專利名稱：一種高分子量魷魚皮膠原蛋白的制備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術中蛋白質材料領域，尤其是涉及一種高分子魷魚皮膠原蛋白的制備方法。
背景技術：
膠原蛋白是一類重要的結構蛋白，廣泛存在于多細胞動物的骨骼、表皮和肌腱等支持組織中，由于其具有弱抗原性、良好的組織相容性、凝膠型、增稠性、乳化性和水合性，膠原蛋白及其水解產物在醫療保健、美容、食品及日用化工等領域具有廣泛的用途及良好的應用前景，而目前的商用膠原蛋白通常是來源于含有結締組織的屠宰動物，近年來瘋牛病、口蹄疫、禽流感等疾病的出現，使得陸生動物來源的膠原蛋白在應用方面受到了極大限制，而海洋動物含有豐富的膠原蛋白，具有很大的開發潛力。魷魚作為我國一種主要的水產加工原料，加工過程中約有35%的頭、足、內臟、表皮等副產物產生，其中魷魚皮占8-13%，而魷魚皮中膠原蛋白含量約為其干重的70-80%。對于這些副產物的處理，一般企業采用掩埋丟棄的方法或者簡單加工做成飼料，這不僅造成資源的極大浪費，更嚴重的是直接導致環境污染，因此魷魚皮膠原蛋白的開發和應用已引起廣泛重視。例如，中國專利申請公布號CN102217699A，申請公布日:2011年10月19日，公開了一種魷魚皮蛋白活性肽的制備方法，將魷魚皮洗凈剪成塊狀，加入NaOH水溶液浸泡2 8 d進行脫色，再經水洗至pH中性；加入0&(011)2溶液浸泡2 4 d進行固色，再經水洗至pH中性；在55 75°C的pH中性水中處理0.5 1.5 h過濾，除去不溶性蛋白，提取得到魚皮蛋白液；最后，將該液于110-121°C高壓處理30 120 min，即得魷魚皮蛋白活性肽。用該方法制備的魷魚皮膠原蛋白之間分子量大小差距甚遠，由于低分子量的魷魚皮膠原蛋白制備的生物醫學材料脆性較大，抗拉強度較低，應用于生物醫學材料方面時受到很大限制，若均用于生物醫學材料方面，會導致魷魚皮膠原蛋白的整體利用水平不高，因此制備對于力學性能要求較高的生物醫學材料的高分子量魷魚皮膠原蛋白，對于提高膠原蛋白的利用水平具有重要意義。
發明內容
本發明的目的是為了克服目前技術制備的魷魚皮膠原蛋白之間分子量大小差距甚遠，若用于生物醫學材料會導致魷魚皮膠原蛋白利用水平不高的缺點，提供一種適用于制備具有較高抗拉強度的生物醫學材料的高分子量魷魚皮膠原蛋白制備方法。為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案
一種高分子量魷魚皮膠原蛋白的制備方法，所述的制備方法包括下列步驟
a.將魷魚皮解凍后用清水清洗干凈并搗碎。原料魷魚皮一般都為冷凍狀態，需要解凍，清洗以除去原料表面的部分色素、粘液等雜質，搗碎能增加魷魚皮的體表面積，使其與溶液充分接觸；
b.加入NaOH溶液在4-1(TC下浸泡24-30 h。NaOH溶液浸泡以去除雜蛋白，而在溫度4-10°C時蛋白質較為穩定，溫度過高蛋白質會變性；
c.再加入正丁醇溶液，攪拌16-24h，用蒸餾水洗滌至pH為中性后浙干。丁醇溶液用 于脫脂，正丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強，正丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內不會引起酶的變性失活，另外，丁醇提取法的PH及溫度選擇范圍較廣；
d.浙干后的魷魚皮中加入蒸餾水，攪拌均勻，加入蛋白酶對魷魚皮進行酶法水解。化學法水解以酸或堿斷開蛋白質肽鍵，由于反應環境較極端，不利于活性的保持，而酶法水解相對于化學法水解，安全性更高，在溫和條件下進行定位水解，水解過程也比較容易控制；
e.選用分子截留量為100kd的超濾膜對酶解液進行超濾。超濾是利用高壓力或離心力，使水和其他小的溶質分子通過超濾膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的超濾膜截留不同分子量的蛋白質，選擇分子截留量為100 kd的超濾膜便可截留分子量為100 kd以上的高分子膠原蛋白，而分子量為100 kd以下的膠原蛋白則通過超濾膜留在濾液中，若選用截留分子量為100 kd以上的超濾膜，截留的高分子量膠原蛋白量較少，選用截留分子量100 kd以下的超濾膜，截留的膠原蛋白中又含有小分子量膠原蛋白，超濾成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優點；
f.收取步驟e中超濾膜上的截留物，冷凍干燥后便得到高分子量魷魚皮膠原蛋白。冷凍干燥既能防止膠原蛋白變質，又能保持膠原蛋白的天然結構和特性。作為優選，步驟b中所加NaOH溶液的濃度為0. 1-0. 5mol/L，每克魷魚皮加30-50ml的NaOH溶液，NaOH的濃度過高會使蛋白質會變性，NaOH溶液的濃度為0. 1-0. 5 mol/L為優選濃度范圍。作為優選，正丁醇溶液中的正丁醇體積百分含量為10%_15%，每克魷魚皮加30-50ml的正丁醇溶液。正丁醇溶液濃度過高會使蛋白質變性。作為優選，步驟d中每克魷魚皮加10-20 ml的蒸餾水，所述的蛋白酶由枯草桿菌中性蛋白酶和胃蛋白酶組成，所述的酶法水解為先加入為魷魚皮重量1%_3%的枯草桿菌中性蛋白酶，在4-10°C下酶解6-10 h，再用鹽酸調節PH為1-1. 5，加入魷魚皮重量3%-5%的胃蛋白酶，在溫度4-10°C下繼續酶解16-20 h，酶解后在90-100°C下滅酶5-10 min。先用枯草桿菌中性蛋白酶在PH為中性時進行初步水解，再用胃蛋白酶，用鹽酸調節PH值為I至I. 5后，進行完全酶解，采用組合酶，可使魷魚皮達到最佳的酶解效果，由于4-10°C時蛋白質較為穩定，而胃蛋白酶的最佳分解溫度在40°C，若溫度過高蛋白質會發生變性，因此需要提高酶解時間來保證魷魚皮的完全酶解。作為優選，對步驟e中的濾液進行鹽析沉淀，將沉淀物進行冷凍干燥便得到 低分子量魷魚皮膠原蛋白。對濾液進行鹽析沉淀后冷凍干燥，可回收得到分子量在
IOOkd以下的小分子量膠原蛋白，從而提高魷魚皮膠原蛋白的利用水平。作為優選，所述的鹽析沉淀為先用氨水濾液pH為4-6，再在濾液中加入中性鹽直至其濃度為2-2. 5 mol/L。使魷魚皮膠原蛋白鹽析沉淀，由于各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉淀，不僅操作簡單，且成本也較低。作為優選，所述的中性鹽為硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉、氯化鉀或氯化銨。最優選為硫酸銨，硫酸銨溫度系數小而溶解度大，25°C時飽和溶液為4. 1M，即767克/升；(TC時飽和溶解度為3. 9M，即676克/升，在這一溶解度范圍內，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來，另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性，若需要保證魷魚皮膠原蛋白的純度，還可對膠原蛋白在用鹽析沉淀分離后進行透析，以除去膠原蛋白中的鹽。
本發明得到的高分子量魷魚皮膠原蛋白，通過測定其經交聯所形成的生物材料中的膠原海綿的力學性能，分別與本發明中的濾液鹽析得到的低分子量魷魚皮膠原蛋白，以及直接用鹽析得到的魷魚皮膠原蛋白所交聯形成的膠原海綿的力學性能相比，明顯具有較大的斷裂強度和較高斷裂拉伸率，說明用高分子膠原蛋白所交聯形成的膠原海綿具有較高的抗拉強度和較好的韌性，具有良好的力學性能。
因此，本發明具有如下有益效果
(1)超濾得到的高分子膠原蛋白制備生物醫學材料力學性能好；
(2)通過超濾膜截留高分子量的膠原蛋白，再將其冷凍干燥，制備工 藝及步驟簡單；
(3)將濾液進行鹽析沉淀，回收低分子量膠原蛋白，提高魷魚皮的利用 水平；
(4 )用魷魚皮提取制備膠原蛋白，既提升了其利用價值，又減少了對環 境的污染程度。
具體實施例方式下面結合具體的實施方式對本發明做進一步的描述。對比例
取0. 4 Kg魷魚皮解凍后用清水清洗干凈并搗碎，按每克魷魚皮加0. lmol/L NaOH溶液30 ml共加入12 L NaOH溶液，在4°C下浸泡24 h，再按每克魷魚皮加入30 ml體積百分含量為10%的正丁醇溶液加入12 L正丁醇溶液，攪拌16 h后浙干，浙干后的魷魚皮中按每克魷魚皮加10 ml的蒸餾水加入4 L蒸餾水，加入為魷魚皮重量0. 1%的枯草桿菌中性蛋白酶0. 4g，在4°C時酶解6 h，再用鹽酸調節PH為I后加入為魷魚皮重量0. 3%的胃蛋白酶I. 2g，在溫度4°C時繼續酶解16 h，酶解后在100°C下滅酶5 min，先用氨水將調節酶解液pH調至4，再在酶解液中加入硫酸銨直至其濃度為2 mol/L,使魷魚皮膠原蛋白鹽析沉淀，最后將沉淀物冷凍干燥，則得到高分子量、低分子量混合的膠原蛋白凍干品。實施例I
取0.4 Kg魷魚皮解凍后用清水清洗干凈并搗碎，按每克魷魚皮加30 ml 0. lmol/LNaOH溶液加入12L NaOH溶液，在4°C下浸泡24h，再按每克魷魚皮加入30 ml體積百分含量為10%的正丁醇溶液加入12L正丁醇溶液，攪拌16 h后浙干，浙干后的魷魚皮中按每克魷魚皮加IOml的蒸餾水加入4L蒸餾水，加入為魷魚皮重量0. 1%的枯草桿菌中性蛋白酶0. 4g，在4°C時酶解6 h，再用鹽酸調節PH為I后加入為魷魚皮重量0. 3%的胃蛋白酶I. 2g，在溫度4°C時繼續酶解16 h，選用分子截留量為IOOkd的超濾膜對酶解液進行離心超濾，用氨水將濾液PH調至4，再在濾液中加入硫酸銨直至其濃度為2 mol/L，使魷魚皮膠原蛋白鹽析沉淀，最后將濾膜上的過濾物和鹽析沉淀后的沉淀物分別冷凍干燥，則得到分子量在IOOkd以上的高分子量膠原蛋白凍干品和分子量在IOOkd以下的低分子量膠原蛋白凍干品。實施例2 取0.4Kg魷魚皮解凍后用清水清洗干凈并搗碎，按每克魷魚皮加40 ml 0.3 mol/LNaOH溶液加入16 L NaOH溶液，在5°C下浸泡28h，再按每克魷魚皮加入40 ml體積百分含量為10%的正丁醇溶液加入16L正丁醇溶液，攪拌18 h后浙干，浙干后的魷魚皮中按每克魷魚皮加15ml的蒸餾水加入6 L蒸餾水，加入為魷魚皮重量0. 2%的枯草桿菌中性蛋白酶0. 8g，在7°C時酶解8 h，再用鹽酸調節PH為I. 2后加入為魷魚皮重量0.4%的胃蛋白酶1.6g，在溫度TC時繼續酶解18 h，選用分子截留量為IOOkd的超濾膜對酶解液進行離心超濾，用氨水將濾液PH調至3，再在濾液中加入磷酸鈉直至其濃度為2. 3 mol/L，使魷魚皮膠原蛋白鹽析沉淀，最后將濾膜上的過濾物和鹽析沉淀后的沉淀物分別冷凍干燥，則得到分子量在100kd以上的高分子量膠原蛋白凍干品和分子量在100 kd以下的低分子量膠原蛋白凍干品。實施例3
取0.4 Kg魷魚皮解凍后用清水清洗干凈并搗碎，按每克魷魚皮加0.5 mol/L NaOH溶液50 ml加入20 L NaOH溶液，在10°C下浸泡30 h，再按每克魷魚皮加入50 ml體積百分含量為10%的正丁醇溶液加入20 L正丁醇溶液，攪拌24 h后浙干，浙干后的魷魚皮按每克魷魚皮加20ml的蒸餾水，加入8 L蒸餾水，加入魷魚皮重量0. 3%的枯草桿菌中性蛋白酶I. 2g，在10°C時酶解10 h，再用鹽酸調節PH為I. 5后加入魷魚皮重量0.5%的胃蛋白酶2.0 g，在溫度10°C時繼續酶解20 h，選用分子截留量為100 kd的超濾膜對酶解液進行離心超濾，用氨水調節濾液PH為5，再在濾液中加入氯化鈉直至其濃度為2. 5 mol/L，使魷魚皮膠原蛋白鹽析沉淀，最后將濾膜上的過濾物和鹽析沉淀后的沉淀物分別冷凍干燥，則得到分子量在100 kd以上的高分子量膠原蛋白凍干品和分子量在100 kd以下的低分子量膠原蛋白凍干品。將上述得到的分子量100 kd以上的高分子量膠原蛋白凍干品和分子量IOOkd以下的低分子量膠原蛋白凍干品分別溶于0. 5 mol/L醋酸中，配成質量分數為2%的膠原溶液，再分別取膠原溶液5 ml，加入質量百分比為0. 25%的戊二醛lmL，充分搖勻后注入培養皿里，在室溫下交聯12 h后在-80°C冷凍18 h，制成生物醫學材料中的膠原海綿，取出冷凍成型的膠原海綿，放到冷凍干燥機中在-56°C下干燥10 h后取出，取25 mmX5 mm大小的材料樣品，用QX-W400萬能拉力試驗機，選用A / T G探頭，采用拉伸模式，測前速度Imm /s，測試速度2 mm / s，測后速度1_ / S，最小感應力5 g，分別檢測其力學性能，得到的斷裂強度和斷裂拉伸率如表I所示。表I不同分子量膠原蛋白制成的膠原海綿力學性能比較
權利要求
1.ー種高分子量魷魚皮膠原蛋白的制備方法，其特征是，所述的制備方法包括下列步驟 a.將魷魚皮解凍后用清水清洗干凈并搗碎； b.加入NaOH溶液在4-10°C下浸泡24-30h ； c.再加入正丁醇溶液，攪拌16-24h,用蒸餾水洗滌至pH為中性后浙干； d.浙干后的魷魚皮中加入蒸餾水，攪拌均勻，加入蛋白酶對魷魚皮進行酶法水解； e.選用分子截留量為100kd的超濾膜對酶解液進行超濾； f.收取步驟e中超濾膜上的截留物，冷凍干燥后便得到高分子量魷魚皮膠原蛋白。
2.根據權利要求I所述的制備方法，其特征是，步驟b中所加NaOH溶液的濃度為O.1-0. 5 mol/L，每克魷魚皮加30-50 ml的NaOH溶液。
3.根據權利要求I或2所述的制備方法，其特征是，步驟c中正丁醇溶液中的正丁醇體積百分含量為10%-15%，每克魷魚皮加30-50 ml的正丁醇溶液。
4.根據權利要求I所述的制備方法，其特征是，步驟d中每克魷魚皮加10-20ml的蒸餾水，所述的蛋白酶由枯草桿菌中性蛋白酶和胃蛋白酶組成，所述的酶法水解為先加入為魷魚皮重量1%_3%的枯草桿菌中性蛋白酶，在4-10°C下酶解6-10 h，再用鹽酸調節PH為1-1. 5，加入魷魚皮重量3%-5%的胃蛋白酶，在溫度4-10°C下繼續酶解16-20 h，酶解后在90-100°C下滅酶 5-10 min。
5.根據權利要求I所述的制備方法，其特征是，對步驟e中的濾液進行鹽析沉淀，將沉淀物進行冷凍干燥便得到低分子量魷魚皮膠原蛋白。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征是，所述的鹽析沉淀為先用氨水調節濾液pH為4-6，再在濾液中加入中性鹽直至其濃度為2-2. 5 mol/L，使魷魚皮膠原蛋白鹽析沉淀。
7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征是，所述的中性鹽為硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉、氯化鉀或氯化銨。
全文摘要
本發明公開了一種高分子量魷魚皮膠原蛋白的制備方法，步驟包括將魷魚皮解凍后用清水洗凈并搗碎；加入NaOH溶液進行浸泡；加入正丁醇溶液，攪拌,用蒸餾水洗滌至PH為中性后瀝干；瀝干后的魷魚皮中加入蒸餾水，攪拌均勻，加入蛋白酶對魷魚皮進行酶法水解；選用分子截留量為100kd的超濾膜對酶解液進行超濾；收取超濾膜上的過濾物，冷凍干燥后便得到高分子量魷魚皮膠原蛋白。通過本發明得到的高分子膠原蛋白所制備的生物醫學材料力學性能好；本發明具有工藝步驟簡單，且能回收低分子量膠原蛋白，提高了魷魚皮的整體利用水平，既能提升魷魚皮的利用價值，又能減少對環境的污染程度等優點。
文檔編號C07K1/36GK102676620SQ20111042774
公開日2012年9月19日 申請日期2011年12月20日 優先權日2011年12月20日
發明者付萬冬, 廖妙飛, 楊會成, 王維倫, 鄭斌, 鐘明杰 申請人:浙江省海洋開發研究院