專利名稱：一種免疫球蛋白g的生產方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及一種免疫球蛋白G的生產方法及其應用。
背景技術：
我國的動物血資源非常豐富，每年約生產230萬噸的動物血液，但是大部分未被合理加工使用，只有小部分加工成血漿蛋白粉和血球蛋白粉類的中檔產品，因此動物血類產品附加值很低，造成極大的浪費。免疫球蛋白G普遍存在于哺乳動物和人類的血液、組織液和外分泌液中，并廣泛用于生物醫學領域。動物血中具有豐富的免疫球蛋白，其含量一般為25-35%。免疫球蛋白是保護機體抵抗外界感染的免疫成分，是初級免疫應答中最持久、最重要的抗體，具有抗菌性、抗毒性和抗病毒性，在抗感染中起到主力軍作用。目前免疫球蛋白的分離方法有硫酸氨分級沉淀法、乙醇分離法，這些方法都用于免疫球蛋白的粗提，進一步純化的方法主要包括離子交換法、凝聚過濾法、親合色譜法和超濾法。有時也將幾種方法結合使用。目前，國內外生產免疫球蛋白產品通常是通過硫酸銨沉淀、乙醇沉淀等實驗室試制方法，生產工藝繁瑣，生產規模較小，不適合大工業生產。因此本領域迫切需要開發一種適于工業化生產、工藝先進簡便、環保的從動物血中規模化生產免疫球蛋白G產品的方法。
發明內容
本發明的目的就是提供一種免疫球蛋白G的生產方法及其應用。在本發明的第一方面，提供了一種免疫球蛋白G的制備方法，包括步驟(a)將含有免疫球蛋白G的原料與抗凝劑混合，獲得抗凝全血；(b)對步驟(a)獲得的抗凝全血進行離心，獲得輕液血漿和重液血球；(c)將步驟(b)獲得的輕液血漿與FeCl3溶液混合，進行沉淀反應，獲得沉淀反應液；(d)對步驟(C)獲得沉淀反應液進行澄清，獲得含有免疫球蛋白G的輕液；(e)調節步驟(d)獲得的輕液的pH至8-12，離心，獲得含有免疫球蛋白G的上清液。在另一優選例中，步驟(a)所述的原料來自于人或非人哺乳動物。在另一優選例中，步驟(a)所述的原料來自于豬、牛、羊，或鼠。在另一優選例中，步驟(a)所述的抗凝劑選自下組⑴草酸鉀；(ii)檸檬酸鈉；(iii)草酸鉀和檸檬酸鈉；(iv)草酸鉀、氯化鈉、檸檬酸鈉。在另一優選例中，草酸鉀氯化鈉檸檬酸鈉的比例為3-5 2-3 5-7。
在另一優選例中，抗凝劑的濃度為2_20wt%，較佳地為5_15wt%，更佳地為IOwt % ο在另一優選例中，抗凝劑的添加量為原料體積的2-20% (w/v)，較佳地為5-15%(w/v);更佳地為 10% (w/v)。在另一優選例中，步驟(b)的離心條件為轉速為1000-20000rpm。在另一優選例中，步驟(b)的離心條件為轉速16000rpm。在另一優選例中，步驟(C)中FeCl3溶液加入輕液血漿后，FeCl3的終濃度為l_8mmol/L0在另一優選例中，FeCl3的終濃度為5mmol/L。在另一優選例中，FeCl3加入后，輕液血漿的pH值為3. 0-5. 5，較佳地為5. O。在另一優選例中，沉淀反應的時間為I 4小時；較佳地為2小時。在另一優選例中，步驟(b)和步驟(C)之間還包括步驟(b’ ):將步驟(b)獲得的輕液血漿進行稀釋。 在另一優選例中，用蒸餾水對步驟(b)獲得的輕液血漿進行稀釋。在另一優選例中，輕液血漿的稀釋倍數為2-15倍，較佳地10倍。在另一優選例中，步驟⑷用碟片離心機進行澄清。在另一優選例中，碟片離心機的轉速為6000 12000rpm，較佳地lOOOOrpm。在另一優選例中，步驟(e)后還包括步驟(f):對步驟(e)獲得的上清液進行過濾，獲得含有免疫球蛋白G的濃縮液產品。在另一優選例中，所述的過濾為納濾膜過濾。在另一優選例中，所述的納濾膜截留分子量為2Da_100kDa，較佳地，截留分子量為10-5000Da，更佳地，截留分子量為lOOODa。在另一優選例中，所述的納濾膜為聚酰胺材質納濾膜、卷式膜或選管式膜。在另一優選例中，步驟(f)后還包括步驟(g):對步驟(f)獲得的含有免疫球蛋白G的濃縮液進行包埋和干燥，獲得含有免疫球蛋白G的粉末產品。在另一優選例中，所述的包埋為用海藻酸鈉溶液進行包埋，較佳地，海藻酸鈉溶液的濃度為5 30wt%，更佳地為15wt%。在另一優選例中，海藻酸鈉的添加量為濃縮液的0. 5% 10% (w/v)，較佳地3%(w/V)。 在另一優選例中，所述的干燥為噴霧干燥法。在本方面的第二方面，提供了一種免疫球蛋白G，所述的疫球蛋白G具有以下特征(I)辛酸含量低于0. 001 % ;(II)免疫球蛋白G的活性彡90% ;和(III)使用本發明第一方面所述的方法制備獲得。在另一優選例中，所述的免疫球蛋白G是用含有下述步驟的方法獲得(a)將含有免疫球蛋白G的原料與抗凝劑混合，獲得抗凝全血；(b)對步驟(a)獲得的抗凝全血進行離心，獲得輕液血漿和重液血球；(c)將步驟(b)獲得的輕液血漿與FeCl3溶液混合，進行沉淀反應，獲得沉淀反應液；(d)對步驟(C)獲得沉淀反應液進行澄清，獲得含有免疫球蛋白G的輕液；(e)調節步驟(d)獲得的輕液的pH至8-12，離心，獲得含有免疫球蛋白G的上清液；(f)對步驟(e)獲得的上清液進行過濾，獲得含有免疫球蛋白G的濃縮液產品；(g)對步驟(f)獲得的含有免疫球蛋白G的濃縮液進行包埋和干燥，獲得含有免疫球蛋白G的粉末產品。在本發明的第三方面，提供了一種含有本發明第二方面所述免疫球蛋白G的組合物。在另一優選例中，所述的組合物為飼料組合物、藥物組合物或食品組合物。在另一優選例中，所述的組合物用于⑴降低腹瀉率；(ii)增加血液免疫球蛋白含量；(iii)治療腸道疾病。應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
下列附圖用于說明本發明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發明范圍。圖1顯示了生產免疫球蛋白G產品的流程圖。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，首次建立一種適于工業化生產、工藝先進簡便的從動物血中規模化生產免疫球蛋白G產品的方法。所述方法包括步驟全血抗凝、離心分離、稀釋、沉淀反應、再離心分離、納濾脫鹽、包埋、噴霧干燥等步驟。具體地，本發明人意外地發現，采用FeCl3的方法對含有免疫球蛋白G的濃縮液進行沉淀反應，獲得的免疫球蛋白G產品不僅純度高，而且不影響免疫球蛋白G的活性。術語如本文所用，術語“含有”包括“具有(comprise) ”、“基本上由...構成”和“由..·構成”。如本文所用，術語“以上”和“以下”包括本數，例如“ 80 %以上“指彡80 %，“ 2 %以下”指彡2%。免疫球蛋白G如本文所用，術語“免疫球蛋白”是指一種具有抗體活性或化學結構上與抗體相似的球蛋白。免疫球蛋白是一類重要的免疫效應分子，由兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈所組成，在體內以兩種形式存在可溶性免疫球蛋白存在于體液中，具有抗體活性，參與體液免疫；膜型的免疫球蛋白是B細胞抗原受體。
免疫球蛋白可以分為IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五類。人體血清免疫球蛋白的主要成分是IgG，占總免疫球蛋白的70-75%，分子量約為150KDa，含糖量為2 3%。人體血清免疫球蛋白IgG是初級免疫應答中最持久、最重要的抗體，它僅以單體形式存在，它能夠促進單核巨噬細胞的吞噬作用，中和細菌毒素的毒性，和病毒抗原結合使病毒失去感染宿主細胞的能力。此外IgG還具有調理吞噬和結合SPA等作用。本發明方法制備的免疫球蛋白G的純度可以達到80%，且具有抗菌性、抗毒性、抗病毒性和增加機體免疫力等優勢，可以直接被動物吸收利用。本發明提供的免疫球蛋白G具有下述特征(a)辛酸含量低于O. 001% ； (b)免疫球蛋白G的活性彡90% ;和(c)使用本發明所述的方法制備獲得。在另一優選例中，所述的免疫球蛋白G是用含有下述步驟的方法獲得(a)將含有免疫球蛋白G的原料與抗凝劑混合，獲得抗凝全血；(b)對步驟(a)獲得的抗凝全血進行離心，獲得輕液血漿和重液血球；(C)將步驟(b)獲得的輕液血漿與FeCl3溶液混合,進行沉淀反應,獲得沉淀反應液；(d)對步驟(C)獲得沉淀反應液進行澄清，獲得含有免疫球蛋白G的輕液；(e)調節步驟(d)獲得的輕液的pH至8-12，離心，獲得含有免疫球蛋白G的上清液；(f)對步驟(e)獲得的上清液進行過濾，獲得含有免疫球蛋白G的濃縮液產品；(g)對步驟(f)獲得的含有免疫球蛋白G的濃縮液進行包埋和干燥，獲得含有免疫球蛋白G的粉末產品。免疫球蛋白G用途利用本發明方法制備的具有優良特性的免疫球蛋白G可用于各種技術領域，包括食品、保健品及醫藥工業等。
具體地，利用本發明方法制備的免疫球蛋白G可應用于抗菌、抗病毒等產品的制備；可應用于增強免疫力組合物的制備，或應用于幼小動物的腸道疾病防御類組合物的制備；所述的組合物包括食品或飼料組合物、保健品組合物和藥品組合物。對于本發明所述的組合物的劑型沒有特別的限制，可以是任何適用于哺乳動物服用的劑型；優選的，所述的劑型可選自顆粒劑、片劑、膠囊、口服液、混懸液、粉末劑或乳劑。本發明還提供了一種含有用本發明的方法制備的免疫球蛋白G的組合物，所述的組合物為飼料組合物、藥物組合物或食品組合物。給需要的對象施用該組合物，可以用于
(i)降低腹瀉率；(ii)增加血液免疫球蛋白含量；(iii)治療腸道疾病。所述的需要的對象較佳地為人或非人哺乳動物。制備方法本發明提供了一種從動物血中提取免疫球蛋白G的方法，利用抗凝、分離、沉淀和納濾脫鹽、包埋等一系列步驟可以從動物全血中制備天然的免疫球蛋白G，其純度可以達到80%。 在本發明的一個優選例中，包括步驟(a)全血抗凝將抗凝劑配置成一定濃度的抗凝液，以全血體積的5 15%進行添力口，獲得抗凝全血I ;(b)離心將抗凝全血I進行離心,得到輕液血漿II和重液血球；
(c)稀釋將輕液血漿II稀釋一定倍數，獲得稀釋液III ；(d)沉淀反應向稀釋液III中添加一定濃度的FeCl3溶液，調節pH和溫度，進行沉淀反應，獲得反應液IV ；(e)澄清將反應液IV進行澄清，去除沉淀物，保留輕液V ;(e)再離心調節輕液V的pH值，進行再離心，獲得上清液VI ；(f)納濾將所述上清液VI通過納濾膜處理，得到濃縮液VII ；(g)包埋向濃縮液VII中添加一定濃度的海藻酸鈉溶液，得到混合液VIII ;(h)干燥將所述混合液VIII干燥，得到所述免疫球蛋白G產品。在本發明的一個優選例中，步驟中(a)使用的抗凝劑選自草酸鉀、氯化鈉、檸檬酸鈉，或其組合，較佳地，以草酸鉀氯化鈉檸檬酸鈉=3-5 2-3 5-7的比例制備的混合物，作為抗凝劑。抗凝劑可配置成5 15wt%的濃度，添加量為料液體積的5 15%(w/V)。在本發明的一個優選例中，步驟(C)中所述的稀釋液為蒸餾水，即通過反滲透膜處理的水，不可用自來水或地下水。在本發明的一個優選例中，步驟(d)中稀釋液III中所含的FeCl3的濃度為O. l-10mmol/L，較佳地為I 8mmol/L ；pH范圍在優選為2. 0-7. 0，更加地為3. 0-5. 5 ;溫度優選為25-50°C，更佳地為30°C ;反應時間優選為O. 5-5小時，更加地1_4小時。在本發明的一個優選例中， 步驟(f)中的納濾膜為規格為1000分子量，納濾膜選自下組聚酰胺材質、卷式膜或選管式膜。在本發明的一個優選例中，步驟(g)所述的海藻酸鈉的添加量為混合液VII的O. 5 10% (w/v)，添加前將其配置成5 30%的溶液。圖1顯示了在本發明的一個優選例中，生產免疫球蛋白G產品的過程。FeCl3 沉淀本發明人意外地發現，采用FeCl3的方法對含有免疫球蛋白G的濃縮液進行沉淀反應，獲得的免疫球蛋白G產品不僅純度高，而且不影響免疫球蛋白活性。在本發明的一個優選例中，FeCl3溶液加入輕液血漿后，FeCl3的終濃度為l-8mmol/L，較佳地FeCl3的終濃度為5mmol/L。在另一優選例中，FeCl3加入后，輕液血漿的pH值為3. 0-5. 5，較佳地為5. O。沉淀反應的時間為I 4小時；較佳地為2小時。納濾在本發明中，提供了一種利用納濾對含有免疫球蛋白G的上清液進行過濾的方法。在一個優選例中，納濾膜截留分子量小于IOOkDa的蛋白質，較佳地，截留分子量小于50kDa的蛋白質，更佳地，截留分子量為IOOODa的蛋白質。在另一優選例中，所述的納濾膜選自聚酰胺材質納濾膜、卷式膜或選管式膜，較優地，可選卷式膜。免疫球蛋白IgG的鑒定本領域技術人員你可以利用常用的方法對免疫球蛋白IgG進行鑒定，在一個優選例中，根據高效親和色譜的原理，在磷酸鹽緩沖液條件下免疫球蛋白IgG與配基連接，在PH2. 5的鹽酸甘氨酸條件下洗脫免疫球蛋白IgG，因此可以用于鑒定免疫球蛋白IgG。在本發明的一個優選例中，測試步驟和條件如下流動相A為磷酸鹽緩沖液；流動相B為甘氨酸鹽酸緩沖液；采用具紫外檢測器和梯度洗脫裝置的高效液相色譜儀進行鑒定。HPLC參考條件見表I。表I
權利要求
1.一種免疫球蛋白G的制備方法，其特征在于，包括步驟 (a)將含有免疫球蛋白G的原料與抗凝劑混合，獲得抗凝全血； (b)對步驟(a)獲得的抗凝全血進行離心，獲得輕液血漿和重液血球； (c)將步驟(b)獲得的輕液血漿與FeCl3溶液混合，進行沉淀反應，獲得沉淀反應液； (d)對步驟(c)獲得沉淀反應液進行澄清，獲得含有免疫球蛋白G的輕液； (e)調節步驟(d)獲得的輕液的pH至8-12，離心，獲得含有免疫球蛋白G的上清液。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)所述的原料來自于人或非人哺乳動物。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)所述的抗凝劑選自下組 ⑴草酸鉀； ( )檸檬酸鈉； (iii)草酸鉀和檸檬酸鈉； (iv)草酸鉀、氯化鈉、檸檬酸鈉。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(b)的離心條件為轉速為1000-20000rpmo
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(c)中FeCl3溶液加入輕液血漿后，FeCl3的終濃度為l-8mmol/L。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(b)和步驟(c)之間還包括步驟(b’)將步驟(b)獲得的輕液血漿進行稀釋。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(d)用碟片離心機進行澄清。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(e)后還包括步驟(f):對步驟(e)獲得的上清液進行過濾，獲得含有免疫球蛋白G的濃縮液產品。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(f)后還包括步驟(g):對步驟(f)獲得的含有免疫球蛋白G的濃縮液進行包埋和干燥，獲得含有免疫球蛋白G的粉末產品。
10.一種免疫球蛋白G，其特征在于，具有以下特征 (I)辛酸含量低于0.001%； (II)免疫球蛋白G的活性彡90%;和 (III)使用權利要求1所述的方法制備獲得。
11.含有權利要求10所述免疫球蛋白G的組合物。
全文摘要
本發明涉及一種免疫球蛋白G的生產方法及其應用，具體地，包括步驟全血抗凝、離心分離、稀釋、FeCl3沉淀反應、澄清、再次離心分離、納濾脫鹽、包埋、噴霧干燥等步驟。本發明不但解決了動物副產物豬血資源浪費及環境污染等問題，而且通過連續的大生產加工工藝，極大提升了豬血的利用價值，所制備的免疫球蛋白G經ELISA活性鑒定，其活性可達到90％以上，且對幼小動物的腸道疾病有特殊療效，可用于弱質動物群體免疫增強劑，也是機體正常營養補充劑。
文檔編號C07K16/06GK103044543SQ20111045011
公開日2013年4月17日 申請日期2011年12月28日 優先權日2011年12月28日
發明者成國祥, 江國永, 于偉 申請人:上海杰隆生物制品股份有限公司