專利名稱：包含免疫球蛋白Fc片段的長效人內皮抑素的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物制品制藥技術領域，涉及一種長效重組人內皮抑素的制備方法。
背景技術：
自Folkman于1971年提出“腫瘤的生長和轉移都依賴于新生血管的生成”[Folkman J.N Engl J Med 1971 ；285 =1182-1186]的觀點以來，人們就把抑制腫瘤血管生成作為一種研究對象。血管內皮抑素(Endostatin)由美國O' Reilly等人于1997年首先發現。O' Reilly等人在試驗中發現體外培養的鼠血管內皮細胞瘤(EOMA)的細胞培養液能抑制體外牛毛細血管內皮細胞增殖，他們從這種培養液中提純出了一種新的蛋白質，并命名為內皮抑素(Endostatin，ES)。經鑒定表明鼠內皮抑素由膠原蛋白XVIII C末端區內184個氨基酸片段構成[O’Reily M S.et al.US 005854205A]。我國徐根興等人也于當年在研究內皮抑素工作中發現了人的血管內皮抑素，并從人肝臟cDNA文庫中篩選克隆得到人體血管內皮抑素基因[徐根興等，CN1177005A]。內皮抑素的直接作用是通過抑制血管生長而起到抗腫瘤作用，并且不會導致抗藥性產生。恩度(Endostar)是我國自主研發的重組人血管內皮抑素(Recombinant HumanEndostatin, rhES),于2005年上市,用于非小細胞肺癌的治療。它與天然的血管內皮抑素相比，在N端添加了 9個氨基酸序列，提高了生物活性和穩定性。恩度與化療藥物長春瑞賓和順鉬(NP化療方案)聯用有一定的協同作用，可延緩患者的腫瘤進展。但是內皮抑素作為小分子蛋白，性質很不穩定，易于發生酶促降解并被清除，因此在體內的半衰期較短。而且，目前恩度臨床用藥量很大，在聯合NP化療方案用于治療初治或復治的III/IV期非小細胞肺癌患者時，注射劑量為7.5mg/m2，每天靜脈滴注3_4小時，連續給藥14天為一周期。因此，提高rhES的體內半衰期，從而減少治療劑量，降低患者痛苦以提高患者依從性成為一個急需解決的問題。為了穩定蛋白質、預防酶促降解和被腎臟清除，可以使用諸如聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)等具有高溶解性的聚合物來化學修飾蛋白質藥物的表面。PEG分子具有兩親性，既可以溶于水，又可以溶于大多數的有機溶劑，無毒、無免疫原性，是可用于藥物制備的高分子之一。通過與靶蛋白質的特定區域或各種區域結合，PEG能夠提高血漿半衰期，增強生物利用度，減低蛋白質免疫原性、提高藥物療效及安全性等。另外，可通過在PEG兩端連接同樣的蛋白質藥物來制備二倍體，以提高蛋白藥物的活性。也可以將兩種不同的蛋白質藥物連接于PEG的兩端，得到具有兩種活性的藥物組合物。
改善蛋白藥物的體內半衰期還可以通過用基因重組技術，將藥物蛋白的基因與編碼具高血清穩定性的蛋白質基因相融合，從而生產融合蛋白藥物。例如將蛋白質藥物與白蛋白或其片段融合，或者與免疫球蛋白Fe片段融合。研究表明，藥物與免疫球蛋白Fe片段融合，可以明顯改善藥物的體內半衰期。不過，盡管PEG能增強蛋白質的穩定性，PEG偶聯也存在一些問題，如降低蛋白生物學活性。此外，隨著PEG分子量的提高，其產量也會有所降低等等。通過基因重組產生融合蛋白也具有一些缺點。例如，其導致所產生的融合蛋白的活性顯著降低。蛋白質作為生理學功能性物質的活性是由蛋白質的構象決定的。當多肽藥物通過重組方法與免疫球蛋白Fe片段融合時，利用原核細胞進行表達，融合蛋白常常發生錯誤折疊并以包涵體的形式表達；而利用真核細胞表達，免疫球蛋白Fe片段通常會被糖基化，從而可能引起體內的不良免疫應答。融合的接頭區也可能對蛋白水解酶的降解作用敏感等等。韓國韓美藥品有限公司開發了一種新型長效重組蛋白或多肽藥物的技術平臺(W02005/047337)，其中公開了一種包含免疫球蛋白Fe片段作為載體的藥物組合物可以延長蛋白或多肽藥物的半衰期，并提高藥物的體內生物利用率。然而，如WO 2005/047337中所記載，其所得重組蛋白或多肽藥物最多僅保留約50%的體外細胞學活性。本領域還需要在提高人內皮抑素的穩定性和體內半衰期的同時保留其生物活性，從而提高其生物利用度，減少治療劑量，并提高患者依從性的長效rhES制劑。
發明內容
本發明的目的是提供一種長效血管內皮抑素制劑，從而增強血管內皮抑素在體內的穩定性，提高其有效血藥濃度和生物利用度，并延長半衰期。本發明還提供了制備、分離和純化長效血管內皮抑素制劑的方法，以及所述長效血管內皮抑素制劑在制備用于治療癌癥的藥物中的應用。第一方面，本發明提供了一種長效血管內皮抑素制劑，所述長效重組人內皮抑素是通過聚乙二醇與免疫球蛋白Fe片段共價連接的人內皮抑素分子。本發明中的長效rhES制劑以免疫球蛋白Fe片段作為載體。免疫球蛋白Fe片段是在體內可新陳代謝的生物可降解多肽，因此，將其作為藥物載體是安全的。本文中所述的“免疫球蛋白Fe片段”具有本領域技術人員通常理解的含義。具體地，所述的“免疫球蛋白Fe片段”是指包含免疫球蛋白重鏈恒定區2 (Ch2)和重鏈恒定區3(Ch3)且不含免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區的蛋白質。免疫球蛋白Fe片段可進一步包含位于重鏈恒定區的鉸鏈區。此外，本發明的免疫球蛋白Fe片段還可包含重鏈恒定區I (ChI)和/或輕鏈恒定區I(Ql)的一部分或全部，只要它具有與天然蛋白基本相似或更好的生理學功能。由于免疫球蛋白Fe片段不包含在抗體亞型之間具有高度非同源性的Fab片段，因此其抗原性大大降低。本發明的免疫球蛋白Fe片段可來自人類或其它動物，包括牛、山羊、豬、小鼠、兔子、倉鼠、大鼠和豚鼠，優選來自人類。本發明的免疫球蛋白Fe片段可以是從人類或其它動物分離的天然形式或其衍生物。在本文中，可以通過從人或動物體中分離完整的免疫球蛋白并用蛋白水解酶處理，從而從天然免疫球蛋白獲得Fe片段。例如，可以使用木瓜蛋白酶處理分離的天然免疫球蛋白，從而獲得Fab片段和Fe片段，并對這些片段進行純化，從而分離出Fe片段。此外，如果需要，也可以 對Fe片段進行衍生化，從而獲得Fe衍生物。本文中所述的“Fe片段衍生物”是指具有與本發明Fe片段相同或更高的性能，例如結構穩定性(包括耐熱性、PH穩定性)等的衍生物。由Fe片段獲得Fe片段衍生物的方法是本領域已知的。例如可以通過化學方式,如磷酸化、甲基化、乙酰化等,或者生物方式,例如突變或重組等方式獲得Fe片段的衍生物。由Fe片段獲得的Fe片段衍生物也包含在本發明的范圍之內。本發明的免疫球蛋白Fe片段還可以由轉化的細胞，例如動物細胞或微生物細胞表達而獲得。例如，本發明的免疫球蛋白Fe片段可以是得自于微生物的重組人源免疫球蛋白Fe片段。本發明的免疫球蛋白Fe片段可以是具有天然糖鏈、與天然形式相比糖鏈增加或減少的形式，或者可以是去糖基化的形式。免疫球蛋白Fe糖鏈的增加、減少或去除可以通過本領域的常規方法完成，諸如化學法、酶促法和利用微生物的遺傳工程方法等，但不限于此。去除免疫球蛋白Fe片段的糖基可導致它與第一補體成分Cl的Clq部分的結合親和力明顯降低，抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)的降低或喪失，從而不會在體內引起不必要的免疫應答反應。因此，在本發明中優選使用去糖基化或非糖基化的免疫球蛋白Fe片段。本文中的術語“去糖基化”或“非糖基化”是指從免疫球蛋白Fe片段除去了糖基部分或以沒有糖基化的形式產生的免疫球蛋白Fe片段。此外，免疫球蛋白Fe片段可以是來自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fe片段，或者通過它們的組合或雜合制備而來的Fe片段。優選的Fe片段來自IgG或IgM，它們是人類血液中最豐富的蛋白質之一。考慮到IgG能延長配體結合蛋白質的半衰期,最優選來自IgG的Fe片段。本文中的術語“組合”是指編碼同一來源的單鏈免疫球蛋白Fe片段的多肽與不同來源的單鏈多肽連接形成的二聚體或多聚體。例如由IgGlFC、IgG2Fc、IgG3Fc和IgG4Fc片段中的兩種或多種片段所形成的免疫球蛋白Fe片段。
本文中的術語“雜合”是指編碼不同來源的兩種或多種免疫球蛋白Fe片段的序列存在于單鏈免疫球蛋白Fe片段中。各種類型的雜合體包含在本發明的范圍之內。在一個實施方式中，本發明的免疫球蛋白Fe片段可以包含選自CH1，Ch2，Ch3，Ch4結構域中的1_4個結構域。例如，所述免疫球蛋白Fe片段可以包含免疫球蛋白Fe片段的CH1，Ch2，Ch3，和Ch4中的一種或四種結構域。此外，所述免疫球蛋白Fe片段還可以包含鉸鏈區。另一方面，IgG被劃分為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亞型。因此，本發明所述的免疫球蛋白Fe片段可以選自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4的Fe片段及其組合和雜合體組成的組。其中，在本發明中優選IgG2和IgG4亞型，最優選IgG4的Fe片段。它幾乎不具有諸如CDC等效應器功能。S卩，作為本發明的藥物載體，最優選的免疫球蛋白Fe片段是人IgG4來源的非糖基化Fe片段。本發明中所述的人內皮抑素分子是指由183個氨基酸構成的膠原蛋白XVIIIC末端區片段(氨基酸序列如圖1SEQ ID NO:1所示)，基于該片段的重組蛋白或生物活性片段。基于所述人內皮抑素分子的重組蛋白是本領域公知的，例如本發明中使用的人內皮抑素分子可以是含有His-tag的重組人內皮抑素分子。在本發明中，優選使用的人內皮抑素分子可具有如圖2所示氨基酸序列(SEQ ID N0:2)的重組人內皮抑素(rhES)。所述rhES可以由大腸桿菌表達，在這種情況下，其N末端的Met可任選地被刪除。就人內皮抑素而言，本發明所述的“生物活性片段”是指由SEQ ID NO:1所示人內皮抑素分子衍生出的任何蛋白片段，前提是該片段保留了 SEQ IDNO:1所示人內皮抑素分子70%以上，優選90%以上的抑制血管生長的活性。本發明中所述的PEG是指聚乙二醇，例如分子量2_5kDa的聚乙二醇。優選使用兩端具有醛基功能團的3.4kDa PEG(ALD-PEG-ALD)進行連接，將Fe片段與人內皮抑素組合。更優選地，一個rhES分子與一個Fe片段通過一分子PEG進行連接，兩者與PEG的連接位點均為N端。第二方面，本發明提供了所述長效人內皮抑素制劑的制備和純化方法，所述方法包括以下步驟:首先，通過PEG與人內皮抑素N端α氨基的共價結合和層析純化，制備單PEG化的人內皮抑素(rhES-PEG)。對于rhES-PEG的制備，可以在反應緩沖液中，將人內皮抑素與PEG混合，并向反應混合物中還原劑氰基硼氫化鈉進行反應。反應結束后將產物稀釋，經層析純化獲得N末端單PEG化的rhES。具體地，可以在一定pH值(如ρΗ3.5，ρΗ5.5，ρΗ6.5)的醋酸鈉反應緩沖液下，將rhES與PEG按一定的摩爾比例(如1: 5，1: 10，1: 15)混合；并向反應混合物中加入終濃度20mM的還原劑氰基硼氫化鈉；不同的時長進行反應，如lh，2h，4h，20h。優選地，使摩爾比為1: 15的rhES和PEG，在pH5.5，4°C的條件下反應lh。反應結束后將產物用醋酸鈉緩沖液稀釋，經Source S層析純化獲得N末端單PEG化的rhES。其次，通過與PEG共價結合，將Fe片段與PEG化的人內皮抑素進一步偶聯，再經過層析純化，制備所述長效人內皮抑素。在獲得rhES-PEG后，可以將其與Fe片段在緩沖液中混合，加入還原劑氰基硼氫化鈉進行反應。反應結束后將產物稀釋，經層析純化獲得經PEG連接的rhES與Fe片段。具體地，在ρΗ3.5，ρΗ5.5或ρΗ6.5的醋酸鈉緩沖液中，將rhES-PEG與Fe片段按1: 5，1: 10或1: 15的摩爾比例混合，加入終濃度20mM的還原劑氰基硼氫化鈉，并在溫和攪拌下4V反應8h，16h或24h。優選地，使摩爾比為1: 15的rhES-PEG與Fe片段，在pH5.5，4°C的條件下反應16h。反應結束后將產物用醋酸鈉緩沖液稀釋，經Source S層析純化獲得經PEG連接的rhES與Fe片段。經SDS-PAGE和HPLC對產物進行分析鑒定，該聚合物純度可達97 %以上，為rhES-PEG-Fc產物。因此，本發明成功得到了含有免疫球蛋白Fe片段作為載體的重組人內皮抑素聚合物。第三方面，本發明還提供了所述長效人內皮抑素制劑在制備用于治療癌癥的藥物中的應用。本發明的第四方面涉及使用所述長效人內皮抑素制劑治療癌癥的方法。由本發明所述的長效人內皮抑素制劑延長了人內皮抑素的半衰期、提高了人內皮抑素的穩定性和生物利用度，因此，可用于人內皮抑素治療的各種癌癥，包括但不限于乳腺癌、肺癌、直腸癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、前列腺癌、胃癌、宮頸癌、胰腺癌、食管癌、絨毛膜上皮癌、惡性葡萄胎、膀胱癌、皮膚癌、頭頸部癌、支氣管肺癌、大腸癌和白血病。優選地，所述癌癥為肺癌，最優選非小細胞肺癌。可將本發明的藥物組合物與藥學 可接受的載體組合配制成各種劑型，包括適于胃腸道或非胃腸道給藥的各種劑型。
本發明使用的“藥學可接受的載體”是指不干擾所述長效人內皮抑素的生理作用，且對包括人類在內的受試者沒有毒性的任何物質。本發明所用藥學可接受的載體為本領域技術人員已知的載體。本領域技術人員可以根據實際需要選擇適合的載體，并通過本領域已知的方法配制本發明的制齊 。所述制劑包括但不限于片齊 、溶液、懸劑、油劑、乳劑、凝膠、氣溶膠、吸入劑、噴霧、膠囊、丸劑、貼劑和栓劑等。本發明所述的長效人內皮抑素制劑在所述藥物中的劑量可以在1.5-37.5mg/m2的范圍。由于本發明所述的長效人內皮抑素制劑在體內具有很長的作用持續時間，所以可以大大降低所述藥物的給藥頻率。本發明的長效人內皮抑素制劑可以每周給藥一次，因此，提高了患者的依從性。對該產物rhES-PEG-Fc進行了體內和體外的生物學活性檢測。體外細胞學活性實驗結果表明，該聚合物rhES-PEG-Fc的抗內皮細胞遷移活性與未修飾的rhES的活性相近。Fe片段的連接基本沒有影響rhES的體外細胞學活性。藥物代謝動力學實驗結果表明，該聚合物rhES-PEG-Fc的體內半衰期為62.4h，比未修飾的rhES的體內半衰期(2.4h)提高了 26倍。藥物效應動力學實驗結果表明，rhES-PEG-Fc每周給藥1.3mg/kg和4mg/kg組,具有與每天給藥4mg/kg的rhES相似的抗腫瘤活性。上述優點表明，rhES經PEG與Fe片段連接后，半衰期顯著延長，且保持了抗內皮細胞遷移活性和抗腫瘤活性，從而能夠減少給藥劑量，降低給藥頻率。
圖1:顯示了人內皮抑素氨基酸序列SEQ ID NO:1。圖2:顯示了 N端添加 了 9個氨基酸的重組人內皮抑素的氨基酸序列SEQ ID NO:2。圖3:顯示了純化后rhES-PEG-Fc的SDS-PAGE鑒定圖。在圖3中，泳道1:非還原的rhES-PEG ;泳道2:非還原的rhES-PEG-Fc ;泳道3:非還原的Fe片段；泳道4:非還原的rhES ;泳道5:非還原的Fe片段；泳道6:還原的rhES-PEG ;泳道7:還原的rhES-PEG-Fc ;泳道8:還原的Fe片段；泳道9:還原的rhES ;泳道10:蛋白分子量標準圖4:顯示了純化后rhES-PEG-Fc的RP-HPLC純度檢測結果，其中以99.7%峰面積歸一 O圖5:顯示了 rhES和rhES-PEG-Fc的體內藥代動力學曲線。圖6:顯示了 rhES和rhES-PEG-Fc的體內抗腫瘤活性檢測。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明作進一步的說明，但不是對本發明保護范圍的限制。實施例1.rhES-PEG的制備將兩端具有醛基的3.4kDa聚乙二醇(ALD-PEG-ALD)與重組人內皮抑素rhES (來自江蘇先聲麥得津生物制藥有限公司，產品批號20100305，序列如圖2所示)以15: I的摩爾比例溶于2M醋酸鈉緩沖液中，向此混合物中加入終濃度20mM的還原劑氰基硼氫化鈉，并在溫和攪拌下于4V反應Ih，使PEG與rhES的N末端氨基連接。
采用Source S (購自 GE Healthcare, Source 15S，貨號 17-0944-03)純化反應終產物。將上述反應混合物用50mM，pH6.4的4-嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液20倍稀釋后上樣。洗脫緩沖液為含有IM NaCl的50mM MES緩沖液，采用梯度濃度洗脫。梯度為在120min內洗脫緩沖液濃度由15%過渡到45%，流速為3ml/min，獲得產物的濃度范圍是30% -40%。使用分部收集器收集樣品并經SDS-PAGE鑒定。結果表明所制得的rhES-PEG為單PEG化的rhES片段。實施例2.rhES-PEG-Fc 的制備將上述實施例1純化獲得的單PEG化rhES與免疫球蛋白Fe片段的N末端做進一步偶聯。將Fe片段(由大腸桿菌BL21 (DE3)表達的非糖基化人IgG4Fc片段，NCBI GeneID:3503。得自于北京韓美藥品有限 公司)與所述rhES-PEG以15:1的摩爾比例溶于50mM,pH5.5醋酸鈉緩沖液中，向此混合物中加入終濃度20mM的還原劑氰基硼氫化鈉，并在溫和攪拌下在4V反應16h，使所述rhES-PEG與Fe片段的N末端偶聯。采用Source S (購自 GE Healthcare, Source 15S，貨號 17-0944-03)純化反應終產物。將上述反應混合物用50mM，pH5.5的醋酸鈉緩沖液20倍稀釋后上樣。洗脫緩沖液為含有IM NaCl的50mM醋酸鈉緩沖液。采用梯度濃度洗脫。梯度為在200min內洗脫緩沖液濃度由20%過渡到50%，流速為3ml/min，獲得產物的濃度范圍是35% -45%。使用分部收集器收集樣品，從而分離得到高純度的rhES-PEG-Fc蛋白質組合物。所得產物用SDS-PAGE鑒定，結果如圖3所示。rhES_PEG_Fc的理論分子量約為74kD。Fe片段的分子量約為49kD (泳道3和泳道5)，由兩條相同的肽鏈通過二硫鍵連接形成。在所述rhES-PEG-Fc還原型電泳中，將Fe片段內的二硫鍵被打開后應顯示兩個條帶:其中一個條帶為連接了 rhES-PEG的單鏈Fe條帶，分子量約為49kD，另一條為單鏈Fe約25kD的條帶(參見泳道7)。圖3中顯示了所述rhES-PEG-Fc在非還原型電泳中表現為分子量約74kD的單個條帶(參見泳道2)。因此，本發明成功制備了 rhES-PEG-Fc。此外，還對所得rhES-PEG-Fc終產物進行了反相HPLC分析，所用儀器為安捷倫1200型，配備C4色譜柱(Vydac 214TP)，梯度為在50min內由5%水/95%乙腈過渡到95%水/5%乙腈，流速為lml/min，柱溫設為60°C。所得典型HPLC譜圖如圖4所示，主峰峰面積占97 %以上，表明所得rhES_PEG_Fc具有很高的純度。實施例3.rhES-PEG-Fc的體外抗血管內皮細胞遷移活性的測定本實施例中檢測了本發明所述的rhES-PEG-Fc對人微血管內皮細胞(HMVEC)的抗遷移活性。將處于對數生長期的HMVEC細胞(購自ATCC，貨號CRL-4025)饑餓過夜后，接種8 XlO4個細胞于檢測細胞遷移的培養皿Transwell(購自Corning公司，貨號為3422)中。Transwell培養皿是一種帶有通透性支持物的培養小室，小室底層為一張有通透性的膜，即通透性支持物。本實施例中采用的是帶有孔徑8.0 μ m的PC膜的Transwell培養皿。分別設陰性對照組(N.C.組，無血清培養基DMEM)，陽性對照組(P.C.組，添加2%胎牛血清FBS和10ng/ml血管內皮生長因子VEGF)和兩組加藥組(在陽性對照組的基礎上分別添加rhES或按照本發明實施例2制備的rhES-PEG-Fc，加藥濃度為2.5,5,10，20，40，80，160 μ g/ml。rhES-PEG-Fc組按其所含rhES的量進行計算)。將各組的細胞在37°C孵育4h。隨后，取出培養皿，用4%聚甲醛固定細胞15min，刮掉Transwell膜上層的未遷移細胞，用結晶紫對下層細胞染色。最后利用顯微鏡在相同大小視野下計數細胞，計算半數抑制濃度ED5tlt5計算結果顯示，rhES的 ED50 為 36.7 μ g/ml, rhES-PEG-Fc 的 ED50 為 37.3 μ g/ml。因此，本發明的rhES-PEG-Fc保持了 rhES的98.4%的抗內皮細胞遷移活性。實施例4.rhES-PEG-Fc的藥代動力學研究 本實施例檢測了本發明的rhES-PEG-Fc在大鼠體內的半衰期。將10只雄性SD大鼠(購自北京華阜康生物科技股份有限公司，6-8周，180_220g/只)隨機分成2組，按4.5mg/kg體重皮下給藥。A組為rhES，B組為按照本發明實施例2制備的 rhES-PEG-Fc。在給藥后5min、15min、0.5h、lh、l.5h、2h、3h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、192h、288h取血，血樣以肝素抗凝，3000rpm離心15min，得到血漿樣品凍存于_80°C，待測。
根據廠商的說明，使用人內皮抑素Quantikine酶聯免疫試劑盒(購自R&DSystems，貨號DNST0)通過ELISA夾心法測定血漿中樣品的rhES含量。結果見圖5。rhES的半衰期T1/2為2.4h，濃度-時間曲線下面積AUC為8.61 μ g.Vml，達到最大濃度的時間Tmax為1.63h，最大濃度Cmax為2026.15ng/ml。與rhES相比，rhES-PEG-Fc的體內半衰期 T1/2 為 62.4h，AUC 為 894.05 μ g.h/ml，Tmax 為 24.00h, Cmax 為 6644.33ng/ml。由以上試驗結果可見，與rhES相比，本發明rhES-PEG-Fc的體內半衰期提高了 26倍。并且，根據所測定的AUC數據，本發明rhES-PEG-Fc的生物利用度比rhES提高了 100倍以上。實施例5.rhES-PEG-Fc的體內抗腫瘤活性研究本實施例中測試了本發明的rhES-PEG-Fc對人肺癌細胞A549的體內抑制活性。實驗材料選用雌性BALB/c裸鼠(購自北京大學醫學部實驗動物部，6_8周，18-25g/只)，分別接種2 X IO6個人肺癌細胞A549 (購自ATCC，貨號CCL-185)于裸鼠左側胸腔內。待瘤體積長至100-300mm3時，進行隨機分組，8只/組，并開始給藥。分別設定陰性對照組(醋酸鈉緩沖液，NaAC)、陽性對照組(rhES 4mg/kg體重，每天給藥，連續給藥14天)、兩組給藥組(以按照本發明實施例2制備的rhES-PEG-Fc分別給藥1.3mg/kg和4mg/kg體重,每周給藥一次,連續給藥兩周。按rhES-PEG-Fc中所含rhES的量進行計算)。給藥方式為皮下注射。自給藥日起每天測量腫瘤體積直至第28天，計算公式為:腫瘤體積(mm3) = (aXb2)/2(a為腫瘤的長徑，b為腫瘤的短徑)。結果見圖6。實驗結果顯不:rhES-PEG-Fc每周給藥1.3mg/kg和4mg/kg組,具有與陽性對照組(每天給藥rhES 4mg/kg)相似的抗腫瘤活性。本發明rhES-PEG-Fc的可大大降低用藥劑量，同時保持同樣的抗腫瘤效應。由此可見，本發明提供了完全保持了 rhES的抗內皮細胞遷移活性，并且具有更好穩定性和生物利用度和更長體內半衰期的rhES-PEG-Fc，從而大大降低用藥劑量。以上說明書提到的全部出版物均通過引用并入本文。盡管已參照具體優選實施方式描述了本發明，但是應該理解所主張的發明不僅限于所述具體實施方式
。實際上，用于實施本發明的所述模式的各種修改對于生物化學和生物工程或相關領域的技術人員來說都是顯而易見的， 均應落入本發明權利要求書的范圍。
權利要求
1.一種長效人內皮抑素，其特征在于，所述長效人內皮抑素是通過聚乙二醇與免疫球蛋白Fe片段共價連接的人內皮抑素分子。
2.如權利要求1所述的長效人內皮抑素，其特征在于:所述免疫球蛋白Fe片段是非糖基化的。
3.如權利要求1或2所述的長效人內皮抑素，其特征在于:所述免疫球蛋白Fe片段是IgG4的Fe片段。
4.如權利要求1 3中任一項所述的長效人內皮抑素，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量為2 5kDa。
5.如權利要求1 4中任一項的長效人內皮抑素，其特征在于，所述聚乙二醇分子兩端具有醛基功能基團。
6.如權利要求5中所 述的長效人內皮抑素，其特征在于，所述聚乙二醇分子是兩端具有醛基功能團的3.4kDa聚乙二醇。
7.權利要求1-6中任一項所述的長效人內皮抑素，其特征在于:所述藥物組合物是通過聚乙二醇將人內皮抑素的N端α氨基與免疫球蛋Fe片段的N端通過共價鍵連接。
8.權利要求1-7中任一項所述的長效人內皮抑素在制備用于治療癌癥的藥物中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其中所述癌癥是肺癌。
10.如權利要求9所述的應用，其中所述癌癥是非小細胞肺癌。
全文摘要
本發明涉及一種長效人內皮抑素。所述長效人內皮抑素是通過聚乙二醇與免疫球蛋白Fc片段共價連接的人內皮抑素分子。本發明還公開了所述長效人內皮抑素的制備和純化方法，以及所述長效人內皮抑素在制備用于治療癌癥的藥物中的應用。
文檔編號C07K17/08GK103172745SQ20111043322
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月21日 優先權日2011年12月21日
發明者張世奇, 劉家望, 杜伯雨, 馬玉芬, 楊亞平, 李永平, 周筠, 連忠輝, 文圣煥 申請人:北京韓美藥品有限公司