專利名稱：分子烙印技術分離純化石杉堿甲的方法
技術領域：
本發明涉及一種分子烙印技術分離純化石杉堿甲的方法。
背景技術：
石杉堿甲(Huperzine A，簡稱Hup A)，又名福定堿，是從石杉科石杉屬蛇足杉(千層塔)中分離得到的一種天然生物堿，屬強效的可逆性乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制劑，對早老性癡呆癥、單純記憶障礙以及重癥肌無力癥治療有顯著療效，且藥效持續時間較長，無嚴重不良反應，是目前國內外上述病癥最有效的藥物，深受關注。由于它的治療指數高，且作用時間長，在國際上已被列為第二代膽堿酯酶的抑制劑之一。但Hup A在自然界中存在量極低，且含有大量雜質，分離純化困難。目前現有一些有關制備石杉堿甲的專利文獻如下1、《一種從千層塔中提取分離石杉堿甲的方法》(中國專利，CN101134743A)用有機溶劑提取，調酸；依次經陽離子交換樹脂色譜分離和硅膠色譜分離，結晶，得純度達98% 的石杉堿甲。2、《從中草藥千層塔中提取石杉堿甲的方法》(中國專利，CN1448390A)應用以下工藝步驟制備石杉堿甲原料粉碎一浸漬一濃縮一萃取(反復)一柱層析一結晶一高效液相色譜選段一濃縮干燥一成品，純度98%以上。3、《一種石杉堿甲的制備方法》(中國專利，CN101602727A)采用千層塔為原料，經以下步驟原料粉碎一酸液超聲提取一陰離子交換樹脂除雜一氯仿萃取一減壓回收一大孔吸附樹脂分離一乙醇水洗脫一減壓回收一結晶一干燥，得到石杉堿甲成品，純度95%。4、《一種石杉堿甲的提純方法》(中國專利，CN10880259A)采用以下步驟原料粉碎一酸水加熱提取一膜過濾除雜濃縮一氨化氯仿萃取濃縮一中壓氧化鋁柱層析一氯仿甲醇重結晶一干燥，得成品，純度98 %。5、《一種泡沫分離法分離千層塔中石杉堿甲的方法》(中國專利，CN101747275A) 所述方法為千層塔浸膏溶于乙醇，然后和陰離子表面活性劑加入泡沫分離塔內，攪拌均勻后從塔底連續鼓入空氣，形成泡沫，收集泡沫直至無泡沫產生，得到的泡沫由塔頂排出泡沫液，攪拌反應，過濾取濾餅得石杉堿甲粗品，用重結晶的溶劑進行重結晶，干燥得石杉堿甲成品，純度65%左右。6、《一種高純度石杉堿甲的制備方法》(中國專利，CN1587260A)用正構烷烴-脂肪醇-水作為溶劑體系，用高速逆流色譜法從石杉植物千層塔中分離高純度石杉堿甲，純度 99%。7、《一種從千層塔中提取分離高純度石杉堿甲的新方法》(中國專禾IJ， CN101693689A)采用原料粉碎浸泡一大孔吸附樹脂預分離一高速逆流色譜純化，最后獲得純度98%以上的石杉堿甲。上述各種方法，中國專利CNlOl 134743A、中國專利CN101602727A、中國專利 CN10880259A雖然分離出的石杉堿甲純度較高，但工藝復雜、有機溶劑用量多、耗時長、成本高，不適合工業化生產；中國專利CN101747275A分離出的石杉堿甲純度較低；中國專利 CN1448390A、中國專利CN1587260A、中國專利CN101693689A分別采用高效液相色譜法和高
速逆流色譜法分離石杉堿甲，得到產品純度較高，但生產量小，設備昂貴，大多局限于實驗室應用。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種分子烙印技術分離純化石杉堿甲的方法，采用該方法制備石杉堿甲具有安全、操作簡便、成本低、生產周期短、純度高等特點。為了解決上述技術問題，本發明提供一種分子烙印技術分離純化石杉堿甲的方法，包括以下步驟1)、將千層塔粉碎后投入超聲逆流萃取器中，加入質量濃度為0. 5 1. 2%酒石酸水溶液，超聲逆流萃取30 50分鐘；千層塔與酒石酸水溶液的料液比為1kg千層塔/5 IOL的酒石酸水溶液；所得的提取液減壓濃縮至1/3 1/10體積，得濃縮提取液；在濃縮提取液中加入活性炭進行脫色處理，得脫色處理后提取液；2)、將脫色處理后提取液上固相柱，固相柱內裝有作為固定相的石杉堿甲分子烙印聚合物，先用體積濃度為5 10%的乙醇水溶液或甲醇水溶液進行淋洗，淋洗液棄去；再用體積濃度為40 50%的乙醇水溶液或甲醇水溶液進行淋洗至淋洗液無色，淋洗液棄去； 拆柱將柱中的固定相取出，用體積濃度為60 70%乙醇水溶液或甲醇水溶液抽提固定相中被吸附的石杉堿甲單體，得抽提液；所述石杉堿甲分子烙印聚合物中的石杉堿甲與千層塔中的石杉堿甲的摩爾比為 1 1. 1 1 ；3)、將上述抽提液減壓濃縮，再用溶劑重結晶，得石杉堿甲。作為本發明的分子烙印技術分離純化石杉堿甲的方法的改進步驟2、中的石杉堿甲分子烙印聚合物的制備方法為在作為溶劑的致孔劑中，將作為模板分子的石杉堿甲、功能單體、交聯劑和引發劑混合均勻后進行聚合反應，得到聚合物；石杉堿甲、功能單體、交聯劑和引發劑的質量比為 1 10 20 15 25 0. 02 0. 08 ；聚合反應的溫度為50 80°C，反應時間為4 15小時；聚合物先研磨成粉體，再用溶劑抽提掉粉體狀聚合物中殘余的石杉堿甲，得到石杉堿甲分子烙印聚合物(MIPs)。作為本發明的分子烙印技術分離純化石杉堿甲的方法的進一步改進致孔劑為四氫呋喃、乙腈、丙酮、甲苯、二氯甲烷或氯仿；功能單體為甲基丙烯酸、4-乙烯苯基硼酸、吡啶衍生物或丙烯酰胺；交聯劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯或乙烯基衍生物；引發劑為偶氮二異丁腈或偶氮二異庚腈。作為本發明的分子烙印技術分離純化石杉堿甲的方法的進一步改進步驟1)中的脫色處理為先調節濃縮提取液為PHl 2，然后加入活性炭脫色5 15分鐘；活性炭與千層塔的質量比為5 10%。
作為本發明的分子烙印技術分離純化石杉堿甲的方法的進一步改進步驟3)中的用于重結晶的溶劑為乙醇、丙酮、氯仿、二氯甲烷或甲醇。在本發明的步驟1)的脫色處理中，用質量濃度為0. 5 2%的鹽酸溶液調節pH。步驟1)的超聲逆流提取法是藥材(即千層塔)與溶劑(即質量濃度為0. 5 1.2%酒石酸水溶液)在浸出容器中沿相反方向運動，連續而充分地進行接觸提取的一種方法。設備采用高效連續動態超聲逆流提取機，其提取原理是通過壓電換能器產生的快速機械振動波來減少目標萃取物與樣品基體之間的作用力從而實現固一液萃取分離。超聲逆流提取設備是動態提取、逆流提取、煎煮提取工藝的結合，在保留多種傳統工藝優點的同時，創造了這些傳統工藝所無法達到的諸多優點安全性好，操作簡單易行，維護保養方便， 提取效率高，具有廣譜性，減少能耗。由于超聲萃取無需加熱或加熱溫度低，萃取時間短，因此大大降低能耗。藥材原料處理量大，能成倍或數倍提高處理量，且雜質少，有效成分易于分離和凈化。在本發明的步驟幻的石杉堿甲分子烙印聚合物的制備方法中，作為溶劑的致孔劑的用量只需保證石杉堿甲、功能單體、交聯劑和引發劑能被溶解即可。分子烙印技術，也稱分子印跡技術(MIT)，其應用前提是能制備出具有分子識別能力的聚合物-分子烙印聚合物(MIPs)。MPs的制備過程大致為①將模板分子和功能單體按照一定比例混合后在一定條件下反應，通過共價鍵或非共價鍵作用形成可逆的模板分子-功能單體復合物；②將加入交聯劑等，使之與前面的模板-功能單體復合物通過聚合反應形成多孔性的高聚物；③將模板分子從高聚物種抽提出來，這樣在聚合物的骨架上便留下了一個對模板分子有“預定，，選擇性的分子識別位。分子烙印聚合物中的空腔和模板分子形狀、大小完全一樣，從而實現對模板分子的特異性識別。本發明采用了超聲逆流萃取，縮短了提取時間和增加了提取收率，又采用了分子烙印技術進行分離純化，具有制備簡單，成本低廉，環保，產品收率高、純度高，穩定性好可重復使用。采用本發明方法制備的石杉堿甲，其純度可高達99 %，收率可高達90 %。
具體實施例方式下面通過具體實施方式
對本發明作進一步說明，但本發明的保護范圍不限于此。實施例1、一種分子烙印技術分離純化石杉堿甲的方法，依次進行以下步驟1)、制備石杉堿甲的分子烙印聚合物量取IOml的氯仿于25ml試管中，將0. 60g質量含量為98%的石杉堿甲(模板分子)，12.05g乙二醇二甲基丙烯酸酯(交聯劑)，10.06g甲基丙烯酸(功能單體)，0.03g 偶氮二異丁腈(引發劑)依次加入到上述試管中，密封，超聲(40KHz頻率的超聲波)溶解 20min。將混合均勻的聚合溶液充氮氣lOmin。將試管放入65°C的水浴中，加熱聚合4h，聚合后將溫度升高到68°C，繼續加熱2h，使聚合完全。將得到的本體聚合物取出，研磨至能過400目，用400目不銹鋼篩濕法在水中篩分，抽濾，將得到的粒徑小于400目的石杉堿甲分子烙印聚合物烘干(至恒重)，用乙醇于索氏提取器中抽提上述粉末狀的石杉堿甲分子烙印聚合物中殘余的石杉堿甲，直到提取液中檢測不到石杉堿甲為止，然后將分子烙印粉末烘干，得石杉堿甲分子烙印聚合物21. Og，備
經HPLC法檢測，該石杉堿甲分子烙印聚合物中石杉堿甲的質量濃度為2.69%， 即，含有0. 58克的石杉堿甲，S卩，0. 00239mol的石杉堿甲。2)、取粉碎好的千層塔藥材^g (粉碎后藥材全部通過40目的篩)，投入超聲逆流萃取器中，加入15L的質量濃度的酒石酸水溶液，超聲(40KHZ頻率的超聲波)逆流提取 50分鐘。經HPLC法檢測，該千層塔中石杉堿甲的含量為0. 26mg/g,即2kg千層塔中含有 0. 52g(即0. 00215mol)的石杉堿甲。3)、將步驟2~)所得的提取液減壓濃縮至約2500ml，得濃縮提取液；先將濃縮提取液用1 % (質量濃度)的鹽酸溶液調節PH為2 ；再加入IOOg活性碳攪拌脫色10分鐘，過濾后，所得濾液為脫色處理后提取液；4)、在固相柱中裝入制備好的21. 0克石杉堿甲分子烙印聚合物作為固定相，將步驟3)所得的全部脫色處理后提取液上該固相柱；先用體積濃度為10%的乙醇水溶液IOOml 進行淋洗，淋洗液棄去；再用體積濃度為40%的乙醇溶液(約150ml)進行淋洗至淋洗液無色，淋洗液棄去；拆柱將柱中的固定相取出，用體積濃度為70%乙醇水溶液200ml抽提固定相中被吸附的石杉堿甲單體；得抽提液；5)、將步驟4)所得的抽提液減壓濃縮至回收器無液體流出，得濃縮物；用2倍體積量(相對于濃縮物而言)的氯仿回流溶解，加入3倍體積量(相對于濃縮物而言)的甲醇，于4°C冷藏結晶，濾出晶體，得晶體0. 49g，經HPLC檢測石杉堿甲的含量 989. lmg/g,純度 99.0%,總收率為 93.2%。實施例2、一種分子烙印技術分離純化石杉堿甲的方法，依次進行以下步驟1)、制備石杉堿甲的分子烙印聚合物量取30ml的丙酮于IOOml燒瓶中，將1. Og質量含量為98%石杉堿甲，21. Og季戊四醇三丙烯酸酯，14. 56g 4-乙烯苯基硼酸(亦名4-乙烯基苯硼酸)，0. 05g偶氮二異丁腈依次加入到燒瓶中，密封，超聲(40KHz頻率的超聲波)溶解30min。將混合均勻的聚合溶液充氮，65°C的水浴中加熱聚合12h，使聚合完全。將得到的本體聚合物取出，研磨至能過200目，用200目不銹鋼篩濕法在水中篩分，抽濾，將得到的粒徑小于200目的石杉堿甲分子烙印聚合物烘干，用乙醇于索氏提取器中抽提述粉末狀的石杉堿甲分子烙印聚合物中殘余的石杉堿甲，直到提取液中檢測不到石杉堿甲為止，然后將分子烙印粉末烘干，得石杉堿甲分子烙印聚合物34. 0g，備用。經HPLC法檢測，該石杉堿甲分子烙印聚合物中石杉堿甲的質量濃度為2.77%， 即，含有0. 97克的石杉堿甲，即，0. 0040Imol的石杉堿甲。2)、取粉碎好的千層塔藥材^g (能過40目的篩)，投入超聲逆流萃取器中，加入 40L的質量濃度0. 5%的酒石酸水溶液，超聲GOKHZ頻率的超聲波)逆流萃取80分鐘。經HPLC法檢測，該千層塔中石杉堿甲的含量為0. 18mg/g,即5kg千層塔中含有 0. 90g(即0. 00372mol)的石杉堿甲。3)、將步驟2~)所得的提取液減壓濃縮至約5500ml，得濃縮提取液；先將濃縮提取液用1 % (質量濃度)的鹽酸溶液調節PH為2 ；再加入200g活性碳攪拌脫色20分鐘，過濾后，所得濾液為脫色處理后提取液；
4)、在固相柱中裝入制備好的34. Og石杉堿甲分子烙印聚合物作為固定相，將步驟3)所得的全部脫色處理后提取液上該固相柱；先用體積濃度為10%的甲醇水溶液170ml 進行淋洗，淋洗液棄去；再用體積濃度為40%的甲醇溶液(約220ml)進行淋洗至淋洗液無色，淋洗液棄去；拆柱將柱中的固定相取出，用體積濃度為70%甲醇水溶液350ml抽提固定相中被吸附的石杉堿甲單體；得抽提液；5)、將步驟4)所得的抽提液減壓濃縮至回收器無液體流出，得濃縮物；用3倍體積量(相對于濃縮物而言)的丙酮加熱至回流溶解，室溫放置12小時， 自然冷卻結晶，得晶體0. 845g，經HPLC檢測石杉堿甲的含量990. 7mg/g,純度99. 2%，收率 93. 0%。對比例1、將實施例1步驟1)的作為功能單體的10. 06g甲基丙烯酸改成10. 06g 4-乙烯基咪唑，其余同實施例1的步驟1)，得石杉堿甲分子烙印聚合物17. 6g。經HPLC法檢測，該石杉堿甲分子烙印聚合物中石杉堿甲的質量濃度僅為0. 2%, 即含有0. 035克的石杉堿甲，即0. OOOHmol的石杉堿甲。2)、取粉碎好的千層塔藥材Ikg (粉碎后藥材全部通過40目的篩)，投入超聲逆流萃取器中，加入7. 5L的質量濃度的酒石酸水溶液，超聲GOKHZ頻率的超聲波)逆流提取50分鐘。經HPLC法檢測，該千層塔中石杉堿甲的含量為0. 18mg/g，S卩Ikg千層塔中含有 0. 18g(即0. 00074mol)的石杉堿甲。3)、將步驟2~)所得的提取液減壓濃縮至約1000ml，得濃縮提取液；先將濃縮提取液用1 % (質量濃度)的鹽酸溶液調節PH為2 ；再加入50g活性碳攪拌脫色10分鐘，過濾后，所得濾液為脫色處理后提取液；4)、在固相柱中裝入制備好的17. 6克石杉堿甲分子烙印聚合物作為固定相，將步驟3)所得的全部脫色處理后提取液上該固相柱；收集流出液；再用體積濃度為10%的乙醇水溶液120ml進行淋洗，收集淋洗液1 ；再用體積濃度為40%的乙醇溶液60ml進行淋洗，收集淋洗液2 ；拆柱將柱中的固定相取出，用體積濃度為70%乙醇水溶液200ml抽提固定相中被吸附的石杉堿甲單體；得抽提液。5)、經HPLC檢測，流出液中含有石杉堿甲0. 17g，淋洗液1中含有石杉堿甲 0. 009g，淋洗液1中含有石杉堿甲0. OOlg，抽提液中未檢測到石杉堿甲。對比例2、將實施例1步驟1)的作為功能單體的甲基丙烯酸的用量由10. 06g改成 7. 25g，其余同實施例1的步驟1)，得石杉堿甲分子烙印聚合物16. 7g，備用。經HPLC法檢測，該石杉堿甲分子烙印聚合物中石杉堿甲的質量濃度為2.50%， 即，含有0.418克的石杉堿甲，即，0. 00173mol的石杉堿甲。2)、取粉碎好的千層塔藥材2. ^g (粉碎后藥材全部通過40目的篩)，投入超聲逆流萃取器中，加入25L的質量濃度的酒石酸水溶液，超聲GOKHZ頻率的超聲波)逆流提取50分鐘。經HPLC法檢測，該千層塔中石杉堿甲的含量為0. 18mg/g，即2. 5kg千層塔中含有 0. 45g(即0. 00186mol)的石杉堿甲。3)、將步驟2~)所得的提取液減壓濃縮至約2000ml，得濃縮提取液；先將濃縮提取液用1 % (質量濃度)的鹽酸溶液調節PH為2 ；再加入125g活性碳攪拌脫色10分鐘，過濾后，所得濾液為脫色處理后提取液；4)、在固相柱中裝入制備好的16. 7g石杉堿甲的分子烙印聚合物作為固定相，將步驟幻所得的全部脫色處理后提取液上該固相柱；先用體積濃度為10%的乙醇水溶液 IOOml進行淋洗，淋洗液棄去；再用體積濃度為40%的乙醇溶液150ml進行淋洗至淋洗液無色，淋洗液棄去；拆柱將柱中的固定相取出，用體積濃度為70%乙醇水溶液250ml抽提固定相中被吸附的石杉堿甲單體；得抽提液；5)、將步驟4)所得的抽提液減壓濃縮至回收器無液體流出，得濃縮物；用2倍體積量(相對于濃縮物而言)的氯仿回流溶解，加入3倍體積量(相對于濃縮物而言)的甲醇，于4°C冷藏結晶，濾出晶體，得晶體0. 42g，經HPLC檢測石杉堿甲的含量955. Omg/g，純度97. 0%，總收率較低。對比例3、步驟1)、2)、4)、5)同實施例 1，步驟幻中，將所得濃縮提取液直接加入IOOg活性碳攪拌脫色10分鐘(即，取消用鹽酸溶液調節PH為2)，其余同步驟3)。最終得晶體0. 500g,經HPLC檢測石杉堿甲的含量880. Omg/g,純度88. 1 %，收率 84. 6%。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
權利要求
1.分子烙印技術分離純化石杉堿甲的方法，其特征是包括以下步驟1)、將千層塔粉碎后投入超聲逆流萃取器中，加入質量濃度為0.5 1. 2%酒石酸水溶液，超聲逆流萃取30 50分鐘；所述千層塔與酒石酸水溶液的料液比為1kg千層塔/5 IOL的酒石酸水溶液；所得的提取液減壓濃縮至1/3 1/10體積，得濃縮提取液；在濃縮提取液中加入活性炭進行脫色處理，得脫色處理后提取液；2)、將所述脫色處理后提取液上固相柱，所述固相柱內裝有作為固定相的石杉堿甲分子烙印聚合物，先用體積濃度為5 10%的乙醇水溶液或甲醇水溶液進行淋洗，淋洗液棄去；再用體積濃度為40 50%的乙醇水溶液或甲醇水溶液進行淋洗至淋洗液無色，淋洗液棄去；拆柱將柱中的固定相取出，用體積濃度為60 70%乙醇水溶液或甲醇水溶液抽提固定相中被吸附的石杉堿甲單體，得抽提液；所述石杉堿甲分子烙印聚合物中的石杉堿甲與千層塔中的石杉堿甲的摩爾比為1 1. 1 1 ；3)、將上述抽提液減壓濃縮，再用溶劑重結晶，得石杉堿甲。
2.根據權利要求1所述的分子烙印技術分離純化石杉堿甲的方法，其特征是所述步驟2)中的石杉堿甲分子烙印聚合物的制備方法為在作為溶劑的致孔劑中，將作為模板分子的石杉堿甲、功能單體、交聯劑和引發劑混合均勻后進行聚合反應，得到聚合物；所述石杉堿甲、功能單體、交聯劑和引發劑的質量比為 1 10 20 15 25 0.02 0.08;所述聚合反應的溫度為50 80°C，反應時間為 4 15小時；所述聚合物先研磨成粉體，再用溶劑抽提掉粉體狀聚合物中殘余的石杉堿甲，得到石杉堿甲分子烙印聚合物。
3.根據權利要求2所述的分子烙印技術分離純化石杉堿甲的方法，其特征是所述致孔劑為四氫呋喃、乙腈、丙酮、甲苯、二氯甲烷或氯仿；所述功能單體為甲基丙烯酸、4-乙烯苯基硼酸、吡啶衍生物或丙烯酰胺；所述交聯劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯或乙烯基衍生物；所述引發劑為偶氮二異丁腈或偶氮二異庚腈。
4.根據權利要求1、2或3所述的分子烙印技術分離純化石杉堿甲的方法，其特征是所述步驟1)中的脫色處理為先調節濃縮提取液為PHl 2，然后加入活性炭脫色5 15分鐘；所述活性炭與千層塔的質量比為5 10%。
5.根據權利要求4所述的分子烙印技術分離純化石杉堿甲的方法，其特征是所述步驟 3)中的用于重結晶的溶劑為乙醇、丙酮、氯仿、二氯甲烷或甲醇。
全文摘要
本發明公開了一種分子烙印技術分離純化石杉堿甲的方法，包括以下步驟1)將千層塔粉碎超聲逆流萃取，所得的提取液減壓濃縮后加入活性炭進行脫色處理；2)脫色處理后的提取液上固相柱，固相柱內裝有作為固定相的石杉堿甲分子烙印聚合物，先用5～10％的乙醇水溶液或甲醇水溶液進行淋洗，再用40～50％的乙醇水溶液或甲醇水溶液進行淋洗至淋洗液無色；拆柱將柱中的固定相取出，用60～70％乙醇水溶液或甲醇水溶液抽提固定相中被吸附的石杉堿甲單體，得抽提液；3)將抽提液減壓濃縮，再用溶劑重結晶，得石杉堿甲。采用該方法制備石杉堿甲具有安全、操作簡便、成本低、生產周期短、純度高等特點。
文檔編號C07D221/22GK102491946SQ20111041131
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月12日 優先權日2011年12月12日
發明者周建仁, 沈生榮, 王維, 蔣風, 邊鋒 申請人:杭州華東醫藥集團康潤制藥有限公司