基酸、小于15、小于20、小于25、小于30、小于35、小于40、小于45、小于50、小于55、小于60、小于65、小于70、小于75、小于80、小于85或小于90個氨基酸的長度。為了在本文公開的目的，期望本文所述的大小也構成大小的范圍，例如蛋白質功能片段的大小可以是30-35、30-40、30-45、30-50、30-55、30-60、30-65、30-70、30-75、30-80、30-85、30-90、35-40、35-45、35-50、35-55、35-60、35-65、35-70、35-75、35-80、35-85、35-90、40-45、40-50、40-55、40-60、40-65、40-70、40-75、40-80、40-85、40-90、45-50、45-55、45-60、45-65、45-70、45-75、45-80、45-85、45-90、50-55、50-60、50-65、50-70、50-75、50-80、50-85、50-90、55-60、55-65、55-70、55-75、55-80、55-85、55-90、60-65、60-70、60-75、60-80、60-85、60-90、65-70、65-75、65-80、65-85、65-90、70-75、70-80、70-85、70-90、75-80、75-85、75-90、80-85、85-90和85-90的長度。k.遺傳構建體如本文使用的術語“遺傳構建體”是指包含編碼蛋白質的核苷酸序列的DNA或RNA分子。編碼序列包括可操作地連接到調控元件的起始和終止信號，所述調控元件包括能夠指導在施用核酸分子的個體的細胞中表達的啟動子和多聚腺苷酸化信號。如本文使用的術語“可表達形式”是指包含可操作地連接到編碼蛋白質的編碼序列的必要調控元件的基因構建體，從而當存在于個體的細胞中時，將表達編碼序列。
I 同一如在本文的兩個或更多個核酸或多肽序列的上下文中使用的“同一”或“同一性”指所述序列具有在特定區域內相同的特定百分比的殘基。所述百分比可以通過下述來計算優化比對兩個序列、在特定區域比較兩個序列、測定同一殘基在兩個序列中出現的位置的數量以產生匹配位置的數量，用匹配位置的數量除以特定區域中位置的總數，和將結果乘以100以得到序列同一性的百分比。在兩個序列具有不同長度或比對產生一個或多個交錯末端以及比較的特定區域僅包括單序列的情況中，單序列殘基被包含于計算的分母而非分子中。當比較DNA和RNA時，可將胸腺嘧啶⑴和尿嘧啶⑶視為相當。同一性可以人工或通過使用電腦序列算法例如BLAST或BLAST2. 0來進行。m.阻抗當論述反饋機制時可以使用“阻抗”并且根據歐姆定律可以轉換為電流值，因此， 能夠與預定電流比較。n.免疫反應如本文使用的“免疫反應”指宿主免疫系統，如哺乳動物的免疫系統響應于抗原例如流行性感冒血凝素共有抗原而活化。免疫反應可以是細胞或體液反應的形式，或兩者。0.核酸如本文使用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”指共價連接到一起的至少兩個核苷酸。單鏈的描述也定義了互補鏈的序列。因此，核酸還包括所述單鏈的互補鏈。出于相同的目的可以將核酸的許多變體作為給定的核酸來使用。因此，核酸還包括基本上同一的核酸及其互補鏈。單鏈提供在嚴格雜交條件下能夠與靶標序列雜交的探針。因此，核酸還包括在嚴格雜交條件下雜交的探針。核酸可以是單鏈或雙鏈，或者可以包含雙鏈和單鏈序列兩者的一部分。核酸可以是DNA、基因組和cDNA兩者、RNA或雜化物，其中核酸可包含脫氧核糖和核糖核苷酸的組合，和包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶和異鳥嘌呤的堿基的組合。核酸可以通過化學合成法或通過重組法來獲得。p.可操作地連接如本文使用的“可操作地連接”指基因的表達在空間連接的啟動子的控制下。啟動子可位于在其控制下的基因的5’ (上游)或3’(下游)。啟動子和基因之間的距離可以與在啟動子從中衍生的基因中啟動子和其控制的基因之間的距離大致相同。如本領域已知的那樣，可以在不喪失啟動子功能的情況下調節該距離的變化。q.啟動子如本文使用的“啟動子”指能夠賦予、活化或增強核酸在細胞中的表達的合成或天然來源的分子。啟動子可以包含一個或多個具體的轉錄調節序列以進一步增強其表達和/或改變空間表達和/或時序表達。啟動子還可包含遠端增強子或阻遏子元件，其可位于距轉錄起始位點多達幾千個堿基對。啟動子可源自于包括病毒、細菌、真菌、植物、昆蟲和動物的來源。啟動子可根據其中發生表達的細胞、組織或器官或者根據發生表達的發育階段，或響應于外界刺激例如生理應激、病原體、金屬離子或誘導劑來調節基因組分的組成性，或差異性表達。啟動子的代表性實例包括噬菌體17啟動子、噬菌體T3啟動子、SP6啟動子、Iac操縱子-啟動子、tac啟動子、SV40晚期啟動子、SV40早期啟動子、RSV-LTR啟動子、CMV IE啟動子、SV40早期啟動子或SV40晚期啟動子和CMV IE啟動子。r.嚴格雜交條件如本文使用的“嚴格雜交條件”指使第一核酸序列(例如，探針)與第二核酸序列(例如，靶標)在例如核酸的復雜混合物中雜交的條件。嚴格條件是序列依賴的并且在不同的環境中將不同。嚴格條件對于特異性序列可選定為在規定的離子強度PH下低于熱解鏈溫度(Tm)約5-10°C。Tm可以是50%的與靶標互補的探針以平衡態雜交到靶標序列(因為靶標序列過量存在，在Tni處，平衡時50%的探針被占據)時的溫度(在規定的離子強度、pH和核酸濃度下)。嚴格條件可以是在pH7. 0至8. 3時鹽濃度小于約I. OM鈉離子，例如約0.01-1. OM鈉離子(或其它鹽)濃度和溫度對于短探針(例如，約10-50個核苷酸)為至少約30°C和對于長探針(例如，大于約50個核苷酸)為約60°C的條件。也可以通過添加去穩定劑例如甲酰胺來達到嚴格條件。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號可以是背景雜交的至少2至10倍。示例性嚴格雜交條件包括以下50%的甲酰胺、5 X SSC和1%SDS，在42°C下孵育，或5XSSC、1%SDS，在65°C下孵育，在65°C下在0. 2XSSC和0. 1%SDS中洗滌。
s.基本上互補如本文使用的“基本上互補”指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250 或更多個核苷酸或在 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85 或 90 或更多個氨基酸的區域內，第一序列與第二序列的互補鏈具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的同一性，或者是指兩種序列在嚴格雜交條件下雜交。t.基本上同一如本文使用的“基本上同一”指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250 或更多個核苷酸或在 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85 或 90 或更多個氨基酸的區域內，第一和第二序列具有至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98% 或 99% 的同一性，或者對于核酸，如果第一序列基本上互補于第二序列的互補鏈。u.變體如本文使用的“變體”對于核酸是指(i)引用的核苷酸序列的一部分或片段；(ii)引用的核苷酸序列的互補鏈或其部分；(iii)基本上相同于引用的核酸的核酸或其互補鏈；或(iv)在嚴格條件下與引用的核酸雜交的核酸，其互補鏈，或與其基本上同一的序列。“變體”對于肽或多肽是指通過插入、缺失或保守性置換氨基酸而使氨基酸序列不同，但保留至少一種生物活性的肽或多肽。變體還可以是指具有基本上與引用的蛋白質同一的氨基酸序列的蛋白質，所述引用的蛋白質具有保留至少一種生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性置換，即用性質相似(例如，親水性、帶電區域的程度和分布)的不同氨基酸來替代氨基酸在本領域內作為典型地涉及的微小變化是公知的。如本領域內所理解的那樣，可以通過考慮氨基酸的親水性指標來部分地鑒定這些微小變化。Kyte等，J. Mol.Biol. 157:105-132(1982)。氨基酸的親水性指標是基于其疏水性和電荷的考慮。本領域內己知可取代親水性指標相似的氨基酸而仍保留蛋白質功能。在一方面，取代具有±2的親水性指標的氨基酸。氨基酸的親水性還可用于揭示將導致蛋白質保留生物功能的置換。考慮到肽背景中的親水性氨基酸，允許計算最大的肽的局部平均親水性(local averagehydrophilicity),全部以引用方式并入本文的美國專利4，554，101已報道了有用的措施以使抗原性和免疫原性良好關聯。如本領域內所理解的那樣，具有相似親水性值的氨基酸的置換可導致肽保留生物活性，例如免疫原性。可用彼此的親水性值在±2內的氨基酸進行置換。氨基酸的親水性和親水性值兩者均受到氨基酸特殊側鏈的影響。與所述觀察一致，認識到與生物功能相容的氨基酸置換依賴于氨基酸，特別是這些氨基酸的側鏈的相對相似性,正如疏水性、親水性、電荷、大小及其它性質所揭示。V.載體如本文使用的“載體”指包含復制起點的核酸序列。所述載體可以是載體、噬菌體、細菌、人工染色體或酵母人工染色體。載體可以是DNA或RNA載體。載體可以是自我復制 染色體外載體，并優選為DNA質粒。2. RANTESRANTES由SEQ ID NO: I所編碼。所述序列可進一步包含一個或多個另外的氨基酸序列元件。例如由核酸序列編碼的RANTES可進一步在其N末端包含IgE或IgG前導氨基酸序列。IgE前導氨基酸序列可以是SEQ ID N0:3o同樣地，編碼IgE或IgG前導序列的編碼序列可以連接到編碼免疫原的編碼序列。優化SEQ ID NO: I以便高水平表達。核酸序列可在5’非翻譯區包含Kozak序列。核酸序列可進一步包含編碼前導序列的核酸序列。N末端前導序列的編碼序列為RANTES編碼序列的5’端。N末端前導區可有助于分泌。N末端前導區可以是IgE前導區或IgG前導區。SEQ ID N0:3與SEQ ID NO: I公開的一樣是RANTES編碼序列，進一步包含IgE編碼序列；前導序列連接到RANTES蛋白質的N末端。核酸序列可在5’非翻譯區包含Kozak序列。SEQ ID N0:5與SEQ IDN0:3公開的一樣是IgE前導RANTES編碼序列并在5’非翻譯區進一步包含Kozak序列。3.遺傳構建體和質粒本文提供的是可包含編碼RANTES或其功能片段的核酸序列的遺傳構建體。遺傳構建體可作為包含編碼RANTES或其功能片段的核酸的功能性染色體外分子存在于細胞中。包含編碼RANTES或其功能片段的核酸的遺傳構建體可以是含有著絲點、端粒(telomer)或質粒或粘粒的微型染色體。遺傳構建體還可以是重組病毒載體，包括重組腺病毒、重組腺病毒相關病毒和重組牛痘的基因組的一部分。遺傳構建體可以是細胞內存活的減活細菌或重組細菌載體中遺傳物質的一部分。遺傳構建體可包含用于RANTES或其功能片段的基因表達的調控元件。調控元件可以是啟動子、增強子、起始密碼子、終止密碼子或多聚腺苷酸化信號。組合物可以包含編碼RANTES或其功能片段的第一核酸序列，并可以進一步包含一個或多個另外的編碼一個或多個免疫原的核酸序列。第一和另外的核酸序列可存在于相同的核酸分子或不同的核酸分子上。第一和另外的核酸序列可受控于在在人細胞中起作用的調控元件。核酸序列構成可以是載體的遺傳構建體。載體能夠以有效引起個體內免疫反應的量在個體的細胞內表達RANTES或其功能片段。載體可以是重組的。載體可包含編碼RANTES或其功能片段的異質核酸。載體可以是質粒。所述載體可用于用編碼RANTES或其功能片段的核酸轉染細胞，在RANTES或其功能片段發生表達的條件下培養和保持轉化的宿主細胞。載體可包含編碼RANTES或其功能片段的異質核酸并可進一步包含可以在RANTES或其功能片段編碼序列上游的起始密碼子，和可以在RANTES或其功能片段編碼序列下游的終止密碼子。起始和終止密碼子可以與RANTES或其功能片段編碼序列在框(frame)內。載體還可包含可操作地連接到RANTES或其功能片段編碼序列的啟動子。可操作地連接到RANTES或其功能片段編碼序列的啟動子可以是來自猿猴病毒40(SV40)的啟動子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動子、人類免疫缺陷性病毒(HIV)啟動子例如牛免疫缺陷性病毒(BIV)長末端重復(LTR)啟動子、莫洛尼病毒啟動子、禽類白血病病毒(ALV)啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子例如CMV立即早期啟動子、EB病毒(EBV)啟動子或勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子。啟動子可還以是來自人類基因例如人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸 或人金屬硫蛋白的啟動子。啟動子還可以是組織特異性啟動子，例如肌肉或皮膚特異性啟動子，天然或合成的。該啟動子的實例描述于美國專利申請公布第US20040175727號，其內容全部并入本文。載體還可包含多聚腺苷酸化信號。其可以在RANTES或其功能片段編碼序列的下游。多聚腺苷酸化信號可以是SV40多聚腺苷酸化信號、LTR多聚腺苷酸化信號、牛生長激素(bGH)多聚腺苷酸化信號、人生長激素(hGH)多聚腺苷酸化信號或人￠-球蛋白多聚腺苷酸化信號。SV40多聚腺苷酸化信號可以是來自pCEP4載體(Invitrogen, San Diego SanDiego, CA)的多聚腺苷酸化信號。載體還可在RANTES或其功能片段編碼序列的上游包含增強子。增強子可以是DNA表達所必須的。增強子可以是人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸或病毒增強子例如來自CMV、HA、RSV或EBV之一。在美國專利第5，593，972號、第5，962，428號和W094/016737中描述了多聚核苷酸功能增強，其各自的內容以引用的方式整體并入。載體還可包含哺乳動物復制起點以便在細胞中使載體保持于染色體外并產生多個載體的拷貝。載體可以是來自Invitrogen (San Diego, CA)的pVAXl、pCEP4或pREP4,其可包含EB病毒復制起點和核抗原EBNA-I編碼區，其可產生高拷貝游離型復制而不整合。載體的主鏈可以是PAV0242。載體可以是復制缺陷性腺病毒型5 (Ad5)載體。載體還可包含可良好地適應于在向其施用載體的人細胞中的基因表達的調節序列。RANTES或其功能片段編碼序列允許宿主細胞中編碼序列更有效地轉錄。載體可以是通過常規技術和易于獲得的原料來產生蛋白質的表達載體或系統，包括Samtoook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Ed. , Cold Spring Harbor (1989),其以引用的方式全部并入。對于RANTES或其功能片段本文公開的遺傳構建體和元件還可設計為具有編碼除RANTES或其功能片段之外的免疫原的編碼序列，由此該構建體將與編碼RANTES或其功能片段的核酸序列一起提供誘導對抗免疫原的免疫反應的改善的疫苗。4.藥物組合物
本文提供的是根據本發明的藥物組合物，其包含約I納克至約IOmg的DNA。在一些實施方案中，根據本發明的藥物組合物包含來自下述I)之間和2)之間1)至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100 納克，或至少 1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895. 900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995 或1000 微克，或至少 I. 5,2,2. 5,3,3. 5,4,4. 5,5,5. 5,6,6. 5,7,7. 5、8、8. 5,9,9. 5 或 10 毫克或更多；2)高達且包括 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100，或高達且包括 1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895. 900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995、或 1000，或高達且包括 I. 5,2,2. 5,3,3. 5,4,4. 5,5,5. 5、6、6. 5、7、7. 5、8、8. 5、9、9. 5或10毫克。在一些實施方案中，根據本發明的藥物組合物包含約5納克至約10毫克的DNA。在一些實施方案中，根據本發明的藥物組合物包含約25納克至約5毫克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約50納克至約I毫克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約0. I至約500微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約I至約350微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約5至約250微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約10至約200微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約15至約150微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約20至約100微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約25至約75微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約30至約50微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約35至約40微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約100至約200微克DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約10微克至約100微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約20微克至約80微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約25微克至約60微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約30納克至約50微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約35納克至約45微克的DNA。在一些優選實施方案中，藥物組合物包含約0. I至約500毫克的DNA。在一些優選實施方案中，藥物組合物包含約I至約350微克的DNA。在一些優選實施方案中，藥物組合物包含約25至約250微克的DNA。在一些優選實施方案中，藥物組合物包含約100至約200微克的DNA。根據本發明的藥物組合物根據待使用的施用方式來配制。在藥物組合物為可注射藥物組合物的情況中，它們是無菌、無熱原和無微粒的。優選使用等滲制劑(isotonicformulation) 0通常，等滲壓性添加劑可包含氯化鈉、葡萄糖、甘露糖醇、山梨醇和乳糖。在一些情況下，優選等滲溶液例如磷酸鹽緩沖鹽水。穩定劑包括明膠和白蛋白。在一些實施方案中，向制劑中添加血管收縮劑。本文提供的是能夠調節人類免疫反應的免疫治療劑。免疫治療劑可包含上述遺傳構建體，所述遺傳構建體包含SEQ ID NO: I、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7或其功能片段。本文提供的是能夠在人類中產生對抗一種或多種免疫原的免疫反應的疫苗。所述 疫苗可包含上述遺傳構建體，所述遺傳構建體包含與上述含有編碼免疫原的核酸序列的遺傳構建體組合的SEQ ID NO: I、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7或其功能片段。編碼RANTES或其片段的遺傳構建體可以在與包含編碼免疫原的核酸序列相同或不同核酸分子上。免疫治療劑或疫苗可以是質粒DNA組合物。所述質粒DNA組合物可包含多種相同或不同質粒，所述質粒含有一種或多種遺傳構建體。質粒DNA組合物可包含編碼RANTES或其功能片段的核酸序列。當其為疫苗時，其可在相同或不同質粒上進一步包含編碼免疫原的核酸序列。可用于產生用作免疫治療劑或疫苗的DNA質粒組合物的DNA疫苗技術公開于美國專利號 5，593，972,5, 739，118,5, 817，637,5, 830，876,5, 962，428,5, 981，505,5, 580，859、5，703, 055和5，676，594，其以引用的方式全部并入本文。DNA疫苗可進一步包含抑制其整合到染色體的元件或試劑。也可產生包含上述遺傳構建體的重組病毒載體。重組病毒載體還可包含SEQ IDNO: 1、SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7或其功能片段，具有或不具有包含編碼免疫原的核酸序列的遺傳構建體。可將SEQ ID N0:USEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7或其功能片段并入減毒疫苗，例如減毒活疫苗、滅活疫苗和使用重組載體遞送外源基因的疫苗。減毒活疫苗、使用重組載體遞送外源基因的那些、亞單位疫苗和糖蛋白疫苗的實例描述于美國專利號4, 510，245,4, 797，368,4, 722，848,4, 790，987,4, 920，209,5, 017，487、5，077，044、5，110，587、5，112，749、5，174，993、5，223，424、5，225，336、5，240，703、5，242，829,5,294，441,5,294，548,5, 310，668,5, 387，744,5, 389，368,5, 424，065、5，451，499,5, 453，364,5, 462，734,5, 470，734,5, 474，935,5, 482，713,5, 591，439、5，643，579,5, 650，309,5, 698，202,5, 955，088,6, 034，298,6, 042，836,6, 156，319 和6，589，529，其各自以引用的方式并入本文。疫苗可進一步包含藥學上可接受的賦形劑。藥學上可接受的賦形劑可以是諸如媒介物、佐劑、載體或稀釋劑的功能分子。藥學上可接受的賦形劑可以是轉染促進劑，其可包含表面活性劑，例如免疫刺激復合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐劑(Freund’ s incompleteadjuvant)，LPS類似物，包括單磷酰脂質A，胞壁酰肽，醌類似物，囊泡例如角鯊烯和角鯊烯，透明質酸，脂質，脂質體，鈣離子，病毒蛋白質，聚陰離子，聚陽離子或納米粒子，或其它已知轉染促進劑。轉染促進劑為聚陰離子，聚陽離子，包括聚L谷氨酸(LGS)或脂質。轉染促進劑為聚L谷氨酸，并更優選聚L谷氨酸以小于6mg/ml的濃度存在于疫苗中。轉染促進劑還可包含表面活性劑例如免疫刺激復合物(ISCOMS)，弗氏不完全佐劑，LPS類似物包含單磷酰脂質A，胞壁酰肽，醌類似物和囊泡例如角鯊烯和角鯊烯，并且也可將透明質酸與遺傳構建體一同施用。在一些實施方案中，DNA質粒組合物還可包含轉染促進劑例如脂質，脂質體，包括作為DNA-脂質體混合物的卵磷脂脂質體或本領域已知的其它脂質體(參見例如W09324640)，鈣離子，病毒蛋白質，聚陰離子，聚陽離子，或納米粒子，或其它已知的轉染促進齊U。優選地，轉染促進劑為聚陰離子，聚陽離子，包括聚L谷氨酸(LGS)，或脂質。疫苗中轉染劑的濃度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于lmg/ml、小于0. 750mg/ml、小于0. 500mg/ml、小于 0. 250mg/ml、小于 0. 100mg/ml、小于 0. 050mg/ml 或小于 0. 010mg/ml。
藥學上可接受的賦形劑可以是佐劑。佐劑可以是在任選的質粒中表達的其它基因或者是作為與上述質粒組合的蛋白質遞送。佐劑可選自由下述組成的組a -干擾素(IFN- a )、3 -干擾素(IFN- ￠), Y-干擾素、血小板衍生生長因子(PDGF)、TNF a、TNF ^、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、皮膚T細胞虜獲趨化因子(CTACK)、上皮胸腺表達趨化因子(TECK)、粘膜相關的上皮趨化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、⑶80、⑶86，包括具有缺失信號序列并任選的包含來自IgE信號肽的IL-15。佐劑可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK,TECK、血小板衍生生長因子(PDGF)、TNFa、TNF^、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、IL-UIL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18 或其組合。可以是有用佐劑的其它基因包括編碼下述的那些MCP_1、MIP-la、MIP-lp、IL_8、L-選擇蛋白、p-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-I、MadCAM-I、LFA-1、VLA-1、Mac-I、pl50. 95、PECAM、ICAM-U I CAM-2, I CAM-3, CD2、LFA-3、M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18 的突變形式、⑶40、⑶40L、血管生長因子、成纖維細胞生長因子、IL-7、神經生長因子、血管內皮細胞生長因子、Fas、TNF 受體、Fit、Apo_l、p55、WSL-U DR3、TRAMP、Apo_3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、CaspaselCE、Fos、c-jun、Sp-I、Ap-I、Ap_2、p38、p65、Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、失活 NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干擾素應答基因、NFkB,Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、0x40、0x40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB, NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPU TAP2 及其功能片段。質粒組合物可進一步包含如1994年4年I日提交的美國申請序列號021，579中所述的基因疫苗促進劑，其以引用的方式全部并入。5.遞送方法本文提供遞送藥物制劑的方法，以便提供編碼RANTES或其片段的遺傳構建體，該遺傳構建體具有或不具有包含編碼期望免疫反應對抗的免疫原的序列的遺傳構建體。可以提供遞送藥物制劑的方法以調節個體的免疫系統或誘導對抗特異性免疫原的治療性和/或預防性免疫反應。可以以美國專利第4，945，050號和第5，036，006號中所述的形式遞送組合物，兩者以引用的方式全部并入。a.施用途經
可以通過不同的途徑來施用組合物，包括口服、胃腸外、舌下、經皮、直腸、經粘膜、局部、經吸入、經口腔施用、胸膜內、靜脈內、動脈內、腹內、皮下、肌內、鼻內、鞘內和關節內或其組合。可通過傳統注射器、無針注射設備、“微粒轟擊基因槍”或其它物理方法例如電穿孔(“EP”)、“流體動力學方法”，或超聲。組合物的載體可以通過若干眾所周知的技術來遞送到哺乳動物，所述技術包括DNA注射(也稱為DNA接種)、該DNA注射帶有或沒有活體內電穿孔、脂質體介導、納米粒子促進、重組載體例如重組腺病毒、重組腺病毒相關病毒和重組牛痘。b.電穿孔經由疫苗質粒的電穿孔的DNA施用可以使用電穿孔設備來實現，所述電穿孔設備可配置為向期望的哺乳動物組織遞送有效地在細胞膜中引起可逆孔形成的能量脈沖，并且優選能量脈沖為類似于由使用者輸入的預定電流的恒定電流。電穿孔設備可包含電穿孔組件和電極部件(electrode assembly)或處理部件(handle assembly)。電穿孔組件可 包括和并入電穿孔設備的各種元件中的一個或多個，所述元件包括整流器、電流波形產生器、阻抗測試器、波形測井、輸入元件、狀態報告元件、通信端口、存儲組件、電源和電源開關。可使用活體內電穿孔設備，例如CELLECTRA EP系統(VGXPharmaceuticals，BlueBell, PA)或Elgen電穿孔器(Genetronics, San Diego, CA)來實現電穿孔以促進經由質粒的轉染。電穿孔組件可起電穿孔設備的一個元件的作用，并且其它元件是與電穿孔組件通信的單獨元件(或組件)。電穿孔組件可起電穿孔設備的超過一個元件的作用，其仍可與從電穿孔組件分離的電穿孔設備的其它元件通信。作為電機或機械設備的一部分的電穿孔設備的元件可不局限于可起一種設備的作用的元件或與另外的設備通信的單獨元件。電穿孔組件在期望的組織中能夠傳遞產生恒定電流的能量脈沖，并且包括反饋機制。電極部件可包括具有多個空間排列的電極陣列，其中電極部件從電穿孔組件接收能量脈沖并通過電極將其傳遞到期望的組織。多個電極中的至少之一在能量脈沖的傳遞期間為中性(neutral)，并在期望的組織中測量阻抗和將阻抗傳達到電穿孔組件。反饋機制可接收測量的阻抗并可調節由電穿孔組件傳遞的能量脈沖以保持恒定電流。多個電極可以以分散模式傳遞能量脈沖。多個電極可以以通過在程序(programmed sequence)下的電極控制的分散模式傳遞能量脈沖，并且所述程序由使用者輸入到電穿孔組件。所述程序可包含多個依次傳遞的脈沖，其中多個脈沖中的各脈沖由具有測量阻抗的一個中性電極的至少兩個作用電極(active electrode)來傳遞,且其中多個脈沖中隨后的脈沖由與具有測量阻抗的中性電極的至少兩個作用電極不同的電極來傳遞。反饋機制可通過或者硬件或者軟件來進行。反饋機制可通過模擬閉環電路來進行。每50ii s、20ii s、IOii s或I ii s發生反饋,但優選實時或瞬時反饋(即，基本上由測定響應時間的可獲得的技術測定的同時)。中性電極可測量期望組織中的阻抗并將阻抗傳達到反饋機制，并且反饋機制應答于阻抗和調節能量脈沖以使恒定電流保持于類似預定電流的值。反饋機制在能量脈沖傳送期間可連續地和瞬時地保持恒定電流。可促進本發明的DNA疫苗遞送的電穿孔設備和電穿孔方法的實例包括在Draghia-Akli等的美國專利第7，245，963號、Smith等提交的美國專利公布2005/0052630中所述的那些，其內容據此以引用的方式整體并入。可用于促進DNA疫苗遞送的其它電穿孔設備和電穿孔方法包括提供于2007年10月17日提交的共同待決和共同擁有的美國專利申請序列第11/874072號中的那些，其根據35USC 119(e)要求2006年10月17日提交的美國臨時申請序列號60/852，149和2007年10月10日提交的60/978，982的權益，其所有內容據此整體并入。Draghia-Akli等的美國專利第7，245，963號描述了標準電極系統及其在用于促進生物分子導入體內或植物選定組織的細胞中的用途。標準電極系統可包含多個針電極；皮下針；提供從可編程恒定電流脈沖整流器向多個針電極的導電性連接的電插頭；和電源。操作員可握住固定在承載結構上的多個針電極并牢固地將其插入到體內或植物的選定組織。然后生物分子經由皮下針遞送到選定的組織。激活可編程恒定電流脈沖整流器并將恒定電流電脈沖施加到多個針電極。施加的恒定電流電脈沖促進生物分了導入到多個電極之間的細胞。美國專利第7，245，963號的全部內容據此以引用的方式整體并入。由Smith等提交的美國專利公布2005/0052630描述可用于有效地促進生物分子導入體內或植物的選定組織的細胞的電穿孔設備。所述電穿孔設備包含由軟件或固件規定其操作的電動設備(“EKD設備”)。EKD設備基于使用者控制和脈沖參數的輸入在陣列的電 極之間產生一系列可編程恒定電流脈沖模式，并允許存儲和獲得電流波形數據。電穿孔設備還包括具有針電極陣列的可更換的電極盤、注射針用中心注射通道和可移動導向盤。將美國專利公布2005/0052630的全部內容據此以引用的方式整體并入。美國專利第7，245，963號和美國專利公布2005/0052630中所述的電極陣列和方法不僅可適合于深穿透到組織例如肌肉，而且可適合于深穿透到其它組織或器官。由于電極陣列的構造，注射針(用于遞送所選生物分子)也完全插入到靶標器官，并在由電極所預描繪的區域，垂直于所述靶點進行注射。美國專利第7，245，963號和美國專利公開2005/005263中所述的電極優選為20mm長和21gauge。另外，在一些實施方案中包括了并入的電穿孔設備及其用途，電穿孔設備有下述專利中所述的那些1993年12月28日公布的美國專利5，273，525、2000年8月29日公布的美國專利6，110, 161,2001年7月17日公布的6，261，281和2005年10月25日公布的6，958，060以及2005年9月6日公布的美國專利6，939，862。另外，涵蓋主題的專利提供于2004年2月24日公布的美國專利6，697，669，其涉及使用多種設備中的任一種遞送DNA，和2008年2月5日公布的美國專利7，328，064描繪了本文包括的注射DNA的方法。將上述專利以其整體引用的方式并入。c.質粒的制備方法本文提供的是包含本文所述SEQ ID NO: I的DNA質粒的制備方法。DNA質粒(在最后亞克隆步驟后進入哺乳動物表達質粒)可用于使用本領域內的已知方法在大型發酵罐中接種細胞培養物。雖然供本發明的EP設備使用的DNA質粒可使用已知設備和技術的組合來配制或制造，但優選使用許可的、2007年3月23日提交的共同待決的美國臨時申請美國序列號60/939, 792中所述的優化的質粒制造技術來制造它們。在一些實施例中，在這些研究中使用的DNA質粒可以以大于或等于lOmg/mL的濃度來配制。制造技術還包括或并入各種設備和規程，這些設備和規程對本領域內的普通技術人員為常規已知的，除了美國序列號60/939792所述的那些之外，包括2007年7月3日公布的許可專利美國專利第7，238，522號中所述的那些。將上述引用的申請和專利、美國序列號60/939，792和美國專利第7，238，522號據此以其整體分別并入本文。6.免疫原本發明可用于免疫個體以對抗病原體例如病毒、原核生物和致病性真核生物例如單細胞致病生物和多細胞寄生蟲。本發明特別用于免疫個體以對抗感染細胞和無莢膜的那些病原體例如病毒和原核生物例如淋病菌、李斯特菌屬和志賀氏菌屬。另外，本發明還用于免疫個體以對抗原生動物病原體，所述原生動物病原體包括它們為胞內病原體的生命周期階段。表I提供可以制備根據本發明的疫苗的某些病毒科和屬的列表。包含編碼肽的DNA序列的DNA構建體用于疫苗，所述肽至少包含等同于或基本上類似于在病原體抗原例如表中所列的那些抗原上顯示的表位的表位。另外，本發明還用于免疫個體以對抗其它病原體，包括原核和真核原生動物病原體以及多細胞寄生蟲例如表2所示的那些。表I-病毒 小核糖核酸病毒科屬鼻病毒(醫學)是普通感冒病例-50%的病因。腸病毒(Etheroviruses):(醫學)包括小兒麻痹癥病毒、柯薩奇病毒、埃可病毒和人類腸病毒例如甲型肝炎病毒。口瘡病毒(Apthoviruses):(獸醫)它們是口蹄疫病毒。靶抗原VP1、VP2、VP3、VP4、VPG杯狀病毒(Calcivirus)科屬病毒的諾瓦克(Norwalk)組(醫學)這些病毒為流行性胃腸炎重要的病原體。外衣病毒(Togavirus)科屬甲病毒(Alphaviruses):(醫學和獸醫)實例包括辛德比斯病毒(Sindbisvirus)、羅斯河病毒(RossRiver virus)和委內瑞拉東西馬腦炎病毒(Venezuelan EasternWestern Equine encephalitis)。呼腸孤病毒(Revirus)(醫學)風疫病毒。黃病毒(Flariviridae)科實例包括(醫學)登革熱、黃熱病、日本腦炎、圣路易斯腦炎和蜱傳腦炎病毒。西尼羅河病毒(Genbank NC001563、AF533540、AF404757、AF404756、AF404755、AF404754、AF404753、AF481864、M12294、AF317203、AF196835、AF260969、AF260968、AF260967、AF206518 和 AF202541)代表性靶抗原E NS5C丙型肝炎病毒(醫學)這些病毒并不歸入同一科，但認為是外衣病毒或黃病毒之一。與外衣病毒科最相似。冠狀病毒科(醫學和獸醫)傳染性支氣管炎病毒(禽)豬傳染性胃腸炎病毒(豬)
豬血球凝集腦脊髓炎病毒(豬)貓傳染性腹膜炎病毒(貓)貓腸道冠狀病毒(貓)狗冠狀病毒(狗)SARS相關的冠狀病毒人呼吸道冠狀病毒導致約40%的普通感冒病例。EX. 224E、0C43Note冠狀病毒可導致非A、B或C肝炎。靶抗原E1_也稱為M或基質蛋白質E2-也稱為S或刺突蛋白-也稱為BE或血凝素-elterose糖蛋白(在全部冠狀病毒中不存在)N_核衣殼
棒狀病毒科屬水泡性病毒、狂犬病病毒(醫學和獸醫)狂犬病靶抗原G蛋白、N蛋白纖絲病毒科(醫學)出血熱病毒例如馬伯格和埃博拉病毒副粘病毒科屬副粘病毒(醫學和獸醫)腮腺炎病毒、新城疫病毒(雞中的重要病原體)麻疹病毒(醫學和獸醫)麻疹、犬熱病肺炎病毒(醫學和獸醫)呼吸道合胞體病毒正粘病毒科(醫學)流感病毒布尼亞病毒(Bunyavirus)科屬布尼亞病毒(醫學)加利福尼亞腦炎、拉 克羅斯病毒(La Crosse)白嶺病毒(Phlebovirus):(醫學)里夫特裂谷熱(RiftValley Fever)漢坦病毒撲熱嗎拉(Puremala)為hemahagin 熱病毒(hemahagin fever virus)奈恩病毒(Nairvirus)(獸醫)奈洛比羊病(Nairobisheep disease)還有許多未命名的布尼亞病毒(bungaviruses)砂粒病毒科(醫學)LCM、拉沙熱病毒(Lassa fever virus)呼腸孤病毒科屬呼腸孤病毒潛在的人類病原體輪狀病毒兒童急性胃腸炎環狀病毒(醫學和獸醫)科羅拉多蝶熱(Colorado Tick fever),萊邦博病毒(Lebombo)(人)馬器質性腦病、藍舌病逆轉錄病毒科亞科Oncorivirinal :(獸醫)(醫學)貓白血病毒、HTLVI 和 HTLVII慢病毒(Lentivirinal)(醫學和獸醫)HIV、貓免疫缺陷性病毒、馬感染、貧血病毒Spumavirinal乳多泡病毒科亞科多瘤病毒(醫學)BKU和J⑶病毒亞科乳頭瘤病毒(醫學)許多病毒類型與癌癥或乳突淋瘤的惡化發展相關。腺病毒(醫學)EX AD7、ARD. , 0. B.-導致呼吸道疾病-某些腺病毒例如275導致腸炎細小病毒科(獸醫) 貓細小病毒引起貓腸炎貓傳染性粒細胞缺乏病毒(Feline panleucopeniavirus)犬細小病毒豬細小病毒皰疹病毒科亞科a皰疹病毒科屬單純皰疹病毒(醫學)HSVI(Genbank X14112、NC001806)，HSVII(NC001798)水痘帶狀皰疫(Varicella zoster):(醫學獸醫)假性狂犬病水痘帶狀皰疹亞科^皰疹病毒科屬巨細胞病毒(醫學)HCMV鼠巨細胞病毒亞科Y皰疹病毒科屬淋巴隱病毒(醫學)EBV_(伯基利淋巴瘤(Burkitt，slymphoma))天花病毒科亞科脊椎動物痘病毒亞科(Chordopoxviridae)(醫學-獸醫)屬天花(痘瘡)痘疹(牛痘)副痘病毒(Parapoxivirus)-獸醫
禽痘病毒(Auipoxvirus)-獸醫山羊痘病毒(Capripoxvirus)野兔痘病毒(Leporipoxvirus)豬痘病毒(Suipoxvirus)亞科Entemopoxviridue嗜肝DNA病毒科乙型肝炎病毒
未分類的丁型肝炎病毒^ 2細菌性病原體致病性革蘭陽性球菌包括肺炎球菌、葡萄球菌和鏈球菌。致病性革蘭陰性球菌包括腦膜炎球菌和淋球菌。致病性腸道革蘭桿菌包括腸桿菌科；假單胞菌、正不動桿菌(acinetobacteria)和埃肯菌(eikenella)，類鼻疽；沙門氏菌；志賀氏菌病；嗜血桿菌；軟下疳；普魯斯病(brucellosis);兔熱病；耶爾森氏菌(巴斯德菌)；念珠狀鏈桿菌和螺旋菌；單核細胞增生利斯特氏菌；紅斑丹毒絲菌；白喉、霍亂、炭疽熱；杜諾凡病(donovanosis)(性病性肉芽腫)；和卡里翁氏病(bartonellosis)。致病性厭氧菌包括破傷風；肉毒桿菌(botulism);其它梭菌；結核病；及其它分枝桿菌。致病性螺旋體病包括梅毒；_密螺旋體病；雅司病(yaws)，品他病(pinta)和哈爾斯坦氏病(endemic syphilis);和鉤端螺旋體病。由高級病原體細菌和致病真菌引起的其它的感染包括放線菌病；奴卡氏菌病；隱球菌病；釀母病；達林氏病和球霉菌病；假絲酵母病、曲霉病和毛真菌病；孢子絲菌病；副球抱子菌病(paracoccidiodomycosis)、波氏霉菌病(petriellidiosis)、球擬酵母病(torulopsosis)、巴里格爾氏病(mycetoma)和著色真菌病(chromomycosis);和皮膚真菌病。立克次氏體感染包括立克次氏體屬微生物(rickettsial)和立克次體病(rickettsioses)。支原體和衣原體感染的實例包括支原體肺炎(mycoplasma pneumoniae);性病性淋巴肉芽腫；鸚鵡熱；和圍產期衣原體感染。致病性真核生物致病性原生動物和蠕蟲以及由此的感染包括阿米巴病；瘧疾；利什曼原蟲病；嗜眠病；弓形體病；肺炎肺囊蟲(pneumocystis carinii);巴貝蟲病；慢性痢疾；旋毛蟲病；絲蟲病；血吸蟲病；線蟲；蛭(trematodes)或吸蟲(flukes);絳蟲(cestode)(帶蟲(tapeworm))感染。本發明的另一方面提供賦予對抗特征為過度增殖性疾病的過度增殖細胞的保護性免疫反應的方法，和提供治療患有過度增殖性疾病的個體的方法。過度增殖性疾病的實例包括所有形式的癌癥和牛皮癬。
已發現含有編碼免疫原性“過度增殖細胞”相關蛋白質的核苷酸序列的遺傳構建體導入個體細胞導致接種的個體細胞中產生那些蛋白質。為了免疫以對抗過度增殖性疾病，向個體施用包含編碼與過度增殖性疾病相關的蛋白質的核苷酸序列的遺傳構建體。為了使過度增殖性相關的蛋白質成為有效的免疫原性靶標，其必須為與正常細胞相比在過度增殖性細胞中專一性產生或處于更高水平的蛋白質。靶抗原包括此類蛋白質、其片段和肽；其至少包含在該蛋白質上發現的表位。在一些情況下，過度增殖性相關的蛋白質為編碼蛋白質的基因突變體的產物。突變基因編碼除了具有導致在正常蛋白質上未發現的稍有不同的氨基酸序列以外，幾乎等同于正常蛋白質的蛋白質。該靶蛋白包括由致癌基因例如myb、myc、fyn和易位基因bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk和EGRF編碼的蛋白質的那些。除了致癌基因產物作為靶抗原之外，用于抗癌治療和預防性方案的靶蛋白包括通過B細胞淋巴瘤制備的抗體的可變區和T細胞淋巴瘤的T細胞受體的可變區，其在一些實施方案中也用作自身免疫病的靶抗原。可以使用其它腫瘤相關的蛋白質作為靶蛋白例如在腫瘤細胞中以高水平存在的蛋白質，包括由單克隆抗體17-IA識別的蛋白質和葉酸結合蛋白或PSA。
雖然本發明可用于免疫個體以對抗若干癌癥形式中的一種或多種，但本發明特別地用于預防性免疫傾向于發展特定癌癥或具有癌癥并因此易于復發的個體。遺傳學和工藝學以及流行病學中的發展允許測定個體中癌癥發展的概率和風險評估。利用遺傳篩查和/或家族健康史，可以預測特定個體具有的發展為若干類型癌癥中任何一種的概率。類似地，具有已發展的癌癥的和已治療以除去癌癥的或以其它形式處于緩解中的那些個體特別易于復發和再發。作為治療方案的一部分，可免疫該個體以對抗已診斷為具有它們的癌癥以便對抗再發。因此，一旦已知個體已具有一種類型的癌癥并處于復發的風險，則可以對其進行免疫以使其免疫系統準備對抗任何將來出現的癌癥。本發明提供治療患有過度增殖性疾病的個體的方法。在此類方法中，遺傳構建體的導入用作免疫治療劑，指導和促進個體免疫系統以對抗產生靶蛋白的過度增殖性細胞。在治療或預防癌癥時，沒有細胞的實施方案是特別有用的。本發明提供通過賦予廣基型保護性免疫反應以對抗與自身免疫力相關的靶標(包括細胞受體和產生自導抗體(self-directed antibodies)的細胞來)治療患有自身免疫病和紊亂的個體的方法。T細胞介導的自身免疫病包括類風濕性關節炎(RA)、多發性硬化(MS)、舍格倫綜合征(Sjogren’s syndrome)、肉狀瘤病、胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、自身免疫甲狀腺炎、反應性關節炎、強直性脊柱炎、硬皮癥、多肌炎、皮膚肌炎、牛皮癬、脈管炎、韋格納氏肉芽腫病(Wegener’s granulomatosis)、克羅恩氏疾病(Crohn’s disease)和潰瘍性結腸炎。這些疾病中的每一種的特征在于結合到內源性抗原的T細胞受體和引發與自身免疫病相關的炎性級聯。針對T細胞可變區的接種將引起免疫反應包括CTL以消除那些T細胞。在RA中，若干參與疾病的特異性T細胞受體的可變區(TCR)已被表征。這些TCR包括V. m ￠.-14,20V. 0.-17和￥&-17。因此，用編碼這些蛋白質的至少一種的DNA構建體接種將引起將靶向參與RA的T細胞的免疫反應。參見，Howell, M. D等，1991Proc. Nat.Acad. Sci. USA 88:10921-10925;Piliard, X 等，1991Science 253:325-329; Williams, W.V等，1992J Clin. Invest. 90:326-333 ;其各自以引用的方式并入本文。在MS中，若干參與疾病的TCR的特異性可變區已被表征。這些TCR包括VfP和Va-IO。因此，用編碼這些蛋白質的至少一種的DNA構建體接種將引起將靶向參與MS的T細胞的免疫反應。參見ffucherpfennig, K. W 等，1990Science 248:1016-1019 ；Oksenberg, J. R 等，1990Nature345:344-346 ;其各自以引用的方式并入本文。在硬皮癥中，若干參與疾病的TCR的特異性可變區已被表征。這些TCR包括V. m HV. 0.-14和￥&-16、￥&-3(、￥&-7、￥&-14、￥&-15、￥&-16、￥&-28和￥&-12。因此，用編碼這些蛋白質的至少一種的DNA構建體接種將引起將靶向參與硬皮癥的T細胞的免疫反應。為了治療患有T細胞介導的自身免疫病的患者，特別是TCR可變區還沒有表征的那些，可以進行滑膜活檢。可以采用現存的T細胞樣品和使用標準技術來鑒定那些TCR的可變區。使用該信息可以制備基因疫苗。
B細胞介導的自身免疫病包括狼瘡(SLE)、格雷夫癥(Grave’s disease)、重癥肌無力、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫血小板缺乏、哮喘、冷球蛋白血癥、原發性膽汁性肝硬化和惡性貧血。這些疾病的每一種的特征在于結合到內源性抗原的抗體和引發與自身免疫病相關的炎性級聯。針對抗體的可變區的接種將引起免疫反應包括CTL以消除產生抗體的那些B細胞。為了治療患有B細胞介導的自身免疫病的患者，必須鑒定參與自身免疫活性的抗體的可變區。可以進行活組織檢查和可以采用現存于炎癥位點的抗體樣品。那些抗體的可變區可使用標準技術來鑒定。使用該信息可制備基因疫苗。就SLE而言，認為一種抗原是DNA。因此，在待免疫以對抗SLE的患者中，可針對抗DNA抗體篩選它們的血清，并可以制備包括編碼血清中發現的該抗DNA抗體的可變區的DNA構建體的疫苗。TCR和抗體兩者的可變區中的共同結構特征是眾所周知的。編碼特定TCR或抗體的DNA序列通常可按照眾所周知的方法例如Kabat等于1987年Sequence of Proteins ofImmunological Interest U. S. Department of Health and Human Services, Bethesda Md所述的那些方法找到，該文獻以引用的方式并入本文。另外，對于克隆來自抗體的功能可變區的一般方法可見于 Chaudhary, V. K 等，1990Proc. Natl. Acad Sci. USA 87:1066，其以引用的方式并入本文。除了使用免疫調節蛋白編碼序列的可表達形式以改善基因疫苗以外，本發明還涉及使用重組載體以遞送編碼抗原的外源基因的改善的減毒活疫苗和改善的疫苗。減毒活疫苗和使用重組載體以遞送外源抗原的那些的實例描述于美國專利號4，722，848、5，017，487、5，077，044、5，110，587、5，112，749、5，174，993、5，223，424、5，225，336、5，240，703,5,242，829,5,294，441,5,294，548,5, 310，668,5, 387，744,5, 389，368、5，424，065,5, 451，499,5, 453，364,5, 462，734,5, 470，734 和 5，482，713 中，其各自以引用的方式并入本文。提供基因構建體，其包括編碼IL-28或其功能片段的核苷酸序列，其中核苷酸序列可操作地連接到可在疫苗中作用以影響表達的調節序列。將基因構建體摻入減毒活疫苗和重組疫苗以產生根據本發明的改善的疫苗。本發明提供免疫個體的改善方法，其包括作為包括DNA疫苗、減毒活疫苗和重組疫苗的疫苗組合物的一部分遞送基因構建體到個體細胞的步驟。基因構建體包含編碼IL-28或功能片段并且可操作地連接到可在疫苗中作用以影響表達的調節序列的核苷酸序列。改善的疫苗導致增強的細胞免疫反應。
實施例實施例I在以下實施例中進一步說明本發明。應理解本實施例雖然表明本發明的優選實施方案，但是僅以說明的方式給出。從以上論述和本實施例，本領域技術人員可以確定本發明的必要特征，并且在不背離其精神和范圍的情況下，可對本發明做出各種變化和修改以使其適應于各種用途和條件。因此，從以上描述，除本文所示和所述的那些之外的本發明的各種修改對本領域內的技術人員而言將是顯而易見的。此類修改也旨在落入所附權利要 求的范圍內。引言評價表達SIVgag、env和pol的共同SIVmac質粒構建體的優化電穿孔(EP)誘導的細胞免疫反應，并將其與和表達質粒的恒河猴IL-12的EP結合的共同SIVmac質粒構建體的優化電穿孔(EP)誘導的細胞免疫反應進行比較，或RANTES可改變細胞免疫反應的大小和質量。T細胞免疫反應的深入改善如通過ELISpot來測量，觀察多功能流分析，離體增殖以及表位寬度。還進行了這些接種方法對未匹配的、SIVmac251直腸內激發中的病毒載量的影響的評價。發現單獨的DNA接種影響本研究中的病毒激發并防止CD4T細胞損耗。質粒IL-12和RANTES的共同遞送導致病毒復制控制的增強。因此，同時操縱質粒疫苗盒(cassette)的遞送和設計似乎對于與HIV模型系統相關的高頻細胞免疫反應的產生是重要的。材料和方法動物。根據美國實驗室動物管理認可協會(American Association forAccreditation of Laboratory Animal Care)的標準，將源于中國的恒河猴(Macacamulatta)圈養于BI0QUAL, Inc. (Rockville, MD)。在任何試驗之前使動物隔離適應至少30天。免疫。用I. 5mg SIVgag、SIVenv和SIVpol中的每一種在0、8、12和24周免疫六只一組的恒河猴(DNA)。將在各免疫的時間點的DNA通過活體內EP遞送到四頭肌中的單個位點。用 I. 5mg 的 SIVgag、SIVenv、SIVpol 和恒河猴 IL-12 (DNA+12)或 RANTES (DNA+RANTES)中的每一種在0、8和12周免疫六只恒河猴一組的另外兩組。在DNA+12和DNA+RANTES組中從第4次免疫(24周)中排除質粒佐劑。用滅菌注射水作為陰性對照(Naive)免疫六只恒河猴。使用恒定電流CELLECTRA 設備(VGX Pharmaceuticals, the Woodlands, TX)進行全部EP步驟。EP條件為0. 5Amp、3次脈沖、52毫秒脈沖長度，脈沖間隔I秒。血液采集。研究期間每兩周給動物抽血。將IOml血液采集于EDTA管。通過標準聚蔗糖-海帕克(hypaque)離心并重懸于完全培養基(RPMI 1640，具有2mM L-谷氨酰胺，補充有10%熱失活胎牛血清、100IU/ml青霉素、100 u g/ml鏈霉素和55 y MP -巰基乙醇。)中來分離外周血單個核細胞(PBMC)。用ACK裂解緩沖液(Cambrex Bio Science, EastRutherford, NJ)來裂解 RBC。質粒和質粒產物。本研究中使用的質粒對于SIVgag (pSIVgag)、SIVpol (pSIVpol)或SlVenv(PSIVenv)表達修飾的共有抗原。為了改善表達，包含有效的IgE前導序列。另夕卜，通過除去N連接的糖基化位縮短SIVenv Vl和V2區域以及截斷胞質尾以預防外膜再循環(envelope recycling)。對于SIV pol,引入3個突變以使蛋白酶、逆轉錄酶和RNAseH失活。所得優化的SIV DNA免疫原為密碼子和RNA優化的、合成的，并克隆到pVAXl表達載體以產生 SIVgag (pSIVgag)、SIVenv(pSIVenv)和 SIVpol (pSIVpol)優化的表達構建體。然后以IOL規模制備這些質粒構建體(VGXI, Inc. , the Woodlands, TX),并進行配制以用于此處所述的研究。將純化的質粒DNA配制于在水中具有0. 25% 丁呱卡因的0. 15M的檸檬酸鹽緩沖液(PH6. 7)。肽。通過NIH，NIAID，AIDS部門的AIDS研究和參考試劑計劃(AIDS Research andReference Reagent Program)獲得試劑SIVmac239gag Peptides (#6204)、SIVmac 239envPeptides(#6883)和 SIVmac239pol Peptides(#6443)。PBMC的羧基熒光素琥珀酰亞胺基酯(CFSE)共軛和流式細胞分析。在如前所述在第四次免疫后兩周分離的新鮮PBMC上進行CFSE。
酶聯免疫印跡分析(ELISpot)。 使用猴IFN ELISpotkit (Mabtech, Cincinnati, 0H),如前面所述進行ELISpot。對于前兩次免疫的輸入細胞數為2X IO5個細胞。對于第三和第四次免疫時間點，由于過量的斑點數使輸入細胞數降低至IX IO5個細胞。調整來自一式三份的孔中斑點的平均數以反映每IO6個PBMC的斑點數。從根據用于刺激的各SIV肽庫形成的斑點的值中減去根據單獨培養基形成的斑點后計算SIV特異性反應。將為彡503 ~10午81 和大于2\單獨培養基反應的反應視為陽性，并然后增加凈值。SIVpol表位矩陣作圖。如前面所述,使用矩陣格式(Matrix format)將SIVpol肽文庫分為33個庫，并用于刺激第四次免疫后分離的冷凍保存的PBMC。使用IFN ELISpot分析來評價反應寬度。基于識別的肽的總數來估計表位的最大數量。通過將陽性肽流(runs)(一系列兩個或更多個連續陽性肽)的數量除以3并四舍五入至最接近的整數來計算表位的
最小數。胞內細胞因子染色。在如前述第四次免疫后2周和最后免疫之后8個月分離的新鮮PBMC上進行多功能T細胞分析。扣除背景后報告數據。將陽性反應定義為大于0.05%。將冷凍保存的PBMC快速解凍并在刺激后在37°C的完全培養基中過夜靜置。在抗原特異性⑶8T細胞上測量CCR5(BD Biosciences，)表達的各功能以及全部功能反應。將IFN和TNFa抗體兩者放在Alexa Fluor 700上以調節該小組中另外的染色。扣除背景后報告數據并顯示為總⑶8群體的百分比顯示。SIVmac251激發。在第四次免疫后8個月用25猴感染劑量(MID)的SIVmac251通過直腸內途徑激發動物。由Ronald Desrosiers制備并由Advanced BioSciencesLaboratories, Inc (ABL, Inc.) (Kensington, MD)提供病毒原液并由 BI0QUAL, Inc.(Rockville, MD)滴定。針對血漿病毒載量的定量基于核酸序列的擴增(NASBA)的分析。如前面所述，由ABL Inc.通過定量NASBA分析SIVgag來測定血漿病毒載量。MHCI類基因型分型使用前述Sanger測序和焦磷酸測序方法的組合來進行基于全面序列的MHC-I基因型分型。簡而言之，使用MagNA Pure LC RNA分離試劑盒(RocheApplied Sciences, Indianapolis, IN)從 PBMC 分離總細胞 RNA。使用 SuperscriptIII第一鏈合成系統(Invitrogen, Carlsbad, CA)由RNA產生cDNA,并用作使用Phusion高保真聚合酶(New England BioLabs, Ipswich, MA)和MHC-I特異引物的PCR擴增的模板。使用MinElute凝膠回收試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)來凝膠純化PCR產物。對于Sanger測序，使用帶有TOPlO化學感受態大腸桿菌的Zero Blunt TOPO PCR克隆試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)將這些產物克隆到細菌中。每只動物有96-192個轉化的細菌菌落在LB+50 u g/ml卡那霉素中過夜生長；隨后使用Perfectprep質粒96Vac Bind試劑盒(5PRIME, Gaithersburg, MD)分離質粒DNA。使用序列特異性PCR引物利用DYEnamicET終止劑循環測序試劑盒(GE Healthcare, Piscataway, NJ)來進行覆蓋由MHC-I外顯子2和3編碼的高度可變肽-結合結構域的Sanger測序反應,并使用Applied Biosystems3730x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA)分析。使用 MHC-1外顯子2中通用診斷190bp PCR擴增子的Roche/454-焦磷酸測序還基因型分型了 5只動物的分組。該擴增子由cDNA擴增、凝膠純化、定量、標準化和建庫并在454測序中心(454Life Sciences, Branford, CT)或在伊利諾斯州大學的Urbana-Champaign高通量測序 中心(Urbana, IL)的基因組測序儀FLX儀器上運行。利用CodonCode aligner (CodonCodeCorporation, Deham, MA)和 Lasergene 8 (DNA Star, Madison, WI)進行序列分析。使用BLASTN將組裝的重疊群與已知恒河猴MHC-I等位基因的內部數據庫相比較。統計。對于IFNyELISpot、T細胞增殖和細胞因子產生的比較，當適當使用SPSS17. 0統計軟件時進行雙尾Mann-Whitney檢驗或借助于Tukey或DunnettT3事后檢驗的單向AN0VA。在統計分析之前對病毒載量進行對數轉換以標準化數據。〈O. 05的P值被認為是顯著的。結果研究設計。將24只源于中國的恒河猴分成四個免疫組(表3)。組I(DNA)接受編碼SIVgag、SIVenv和SIVpol的優化質粒。組2(DNA+12)接受編碼rhIL-12的質粒和組3 (DNA+RANTES)除SIV質粒之外接受編碼RANTES的質粒。組4 (天然型)接受鹽水注射。在第O、第8、第12和第24周時以I. 5mg/構建體/免疫的劑量施用質粒。通過活體內EP后的肌肉注射來對猴進行免疫。使用電穿孔的DNA質粒遞送誘導強烈的、高度增殖性細胞免疫反應。首先，通過IFNyELISpot來評價各動物中細胞免疫反應的誘導。分析在各免疫后兩周分離的PBMC的SIV特異性IFNy產生。在第一次接種(分別為60±49和569±248SFU/106PBMC)后與單獨的DNA相比質粒rhIL-12的聯合免疫導致ELISpot數的九倍增加。這種早期增強隨著進一步的免疫而降低。在四次免疫中的每一次之后，觀察到細胞反應的增強，最終在強烈的抗SIV IFNyELISpot中達到平均為16，000SFU/106PBMC或I. 6%的PBMC群體(圖Ia-Ie)。DNA+RANTES組顯示一貫低的ELISpot反應，尤其是在第三次免疫后當它們顯著地低于DNA(p〈0. 001)和DNA+12 (p=0. 001)組。四次免疫后DNA+RANTES組具有9，217±2111SFU/106PBMC 的總 IFNy 反應。在第四次免疫后的SIVpol-特異性IFNy反應的檢驗揭示三個組全部具有覆蓋整個免疫原的大寬度反應(表4)。假定一個表位可潛在地出現在基于11個氨基酸的重疊的3個肽中，則表位數將大約為陽性庫中出現的肽總數的三分之一。有意思的是，DNA+RANTES組盡管具有低于其它接種組的大小，但具有識別估計68±3. 67個表位的最不同的反應。然后，使用CFSE增殖分析來評價疫苗誘導的CD4+和CD8+T細胞反應的增殖能力(圖 2a)。DNA 組具有高于 DNA+12 和 DNA+RANTES 組(分別為 4. 56 ±2. 72% 和 I. 73 ±0. 76%和0. 46 ±0. 39%，圖2b)的⑶4+T細胞增殖反應。疫苗誘導的⑶8+T細胞與⑶4+T細胞區室相比具有更高的增殖能力。與⑶4+T細胞反應一樣，DNA組與DNA+12組中的18. 7±5. 02%和DNA+RANTES組中的17. 9 ±5. 33%相比，具有細胞增殖為41. 3 ±9. 2%的最高反應(圖2c)。雖然DNA組具有更高的增殖反應，但差異在統計學上并不顯著。質粒rhIL-12的聯合免疫通過抗原特異性⑶4+T細胞提高細胞因子產量為測定疫苗誘導的反應的質量，評價SIVpol特異性CD4+T細胞產生IFN y、IL_2、TNF a和CD107a (圖3a)。使用布爾設門(Booleangating)評價個體細胞產生多重細胞因子，即，疫苗誘導的⑶4+T細胞反應的多功能性的能力。用單獨DNA的免疫導致0. 52±0. 29%的平均SIVpol反應(圖3b)。將IL-12加入免疫導致⑶4+T功能反應幾乎兩倍的增加(0. 97 ±0. 26%)。有意思的是，RANTES的添加并未誘導高于對照組的反應(分別為0. 07±. 03%和0. 12±0. 12%)。 雖然在全部接種組中的大部分反應為單功能性的，但DNA+12組具有最大比例的能夠具有兩種或更多種功能的細胞，主要的雙功能群體為產生IFNY+TNFa +的細胞。質粒濁11-12的聯合免疫有利于通過^8+1'細胞產生正^^在⑶4+T細胞區室中已看出明顯的表型差異，然后評價⑶8+T細胞區室的表型。檢驗通過SIVpol特異性⑶8+T細胞產生的細胞因子。功能反應的大小反映了在CD4+T細胞區室中所觀察到的結果。DNA+12組具有最高反應，具有2. 34±0. 62%的⑶8+T細胞產生至少一種功能(圖3c)。DNA組具有略低的反應，具有I. 69±0. 63%，而DNA+RANTES組具有低四倍的反應，具有0. 44±0. 16%的⑶8+T細胞反應。除了具有最高大小的反應之外，與DNA組中的兩只動物和DNA+RANTES組中的一只動物相比，在DNA+12組中的六只動物中有四只具有能夠具有全部四種功能的細胞群體。盡管具有更大比例的能夠具有全部四種功能的反應，但DNA+12組中的主要反應為IFNy單功能群體。這可能表明IL-12作為分子佐劑的添加誘導高頻末端分化的效應物類細胞，該細胞喪失產生除了 IFNy外的細胞因子的能力。然而，如通過⑶28和⑶95染色所定義的那樣，這些細胞的記憶表型顯示它們均分布于效應記憶T細胞和中心記憶T細胞區室(圖3d)，從而支持了這些T細胞的功能性質。疫苗誘導的反應的保持通過由EP遞送的該質粒疫苗已觀察到細胞免疫反應的顯著誘導，進行實驗以確定這些群體是否可以在免疫反應的記憶階段中保持。將動物靜養八個月并在對離體的SIVpol刺激的反應中檢測細胞因子產生。在CD4+T細胞區室中，DNA和DNA+12組具有縮減至為免疫后的免疫反應大小的一半或更小水平的SIVpol反應(分別為0. 15 ±0. 11% 和 0. 42 ±0. 09%)(圖 4a)。一個例外是具有 0. 47 ±0. 37% 平均反應的 RANTES組。然而，在組中的一只動物具有異常高的IFNy反應，這說明大的記憶反應。如第四次免疫后所觀察到的那樣，IFNy單功能細胞為全部組中的主要群體。觀察到在記憶⑶8+T細胞區室中免疫反應的相同縮減(圖4b)。雖然未檢出四種功能細胞，但是全部三個組保持可檢出的⑶107a+IFN Y+TNF a反應以及在第四次免疫后觀察到大IFN Y +單功能群體。這些數據表明具有或不具有分子佐劑的增強的DNA接種能夠誘導長期的多功能記憶反應。
用質粒IL-12和RANTES的聯合免疫導致在設定點病毒載量的顯著下降接下來，進行實驗以確定在免疫后保持8個月的這些疫苗特異性細胞反應在SIVmac251粘膜激發后是否能夠影響病毒載量。用25猴感染劑量(MID)的SIVmac251通過直腸內途徑來激發動物。兩個月內每周及其后的每個月評價病毒載量直到激發后9個月。累計在一起，作為整體的接種動物(不論IL-12或RANTES)表現出相對于未接種的對照的顯著更低的峰病毒血癥(p=0. 027)和更低的設定點(p=0. 01)(圖5a)。對于各組平均病毒載量的進一步檢驗揭示DNA+RANTES組中病毒復制控制隨時間的增強(圖5b)。在病毒血癥的峰時，DNA和DNA+12組與天然組相比具有降低的病毒載量(分別為I. 12和0. 821og)。將RANTES加入免疫導致峰病毒血癥顯著地2. Olog降低(p=0. 016)。在設定點，與天然組相比DNA組平均僅顯示0. 621og的病毒載量降低。DNA+12和DNA+RANTES組與天然組相比具有顯著的I. 5(p=0. 029)和2. 2 (p=0. 003) log的在設定點病毒載量的降低。然而，在本研究的最后，當通過曲線下面積的分析測定，僅DNA+RANTES組具有病毒復制的顯著降低(p=0. 008)(圖5c)。之前的SIV激發研究已鑒定了與病毒復制的天然控制相關的若干MHC-I等位基因。為了評價宿主MHC-I遺傳在本研究中的潛在貢獻，反過來進行全部動物的基于全面序列的分型(表5)。事后分析揭示有四只表達保護性Mamu-B*003等位基因的動物、在 DNA+RANTES組中有兩只以及在DNA和DNA+12組中各有一只。我們在DNA+12組中也鑒定到Mamu-B*017動物。發現在DNA+RANTES組中另外的動物具有類似于Mamu_B*01702的新的I類等位基因。雖然在本研究最后在具有保護性單體型的動物中觀察到顯著低的病毒載量(p=0. 033)(圖5d)，但是在峰(p=0. 968)和設定點(p=0. 161)病毒載量沒有統計學差異。因此，這些保護性等位基因在長期感染期間可有助于控制病毒復制，但是它們似乎并不與感染后早期觀察到的疫苗對病毒復制控制的影響相關。DNA接種預防SIVmac251粘膜激發后的⑶4+T細胞損耗在接種組中的設定點處已觀察到病毒復制水平的降低，通過另外的免疫參數來評價保護。為此，2個月的每兩周及其后每四周監測CD4+T細胞計數。天然組在激發后的九個月內發生持續的CD4+T細胞損耗，與基準計數相比導致50%的損耗(圖6a-6e)。相反，接種組沒有顯示⑶4+T細胞計數的任何持續的降低。因此具有或不具有免疫佐劑的DNA接種防止用SIVmac251感染后九個月內的動物⑶4+T細胞損耗。在RANTES聯合免疫后在外周血的抗原特異性⑶8+T細胞上沒有CCR5表達的增強。進行實驗以確定與RANTES的聯合免疫是否可影響能夠被動員到感染位點并在激發后影響病毒復制的抗原特異性CD8+T細胞的水平。對于在第三次免疫后分離的冷凍保存的細胞上的CD107a、IL-2、IFNg和TNFa進行ICS。對于各功能首先測定SIVpol特異性反應以及測量那些細胞上的CCR5表達。在外周中的DNA+RANTES組(0. 26±0. 09%)與DNA和DNA+12組(分別為0. 62±0. 28%和0. 33±0. 14%)相比表達CCR5的抗原特異性CD8+T細胞的頻率較低(圖7a)。然而該差異并非統計學上顯著(Kruskal-Wal I is，p=0. 056)。在CD4+T細胞區室中看到類似的趨向，DNA組具有SIVpol特異性CCR5+細胞的最高頻率(0. 27±0. 09%)和DNA+RANTES在外周血中具有最低頻率(0. 13±0. 04%)(圖7b)。該數據支持RANTES調節或者CCR5在抗原特異性T細胞上的表達或者替換地動員這些到其它免疫位點。討論此前在靈長類動物的探索性研究中已報道了 EP和質粒IL-12顯著增強HIV質粒抗原的免疫原性的能力。在小鼠研究中還觀察到RANTES是非常有效的佐劑。本文所述的實驗設計用于確定這些策略是否能夠增強質粒SIV疫苗的免疫原性以及表征這些反應以求鑒定可能有助于病毒復制控制的細胞反應的任何亞群體。測試并檢驗共有SIV抗原以確定增強的反應是否能夠影響未匹配的、粘膜SIVmac251病毒激發。與先前的工作一致，EP能夠顯著地增強疫苗特異性IFNy反應至非常高的水平。與早期研究相反，本研究中反應的大小超過3倍以上，這與加入本研究中使用的構建體的優化策略一致。然而，除了在本研究的早期之外，當將質粒IL-12用作佐劑時觀察到ELISpot計數沒有進一步的增強。這可能是由于使用的DNA劑量或DNA濃度更高；與探索性研究中的2mg/mL相比，以10mg/mL配制疫苗。以更高的劑量和濃度使用高度優化的DNA構建體似乎克服了當配制的疫苗以較低、更稀釋的劑量遞送時觀察到的免疫原性差異。此類制劑可能對DNA平臺具有重要影響。雖然觀察到顯著的IFNyELISpot計數，但重要的是該參數單獨不應當是確定疫 苗候選物效力的唯一因素，這是因為許多研究已表明ELISpot反應不直接與病毒復制的控制相關聯。為此，評價了已證實對有效HIV疫苗而言所需的許多參數。首先,得自最新MerckSTEP的結果已表明寬免疫反應的誘導對于成功疫苗是重要的。平均而言，用Merck重組Ad5載體接種的受試者具有局限于三個至五個表位的反應寬度。在通過矩陣肽作圖來評價對SIVpol抗原的反應時，對于大多數肽庫觀察前所未有的陽性反應，這表明在全部免疫組中的寬表位覆蓋度。還有意思的是誘導絕大多數不同表位反應的DNA+RANTES疫苗具有最好的病毒復制控制。長期非進展者中的研究已顯示非進展者具有比進展者更多的功能性CD8+T細胞，這表明這些多功能群體可能在病毒控制中是重要的。在DNA和DNA+12兩組中，對于⑶4+和CD8+T細胞區室兩者觀察到多功能反應的誘導。然而令人感興趣的觀察結果甚少。首先，在⑶4+T細胞區室中，DNA組中對SIVpol的反應率和反應大小低于DNA+12組。其次，在⑶4+和⑶8+T細胞區室兩者中，DNA+12組具有高比例的由IFNy單功能細胞組成的其反應。在T細胞記憶分化模型中，此類IFNy單功能細胞被認為表示末端效應物。為了應對該可能性，通過⑶28和⑶95染色來檢驗這些單功能細胞的記憶表型。在這一情況下，發現這些反應由來自⑶28+⑶95+中心記憶群體以及⑶28TD95+效應物群體兩者的細胞組成。有可能CD28+CD95+細胞實際上不是單功能的，而且具有我們的多功能小組中未評價的某些其它功能。該假說在將來的研究中值得關注。許多DNA引物/病毒載體增強研究已顯示在SHIV89. 6P激發模型中病毒載量降低的某些效力。然而該模型在預測疫苗效力中的實用性還有爭議。因此評價了在更嚴格的、高劑量SIVmac251粘膜激發模型中的DNA疫苗誘導的免疫反應的效力。已報道使用該激發模型的其它研究對病毒復制有適度的影響。在全部接種動物和對照動物之間觀察到在保護CD4T細胞損耗中存在顯著差異。對于研究的整個過程，防止了接種動物的CD4T細胞損耗，而與佐劑無關。此外，在激發后看到接種組之間在病毒復制控制中的差異。雖然DNA和DNA+12組兩者相對于未接種的對照顯示峰病毒血癥大約Ilog的降低，但DNA+RANTES組與天然組相比顯示顯著的2. 21og的峰病毒載量的降低。雖然DNA組在設定點不具有顯著地病毒載量降低，但用IL-12和RANTES輔佐的組具有顯著更低的病毒載量。在第35周，與天然對照相比，僅DNA+RANTES組顯示持續的、顯著的對病毒載量的影響。對人和恒河猴的大量研究已表明某些MHC單體型與病毒的自然控制相關。雖然最先的研究已證實源于印度的恒河猴中的MHC-I/疾病相關性，但將源于中國的恒河猴用于SIV疫苗研究的增加已擔當起對于在該研究群體中的相似研究的需求以補充迄今為止已完成的那些研究。為了應對該問題，在激發研究已開始后進行全部動物的全面I類基因型分型。事后分析揭示有四只動物表達與強烈預防SIV復制相關的Mamu-B*003等位基因；在DNA+RANTES組中有兩只以及在DNA和DNA+12組中各一只。在DNA+12組中還鑒定了Mamu-B^O17動物。有意思的是，激發后在從未顯示可檢出的血漿病毒RNA的DNA+RANTES動物中檢測到潛在地保護性Mamu-B*017樣新型等位基因。在研究最后在具有這些保護性等位基因的動物中觀察到顯著更低的病毒載量(P=O. 035)，這與該I類等位基因的重要性相一致。然而，相比之下，在保護性單體型動物的峰(P=O. 561)和設定點(p=0. 056)的病毒載量沒有統計學差異。因此在長期感染期間保護性單體型與病毒的控制相關，但在感染早期的病毒復制控制中也觀察疫苗效果。另外，在接種組中激發后CD4+T細胞耗竭的缺乏在具有Mamu-B*003或Mamu_B*017等位基因的動物與接種的其它動物之間沒有顯著區別。概括起來，這些數據進一步表明DNA接種可有助于SIVmac251粘膜激發中的保護。 在DNA+RANTES組中觀察到的增強病毒抑制的機理尚不清楚。從我們的分析可清楚的是，這并不是由于IFNy反應的大小引起的。一種假說是免疫期間RANTES的存在會調節CCR5+⑶8+T細胞的頻率。如已針對CCR5+⑶4+T細胞所報道的那樣，這些細胞然后回歸到感染位點，并能夠靶向感染的CD4+T細胞并提供改善的結果。為了以初步方式應對該假說，在免疫后在外周血中測量表達CCR5的抗原特異性CD8+T細胞的頻率。在外周血的DNA+RANTES組中觀察到這些細胞的較低頻率。該結果與在其它分析中觀察到的抗原特異性細胞的較低頻率一起可能反映與其它接種組相比的RANTES佐劑反應的差異性回歸模式(differential homing pattern)(例如粘膜區室)。在任何事件中清楚的是,RANTES調節誘導的T細胞的免疫生物學方面，并且該調節似乎在病毒激發的情況中對宿主有益。需要進行將來的研究以進一步探索該重要領域。雖然檢驗了許多免疫參數，但沒有一種單一分析能夠預測病毒激發的結果。在本研究中觀察到的病毒復制的控制并與中和抗體的發展不相關，這是因為在免疫后沒有檢出任何一種。最近的研究已表明它細胞功能，例如細胞毒性可能是保護性免疫反應的較好指示物。然而由于缺少恒河猴特異性抗體，未對疫苗中穿孔素誘導的免疫反應進行評價。基于激發結果似乎清楚的是，IFNyELISpot反應雖然重要，但是從可能是病毒控制更佳指示物的其它功能中單獨地分離。IL-12和RANTES誘導的反應的免疫表型的進一步研究將在確定本研究中所觀察到的降低病毒復制的細胞機理中是重要的。Merck STEP試驗的最新結果強調了許多將來T細胞類疫苗候選物需要應對的問題，包括預存疫苗載體血清學的顧慮、在Ad5平臺上顯著改善免疫反應的大小和寬度的要求，和在異種SIV粘膜激發模型中改善病毒控制。在這方面，本文提供的收集數據證實此處所述的組合的DNA疫苗方法能夠誘導與SIV感染相關的強烈的免疫反應，同時規避由于預存血清學引起的問題。可能有意義的是將這些疫苗與載體方法結合以部分地繞過該血清學類問題。另外，這些反應的大小以及調節使用分子佐劑誘導的免疫反應的方向和表型的能力對于SIV模型中疫苗有關的關聯性的研究而言是特別有用的工具。
表3 :免疫程序表
權利要求
1.一種分離的核酸分子，其包含選自由以下組成的組的核苷酸序列SEQ ID NO: USEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID N0:7、與 SEQ ID NO: 195% 同源的核酸序列、與 SEQ IDNO:395%同源的核酸序列、與SEQ ID NO:595%同源的核酸序列、與SEQ ID N0:795%同源的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: I的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQID NO:3的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 7的功能片段、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: I的功能片段95%同源的核酸序列、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 3的功能片段95%同源的核酸序列、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO:5的功能片段95%同源的核酸序列和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO:7的功能片段95%同源的核酸序列。
2.根據權利要求I所述的分尚的核酸分子，其包含SEQID NO:l。
3.根據權利要求I所述的分離的核酸分子，其包含在編碼序列的5’端含有連接到SEQID NO: I的IgE前導編碼序列的核酸序列。
4.根據權利要求I所述的分尚的核酸分子，其包含SEQIDNO:3。
5.根據權利要求I所述的分離的核酸分子，其包含在編碼序列的5’端含有連接到SEQID NO: I的IgE前導編碼序列且在5’非翻譯區進一步包含Kozak序列的核酸序列。
6.根據權利要求I所述的分尚的核酸分子，其包含SEQIDN0:5。
7.—種表達載體，其包含可操作地連接到在人細胞中作用的調控元件的權利要求I所述的核酸序列。
8.根據權利要求4所述的表達載體，其中所述表達載體為質粒。
9.一種組合物，其包含 a)多個一種或多種核酸分子，其包含選自由以下組成的組的一種或多種核酸序列 I)選自由下述組的組由 SEQ ID NO: I、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、與SEQ ID NO: 195%同源的核酸序列、與SEQID N0:395%同源的核酸序列、與SEQ ID N0:595%同源的核酸序列、與SEQ ID NO:795%同源的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: I的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO:3的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 5的功能片段、包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 7的功能片段、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: I的功能片段95%同源的核酸序列、與包含至少60個核苷酸的SEQID NO: 3的功能片段95%同源的核酸序列、與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 5的功能片段95%同源的核酸序列和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 7的功能片段95%同源的核酸序列組成的組的核苷酸序列；和 b)編碼一種或多種免疫原的一種或多種另外的核酸序列。
10.根據權利要求9所述的組合物，其中所述b)的一種或多種另外的核酸序列在來自a)部分中所述的多個核酸分子中的多個一種或多種不同核酸分子上。
11.根據權利要求9所述的組合物，其中a)部分中所述的多個核酸分子包含SEQIDNO: I。
12.根據權利要求9所述的組合物，其中a)部分中所述的多個核酸分子包含在編碼序列的5’端含有連接到SEQ ID NO: I的IgE前導編碼序列的核酸序列。
13.根據權利要求9所述的組合物，其中部分中所述的多個核酸分子包含含有SEQIDNO:3的核酸序列。
14.根據權利要求9所述的組合物，其中a)部分中所述的多個核酸分子在編碼序列的5’端包含連接到SEQ ID NO: I的IgE前導編碼序列并在5’非翻譯區進一步包含Kozak序列。
15.根據權利要求9所述的組合物，其中a)部分中所述的多個核酸分子包含SEQIDN0:5。
16.根據權利要求9所述的組合物，其中a)和b)部分中所述的核酸序列各自可操作地連接到在人細胞中作用的調控元件。
17.根據權利要求9所述的組合物，其中a)和b)中所述的核酸序列是一種或多種表達載體的一部分。
18.根據權利要求17所述的組合物，其中一種或多種表達載體為質粒。
19.根據權利要求9所述的組合物，其中所述免疫原為病原體抗原、癌癥相關的抗原或與參與自身免疫病的細胞相關的抗原。
20.根據權利要求19所述的組合物，其中所述免疫原為病原體抗原。
21.一種調節免疫反應的方法，其包括向個體施用包含權利要求I所述的核酸序列的核酸分子的步驟。
22.—種誘導對抗免疫原的免疫反應的方法，其包括向個體施用權利要求9所述的組合物的步驟。
23.一種重組病毒載體，其包含權利要求I所述的核苷酸序列。
24.根據權利要求23所述的重組病毒載體，其進一步包含可操作地連接到調控元件的編碼免疫原的核酸序列。
25.根據權利要求23所述的重組病毒載體，其中所述免疫原為病原體抗原、癌癥相關的抗原或與參與自身免疫病的細胞相關的抗原。
26.根據權利要求25所述的重組病毒載體，其中所述免疫原為病原體抗原。
27.—種調節個體中的免疫反應的方法，其包括向所述個體施用權利要求26所述的重組病毒載體。
28.一種減活病原體，其包含權利要求I所述的核苷酸序列。
29.一種免疫個體以對抗病原體的方法，其包括向所述個體施用權利要求29所述的減活病原體。
全文摘要
本發明公開了包含編碼RANTES及其片段和變體的核苷酸序列的核酸分子。另外，提供了包含與編碼免疫原的核酸序列相結合的編碼RANTES及其片段和變體的核苷酸序列的核酸分子和組合物。還提供了包含編碼RANTES及其片段和變體的核苷酸序列、具有或不具有編碼免疫原的核酸序列的重組病毒載體，其為包含編碼RANTES及其片段和變體的核苷酸序列的減活病原體。還公開了調節免疫反應和誘導對抗免疫原的免疫反應的方法。
文檔編號C07H21/00GK102781952SQ201180008582
公開日2012年11月14日 申請日期2011年2月8日 優先權日2010年2月8日
發明者D·B·韋納, J·D·博耶, M·庫茲勒 申請人:賓夕法尼亞大學托管會