專利名稱：耐熱菌的鼠源多克隆抗體的制備方法
技術領域：
本發明涉及食品微生物檢測領域，具體涉及到耐熱菌的鼠源多克隆抗體的制備及
純化鑒定。
背景技術：
耐熱菌，學名酸土環脂芽孢桿菌(AliyclcAacillua acidoterrestris)，是果汁生產中的常見危害菌，由于其耐熱耐酸特性，能夠經受酸性果汁加工中的巴氏殺菌過程而存活，在產品貯藏期，當處于休眠狀態的芽孢在適宜溫度條件下，就會迅速增殖引起果汁敗壞，嚴重影響果汁的質量安全。因此，耐熱菌是濃縮果汁生產中最重要的目標控制微生物之一。關于果汁中耐熱菌的檢測，目前主要分為以下三類傳統的平板培養計數法、基于遺傳物質檢測的PCR法和基于免疫學的快速檢測方法。目前，生產企業多采用傳統平板培養計數法檢測耐熱菌，平板培養計數法最大的缺點是耗時長，一般檢測周期為4 5天。PCR法具有快速、特異的優點，但對設備、實驗室條件以及操作人員要求高，步驟較繁鎖，推廣應用有一定困難。基于免疫分析原理的酶聯免疫快速檢測技術，具有特異性強、靈敏度高、重復性好、檢測設備及實驗條件易達到等優點，而建立該檢測方法的關鍵在于獲得高效價、高特異性的抗體。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供一種操作簡便、特異性強、成本低廉的耐熱菌的鼠源多克隆抗體的制備方法。解決上述技術問題所采用的技術方案是它由下述步驟組成1、制備耐熱菌菌懸液將耐熱菌標準菌株(A. acidoterrestris DSM 3922)轉接至250mL的402培養基， 置于45°C氣浴中振蕩培養8小時，轉接至凱氏培養基，41°C培養M小時，用無菌生理鹽水沖洗凱氏培養基上培養的耐熱菌，將沖洗下的耐熱菌移至無菌三角錐瓶中充分混勻，3500 5000轉/分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀用生理鹽水洗滌3次，向沉淀中加入無菌生理鹽水，稀釋成濃度為1. 4X IO8 4X 109CFU/mL的耐熱菌菌懸液。2、耐熱菌免疫SD大鼠將步驟1中制備的耐熱菌菌懸液與免疫佐劑按等體積混合，超聲振蕩至充分乳化，通過背部肌肉多點注射免疫雄性SD大鼠，免疫原體積為0. 5 1. 5mL/只，首次免疫采用弗氏完全佐劑，然后用弗氏不完全佐劑進行追加免疫，每次免疫的時間間隔為兩周，免疫 63 91天摘除眼球采血，制備成耐熱菌的鼠源多克隆抗血清。3、飽和硫酸銨沉淀法分離抗體向步驟2制備的耐熱菌的鼠源多克隆抗血清中加入無菌生理鹽水，逐滴加入pH值為8. 0的飽和硫酸銨水溶液，耐熱菌的鼠源多克隆抗血清與無菌生理鹽水、飽和硫酸銨水溶液的體積比為1 1 2，充分搖勻，4°C靜置12小時，12000 20000轉/分鐘離心20
3分鐘，棄去上清液，所得沉淀用生理鹽水溶解，裝入透析袋中透析除鹽。4、G蛋白親和層析純化抗體向透析后的耐熱菌的鼠源多克隆抗體中加入0. lmol/L pH值為9. 0的Tris-HCl 緩沖液，調節耐熱菌的鼠源多克隆抗體的PH值至8. 0，用G蛋白親和層析柱分離，上樣量與柱體積之比為2 1，流速為ImL/分鐘，上樣完成后用0. lmol/L pH值為8. 0的磷酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白至基線穩定，用0. lmol/L pH值為3. 0的檸檬酸緩沖液洗脫結合的耐熱菌的鼠源多克隆抗體，分別收集雜蛋白和耐熱菌的鼠源多克隆抗體，收集的耐熱菌的鼠源多克隆抗體裝入透析袋中透析除檸檬酸根離子，透析后的耐熱菌的鼠源多克隆抗體用平均分子量為6000的聚乙二醇濃縮至與上樣量體積相同。本發明的耐熱菌免疫SD大鼠步驟2中，優選將步驟1中制備的濃度為2X109CFU/ mL的耐熱菌菌懸液與免疫佐劑按等體積混合，超聲振蕩至充分乳化，通過背部肌肉多點注射免疫雄性SD大鼠，注射體積為ImL/只，首次免疫采用弗氏完全佐劑，然后用弗氏不完全佐劑進行4次追加免疫，每次免疫的時間間隔為兩周，免疫63天摘除眼球采血，制備成耐熱菌的鼠源多克隆抗血清。本發明制備的耐熱菌的鼠源多克隆抗體效價可達到12800，特異性良好，與常見食源性微生物無交叉反應，經電泳鑒定有較高純度。本發明方法簡單，成本低，可用于建立耐熱菌免疫化學檢測方法。
圖1是純化前后耐熱菌鼠源多克隆抗體的SDS-PAGE電泳圖譜。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明不限于這些實施例。實施例11、制備耐熱菌菌懸液將耐熱菌標準菌株(A. acidoterrestris DSM 3922)轉接至250mL的402培養基， 置于45°C氣浴中振蕩培養8小時，轉接至凱氏培養基，41°C培養M小時，用無菌生理鹽水沖洗凱氏培養基上培養的耐熱菌，將沖洗下的耐熱菌移至無菌三角錐瓶中充分混勻，3500轉 /分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀用生理鹽水洗滌3次，向沉淀中加入無菌生理鹽水，稀釋成濃度為2X 109CFU/mL的耐熱菌菌懸液。2、耐熱菌免疫SD大鼠將2mL耐熱菌菌懸液、2mL免疫佐劑混合均勻，超聲振蕩至充分乳化，通過背部肌肉多點注射免疫雄性SD大鼠，免疫原體積為ImL/只，首次免疫采用弗氏完全佐劑，然后用弗氏不完全佐劑進行4次追加免疫，每次免疫的時間間隔為兩周，免疫63天摘除眼球采血， 制備成耐熱菌的鼠源多克隆抗血清。3、飽和硫酸銨沉淀法分離抗體取步驟2制備的耐熱菌的鼠源多克隆抗血清2mL，加入2mL無菌生理鹽水，逐滴加入PH值為8.0的飽和硫酸銨水溶液4mL，耐熱菌的鼠源多克隆抗血清與無菌生理鹽水、飽和硫酸銨水溶液的體積比為1:1:2，充分搖勻，4°C靜置12小時，12000轉/分鐘離心20分鐘，棄去上清液，所得沉淀用生理鹽水溶解，裝入透析袋中透析除鹽。4、G蛋白親和層析純化抗體向2mL透析后的耐熱菌的鼠源多克隆抗體中加入0. lmol/L pH值為9.0的 Tris-HCl緩沖液，調節耐熱菌的鼠源多克隆抗體的pH值至8. 0，用體積為ImL的G蛋白親和層析柱分離，上樣量為2mL、流速為ImL/分鐘，上樣完成后用0. lmol/L pH值為8. 0的磷酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白至基線穩定，用0. lmol/L pH值為3. 0的檸檬酸緩沖液洗脫結合的耐熱菌的鼠源多克隆抗體，分別收集雜蛋白和耐熱菌的鼠源多克隆抗體，收集的耐熱菌的鼠源多克隆抗體裝入透析袋中透析除檸檬酸根離子，透析后的耐熱菌的鼠源多克隆抗體用平均分子量為6000的聚乙二醇濃縮至2mL。實施例2在實施例1的制備耐熱菌菌懸液步驟1中，將沉淀用無菌生理鹽水稀釋成濃度為1. 4X 108CFU/mL的耐熱菌菌懸液；在耐熱菌免疫SD大鼠步驟2中，將2mL濃度為 1. 4 X 108CFU/mL的耐熱菌菌懸液與2mL免疫佐劑混合均勻，超聲振蕩至充分乳化，通過背部肌肉多點注射免疫雄性SD大鼠，免疫原體積為1. 5mL/只，首次免疫采用弗氏完全佐劑，然后用弗氏不完全佐劑進行5次追加免疫，每次免疫的時間間隔為兩周，免疫77天摘除眼球采血，制備成耐熱菌的鼠源多克隆抗血清。其他步驟與實施例1相同。實施例3在實施例1的制備耐熱菌菌懸液步驟1中，將沉淀用無菌生理鹽水稀釋成濃度為 4X 109CFU/mL的耐熱菌菌懸液；在耐熱菌免疫SD大鼠步驟2中，將2mL濃度為4X IO9CFU/ mL的耐熱菌菌懸液與2mL免疫佐劑混合均勻，超聲振蕩至充分乳化，通過背部肌肉多點注射免疫雄性SD大鼠，免疫原體積為0. 5mL/只，首次免疫采用弗氏完全佐劑，然后用弗氏不完全佐劑進行6次追加免疫，每次免疫的時間間隔為兩周，免疫91天摘除眼球采血，制備成耐熱菌的鼠源多克隆抗血清。其他步驟與實施例1相同。為了確定本發明的最佳工藝條件，發明人進行了大量的實驗室研究試驗，每種實驗重復三次，實驗結果為三次重復試驗的平均值，各種試驗情況如下試驗材料與試劑耐熱菌標準菌株(A. acidoterrestris DSM 3922)，購自德國菌種保藏中心；大腸桿菌(Escherichia coli ATCC8739)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis ATCC6633)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus ATCC 11778)、黑曲霉(Bacillus subtilis ATCC16404)及金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC6538)，由陜西師范大學生命科學學院微生物實驗室提供；辣根過氧化物酶標山羊抗大鼠抗體(Jackson ImmunoResearch)進口分裝；TMB(3，3’ 5,5'-四甲基聯苯胺)，由廣州沃凱化工廠提供；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，均購自Sigma公司。試驗儀器Hitrap Protain G HP由GE Healthcare生產；恒流泵由上海滬西分析儀器廠有限公司生產；電泳儀由北京君意東方電泳設備有限公司生產；垂直平板凝膠電泳槽由北京六一儀器廠生產；BX41-12P02奧林巴斯顯微鏡，由澤仕光電科技(上海)有限公司生產；UNICO WFJ2000型可見分光光度計，由上海龍尼柯儀器有限公司生產；U-3010型紫外可見分光光度計，由日本HITACHI公司生產；GSP-9080-MBE型隔水式恒溫培養箱，由上海博訊實業有限公司醫療設備廠生產；TGL-16G型臺式離心機，由上海安亭科學儀器廠生產； Sff-CJ-IF型超凈操作臺，由蘇凈集團安泰公司生產；HHW-21⑶-600型電熱恒溫水槽，由上海福瑪實驗設備有限公司生產；XW-80A漩渦混合儀，由海門市其林貝爾儀器制造有限公司生產；KQ3200B型超聲波清洗機，由昆山市超聲儀器有限公司生產；TDL-4型離心機，由上海醫用分析儀器廠生產；伯樂680型酶標儀，由美國伯樂公司生產；微孔板振蕩器，由杭州奧盛儀器有限公司生產；D25mm透析袋，由北京鼎國生物技術有限公司；德國Eppendorf精密微量移液器(10 100 μ L，0. 1 10 μ L，30 300 μ L)。1、確定免疫體積分別將濃度為2Χ 1010CFU/mL,8X 109CFU/mL,4X 109CFU/mL,2X 109CFU/mL, 1.4 X 108CFU/mL的耐熱菌菌懸液與免疫佐劑等體積混合均勻，超聲振蕩至充分乳化，通過背部肌肉多點注射免疫雄性SD大鼠，注射體積分別為0. ImL/只、0. 25mL/只、0. 5mL/只、 1. OmL/只、1. 5mL/只，首次免疫采用弗氏完全佐劑，然后用弗氏不完全佐劑進行4次追加免疫，每次免疫的時間間隔為兩周，每次免疫1周后眼眶采血。采用ELISA法測定效價，具體測定方法如下(1)將耐熱菌標準菌株轉接至250mL的402培養基，置于45°C氣浴中振蕩培養 8小時，轉接至凱氏培養基，41°C培養M小時，用無菌生理鹽水沖洗凱氏培養基上培養的耐熱菌，將沖洗下的耐熱菌移至無菌三角錐瓶中充分混勻，離心分離，棄去上清液，沉淀用 0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖液稀釋成濃度為107CFU/mL的耐熱菌菌懸液，向酶標板孔內加耐熱菌菌懸液，每孔加入100 μ L，置于烘箱中60°C包被2小時，用吐溫-20的質量分數為0. 05%的0. 01mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液沖洗酶標板3次，每次5分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干。(2)向酶標板孔內每孔加入200μ L質量分數為5%的脫脂乳，置于恒溫箱中37°C 保溫封閉2小時，用吐溫-20的質量分數為0. 05%的0. 01mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液沖洗酶標板3次，每次5分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干。(3)將待測抗體以 1 100、1 200、1 400、1 800、1 1600、1 3200、 1 6400、1 12800、1 25600、1 51200、1 102400、1 204800 梯度稀釋，每個樣品按照以上稀釋度各加入酶標板的一行，同時設定陰性對照和空白對照，陰性對照為正常的大鼠血清，空白對照為0. 01mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，37°C孵育1小時，保證抗體與包被抗原充分反應，甩干酶標板，用吐溫-20的質量分數為0. 05%的0. 01mol/L pH值為 7. 4的磷酸鹽緩沖液沖洗酶標板3次，每次5分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干。(4)將辣根過氧化物酶標山羊抗大鼠抗體1 3000稀釋，向酶標板孔內每孔加入 100μ L，37°C孵育1小時，甩干酶標板，用吐溫-20的質量分數為0. 05%的0. 01mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液沖洗酶標板3次，每次5分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干，向酶標板孔內每孔加入100 μ L底物工作液，在恒溫箱中37°C反應20分鐘，加入50 μ L 2mol/ L的硫酸溶液，終止反應。上述的底物工作液的配制方法為稱取7. 16g Na2HPO4加蒸餾水定容至IOOmL, 配制成物質的量濃度為0. 2mol/L的磷酸鹽緩沖溶液；稱取2. Ig檸檬酸加蒸餾水定容至IOOmL,配制成物質的量濃度為0. lmol/L的檸檬酸溶液；取25. 7mL物質的量濃度為 0. 2mol/L的磷酸鹽緩沖溶液和24. 3mL物質的量濃度為0. lmol/L的檸檬酸溶液，加蒸餾水定容至IOOmL,搖勻，配制成底物緩沖液；將0. Ig 3，3’，5，5’ -四甲基聯苯胺用IOOmL無水乙醇溶解，加入IOOmL底物緩沖液中，再加入400 μ L質量分數為30%的H2A溶液，搖勻，配制成底物工作液，底物工作液現配現用。(5)用酶標儀在波長為450nm下測定樣品孔、陰性對照孔、空白對照孔的OD值，按下式計算P/N值P/N =(樣品孔OD值-空白對照孔OD值)/(陰性對照孔OD值-空白對照孔OD 值)式中2. 1檢出結果判定為陽性，表明抗體效價大于或等于該孔的稀釋度，在同一行陽性結果中對應的最大稀釋度即為該抗體效價，P/N < 2. 1檢測結果判定為陰性，表明抗體效價小于或等于該孔的稀釋度。試驗結果見表1。表1免疫體積的選擇
疫時間/天免疫體積07213549630. ImL/只--1:1001:4001:4001:4000. 25mL/K-1:1001:2001:4001:8001:8000. 5mL/只-1:2001:8001:32001:64001128001. OraL/只-1:4001:16001:32001:64001:128001. 5mL/只-1:2001:4001:8001:6400112800由表1可知，大鼠免疫前耐熱菌的鼠源多克隆抗血清效價低于ELISA法檢測抗體效價的最低稀釋度1 100，表明其為陰性血清。免疫體積不同的個體血清的效價都有不同程度的上升；隨著免疫次數的增加，耐熱菌的鼠源多克隆抗體的效價逐漸上升。免疫體積為 0. ImL/只和0.25mL/只時，耐熱菌的鼠源多克隆抗體的效價分別為1 400和1 800 ；免疫體積為0. 5mL/只、1. OmL/只和1. 5mL/只時，五次免疫后，大鼠耐熱菌的鼠源多克隆抗體效價均達到1 12800。考慮到免疫過程對SD大鼠的影響，每次的免疫量不宜大于1.5mL/ 只，因此本發明確定免疫體積為0. 5 1. 5mL/只。2、確定免疫SD大鼠次數將2mL濃度為2 X 109CFU/mL的耐熱菌菌懸液與2mL免疫佐劑混合均勻，超聲振蕩至充分乳化，通過背部肌肉多點注射免疫雄性SD大鼠，免疫原體積為1. OmL/只，首次免疫采用弗氏完全佐劑，然后用弗氏不完全佐劑進行6次追加免疫，每次免疫的時間間隔為兩周，每次免疫1周后眼眶采血，采用ELISA法測定效價，結果見表2。表2耐熱菌的鼠源多克隆抗體免疫過程中效價變化
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由表2可知，大鼠免疫前耐熱菌的鼠源多克隆抗血清效價低于ELISA法檢測抗體效價的最低稀釋度1 100，表明其為陰性血清。初次免疫后不同個體血清的效價有不同程度的上升；隨著免疫次數的增加，耐熱菌的鼠源多克隆抗體的效價逐漸上升。前三次追加免疫后，耐熱菌的鼠源多克隆抗體效價有較快增長。五次免疫后，4/5的免疫大鼠多克隆抗體效價達到1 12800，但第六次和第七次免疫后，多克隆抗體效價不再上升。因此，本發明選
權利要求
1.耐熱菌的鼠源多克隆抗體的制備方法，其特征在于它由下述步驟組成(1)制備耐熱菌菌懸液將耐熱菌標準菌株轉接至250mL的402培養基，置于45°C氣浴中振蕩培養8小時，轉接至凱氏培養基，41°C培養M小時，用無菌生理鹽水沖洗凱氏培養基上培養的耐熱菌，將沖洗下的耐熱菌移至無菌三角錐瓶中充分混勻，離心分離，棄去上清液，沉淀用生理鹽水洗滌，向沉淀中加入無菌生理鹽水，稀釋成濃度為1. 4X IO8 4X 109CFU/mL的耐熱菌菌懸液；(2)耐熱菌免疫SD大鼠將步驟(1)中制備的耐熱菌菌懸液與免疫佐劑按等體積混合，超聲振蕩至充分乳化， 通過背部肌肉多點注射免疫雄性SD大鼠，注射體積為0. 5 1. 5mL/只，首次免疫采用弗氏完全佐劑，然后用弗氏不完全佐劑進行追加免疫，每次免疫的時間間隔為兩周，免疫63 91天摘除眼球采血，制備成耐熱菌的鼠源多克隆抗血清；(3)飽和硫酸銨沉淀法分離抗體向步驟(2)制備的耐熱菌的鼠源多克隆抗血清中加入無菌生理鹽水，逐滴加入pH值為 8. 0的飽和硫酸銨水溶液，耐熱菌的鼠源多克隆抗血清與無菌生理鹽水、飽、和硫酸銨水溶液的體積比為1 1 2，充分搖勻，4°C靜置12小時，離心分離，棄去上清液，所得沉淀用生理鹽水溶解，裝入透析袋中透析；(4)G蛋白親和層析純化抗體向透析后的耐熱菌的鼠源多克隆抗體中加入0. lmol/L pH值為9. 0的Tris-HCl緩沖液，調節耐熱菌的鼠源多克隆抗體的PH值至8. 0，用G蛋白親和層析柱分離，上樣量與柱體積之比為2 1，流速為ImL/分鐘，上樣完成后用0. lmol/L pH值為8. 0的磷酸鹽緩沖液洗脫至基線穩定，用0. lmol/L pH值為3. 0的檸檬酸緩沖液洗脫結合的耐熱菌的鼠源多克隆抗體，收集耐熱菌的鼠源多克隆抗體，裝入透析袋中透析，用平均分子量為6000的聚乙二醇濃縮至與上樣量體積相同。
2.根據權利要求1所述的耐熱菌的鼠源多克隆抗體的制備方法，其特征在于在耐熱菌免疫SD大鼠步驟O)中，將步驟(1)中制備的濃度為2X 109CFU/mL的耐熱菌菌懸液與免疫佐劑按等體積混合，超聲振蕩至充分乳化，通過背部肌肉多點注射免疫雄性SD大鼠， 注射體積為ImL/只，首次免疫采用弗氏完全佐劑，然后用弗氏不完全佐劑進行4次追加免疫，每次免疫的時間間隔為兩周，免疫63天摘除眼球采血，制備成耐熱菌的鼠源多克隆抗血清。
全文摘要
一種耐熱菌的鼠源多克隆抗體的制備方法，將耐熱菌標準菌株通過培養基培養，制成1.4×108～4×109CFU/mL的耐熱菌菌懸液，然后將耐熱菌菌懸液與免疫佐劑按等體積混合，超聲振蕩至充分乳化，通過背部肌肉多點注射免疫雄性SD大鼠，免疫63～91天摘除眼球采血，制成耐熱菌的鼠源多克隆抗血清，再采用飽和硫酸銨沉淀法和G蛋白親和層析對耐熱菌的鼠源多克隆抗血清分別進行分離、純化，制備成耐熱菌的鼠源多克隆抗體。本發明方法簡單，成本低，所制備的耐熱菌的鼠源多克隆抗體效價可達到12800，特異性良好，與常見食源性微生物無交叉反應，經電泳鑒定有較高純度，可用于建立耐熱菌免疫化學檢測方法。
文檔編號C07K1/22GK102432682SQ20111042771
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月16日 優先權日2011年12月16日
發明者夏凱, 李建科 申請人:陜西師范大學