專利名稱：Fbxl15蛋白及其抑制劑以及它們的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及FBXL15蛋白及其抑制劑以及它們的應用。
背景技術：
蛋白質是構成生命體內細胞和組織的基本物質，幾乎所有的蛋白質都處在不斷合成與降解的動態平衡之中。與蛋白質的合成相比，蛋白質的降解同樣重要，機體內短壽命的、錯誤折疊的以及機體自身不需要的蛋白都需要通過降解途徑來清除。其中泛素-蛋白酶體系統⑴biquitin-Proteasome System,UPS)就是真核生物體內普遍存在的具有高度選擇性的蛋白質降解系統，主要由蛋白質泛素化和蛋白酶體降解兩個過程組成。該系統的生物學功能非常廣泛，參與調控細胞內幾乎各個方面的生命活動，其異常與炎癥、癌癥及神經退行性疾病等密切相關。泛素化修飾通過由泛素激活酶(ubiquitin activating enzyme，El)、泛素結合 Sl (ubiquitin conjugating enzyme, E2)禾口泛素連接 Sl (ubi qui tin-protein ligase, E3) 參與介導的酶促級聯反應完成，最后經蛋白酶體降解。其中E3決定底物識別的特異性，是蛋白質泛素化領域的研究熱點。E3可以分為兩大類含有RING(really interesting new gene)鋅指結構和 HECT (homologous to E6AP C-terminus)結構域的 E3。RING類E3中的大多數是基于Cullins蛋白的多亞基復合體，其中基于Cullinl所形成的SCF(Skpl-Cullinl-F-boX)復合體是研究最多、最深入的RING類E3復合體。它以支架蛋白Cullinl為中心，C端結合RING鋅指蛋白Rocl，N端結合接頭蛋白Skp 1，Skpl又進一步募集不同的F-box蛋白，F-box蛋白擔當底物識別亞基的角色，這樣SCF復合體就利用不同的F-box蛋白形成不同復合體，從而結合不同的底物，在細胞周期調控、細胞生長及腫瘤發生等多種生物學過程中發揮著重要作用。F-box蛋白是一個大的蛋白家族，其家族成員數量在不同的物種中差別很大，酵母中約有20種，果蠅中有27種，而在人中則有69個成員。人中的F-box蛋白家族根據其C端所含結構域的不同，可以分為三類含有WD40結構域的FBXW亞家族，含有LRR區的FBXL亞家族，以及含有其它結構域的統稱為FBM)亞家族， 它們分別通過WD40、LRR及其它結構域與底物蛋白發生相互作用，介導SCF復合體的結合。相對于RING類E3，HECT類E3數量上約占人類E3的5 %，共有觀種，其功能與機制研究相對較少，認識大多來自對于Nedd4(neural precursor cell-expressed developmentally downregulated gene 4)家族的研究。人中Nedd4家族共有9個成員， 根據進化關系上的遠近又可分為4個亞家族NedcMs :Nedd4-l, Nedd4_2/Nedd4L ；Smurfs Smurfl, Smurf2 ；AIPs :AIP2/WWP2, AIP4, AIP5/WWP1 ；NEDLs :NEDL1, NEDL2。各亞家族成員間的序列和結構的相似性更高，同源性更強。Nedd4家族成員的結構域組成及模式呈現規律性的特點N端均含有C2結構域，能結合磷脂，介導質膜定位；中間為2 4個Wff結構域， 每個Wff結構域由約40個氨基酸組成，其中因含有兩個標志性的色氨酸殘基(Try，W)而得名，WW結構域能與PY模序結合，介導蛋白與蛋白間的相互作用，決定底物的特異性；C端為 HECT催化結構域。
Smurfl (Smad ubiquitination regulatory factor 1)白勺HMft·， 與同家族的Smurf2高度同源。Smurfl最早在線蟲中出現，人源Smurfl是發現的第一個能夠降解Smads的E3，其發現將TGF-β /BMP通路與泛素-蛋白酶體通路聯系起來。研究發現，Smurfl可以通過降解經典BMP通路的受體型Smads (如Smadl、Smad5)和BMP受體、負調控BMP通路。隨后有研究揭示Smurfl可以靶向Smad不依賴的BMP-MEKK2-JNK通路中的 MEKK2激酶，負調控骨形成。Smurfl+小鼠隨年齡增長則表現出骨量的不斷上升，Smurfl與 Smurf2雙敲除則導致小鼠胚胎致死。這些研究表明，Smurfl是骨形成、胚胎發育乃至腫瘤發生的重要調控分子。發明內容
本發明的目的是提供FBXL15蛋白及其抑制劑以及它們的應用。
本發明保護FBXL15蛋白、所述FBXL15蛋白的編碼基因或含有所述編碼基因的重組表達載體在如下①或②中的應用①促進成骨細胞的分化；②制備促進所述成骨細胞分化的產品。所述成骨細胞具體可為UMR106細胞。
FBXL15蛋白或其編碼基因還可用于促進Smurfl蛋白的降解或制備促進Smurfl蛋白降解的產品。FBXL15蛋白或其編碼基因還可用于促進Smurfl蛋白的泛素化或制備促進 Smurfl蛋白泛素化的產品。FBXL15蛋白或其編碼基因還可用于增強BMP通路活性或制備增強BMP通路活性的產品。所述FBXL15蛋白具體可通過抑制所述Smurfl蛋白增強BMP通路活性。
本發明還保護一種核酸，為序列表的序列9所示核酸、序列表的序列10所示核酸或序列表的序列11所示核酸。
本發明還保護FBXL15蛋白的抑制劑在降低FBXL15蛋白的編碼基因的表達量中的應用。
本發明還保護FBXL15蛋白的抑制劑在如下如下(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、 (VI)、(VII)或(VIII)中的應用(I)延長細胞和/或組織和/或生物體內源Smurfl蛋白的半衰期；(II)抑制所述Smurfl蛋白的降解；(III)抑制所述Smurfl蛋白的泛素化；(IV) 抑制BMP通路活性；(V)制備延長細胞和/或組織和/或生物體內源Smurfl蛋白的半衰期的產品；(VI)制備抑制所述Smurfl蛋白降解的產品；(VII)制備抑制所述Smurf 1蛋白泛素化的產品；(VIII)制備抑制BMP通路活性的產品；
所述FBXL15蛋白的抑制劑具體可為所述核酸。
所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質。
所述FBXL15蛋白的編碼基因是如下(1)或⑵或(3)所述的DNA分子
(1)序列表中序列2所示的DNA分子；
(2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA 分子；
(3)與⑴限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子。所述Smurfl蛋白是如下(C)或(d)(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(d)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白質。FBXL15本身能明顯增強成骨細胞的分化，即促進骨形成，可用于治療骨質疏松等疾病。骨硬化癥，又稱石骨癥，骨密度升高伴隨骨形態變化，由于失去了中空髓腔反而使骨頭脆性增加，更容易骨折。本發明提供的FBXL15蛋白的抑制劑可以抑制成骨細胞的分化， 即抑制骨形成，可用于作為石骨癥的候選藥物。
圖1為FBXL15結構域組成示意圖。圖2為FBXL15蛋白的細胞表達譜及亞細胞定位分析；A :FBXL15蛋白的細胞表達譜；B :FBXL15蛋白的亞細胞定位分析。圖3為FBXL15形成功能性SCF復合體促進Smurfl蛋白的降解；A =FBXL 15與 SkpUCullinl和Rocl存在相互作用；B =FBXL 15降低Smurfl (WT/C699A)的穩定性(1為無 FBXLl5, 2為FBXL15低劑量，3為FBXL15高劑量)；C 野生型FBXL15，而不是FBXL15截短體促進Smurfl降解(1代表第一組，2代表第二組，3代表第三組，4代表第四組)；D :FBXL15 特異性降解Smurfl。圖4為敲低FBXL15增強內源Smurfl蛋白水平；A 3條獨立的FBXL15 siRNA敲低效率檢測；B 2#、3# siRNA有效敲低內源FBXL15蛋白水平；C 敲低FBXL15上調內源Smurfl 水平；D和E 敲低FBXL15后增強Smurfl半衰期。圖5為SCFfbxu5復合體增強Smurfl泛素化水平；A =FBXL 15促進Smurfl體內泛素化水平(1代表第一組，2代表第二組，3代表第三組，4代表第四組，5代表第五組)；B 敲低 CullinU RocU FBXL15 減低 Smurfl 泛素化水平。圖6為FBXL15拮抗Smurfl對BMP通路的抑制效應；A =Smurfl能明顯降低底物 Smadl/5的蛋白水平(1至12依次代表第一組至第十二組)。B 敲低FBXL15可以抑制BMP 通路的活化(1代表取樣時間為0小時，2代表取樣間隔時間為0. 5小時，3代表取樣間隔時間為1小時，4代表取樣間隔時間為2小時，5代表取樣間隔時間為4小時。)；C:敲低FBXL15 可以抑制BMP通路靶基因IDl和Smad6的表達(*表示P < 0. 05)。圖7為實施例5中各組細胞的堿性磷酸酶ALP染色后照片。圖8為實施例5中各組細胞的ALP活性分析結果，*表示P < 0. 05。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。Western Blot條帶通過kion Image軟件定量。BMP-2即大鼠骨成型蛋白2 購自PEPR0TECH公司，目錄號120-02。UMR106細胞(大鼠成骨樣細胞系)購自美國標準菌種保藏中心(ATCC)，目錄號為CRL-1661。HEK293T 細胞北京協和細胞資源中心，編號為3111C0001CCC000091 ；為人胚腎細胞(SV40T基因修飾)。pFlag-CMV-2 表達載體Sigma，目錄號為 E7398。pCMV-Myc 表達載體Clontech 公司。pCMV-HA表達載體Clontech公司。！fepG2細胞(肝癌細胞系)北京協和細胞資源中心，編號為 3111C0001CCC000035。。
限制性內切酶、T4連接酶均購自NEB公司。質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒均購自Promega公司。反轉錄試劑盒及實時定量熒光染料STOR Green PCR Mix購自東洋紡公司。雙熒光素酶報告基因試劑盒購自Promega公司。RNA提取試劑Trizol購自hvitrogen 公司。大腸桿菌感受態細胞DH5ci購自天根公司。細胞培養相關的胎牛血清、DMEM培養液、雙抗及胰酶均購自Hyclone公司。轉染試劑Lipofectamine 2000購自hvitrogen公司。蛋白酶體抑制劑(MG132)購自Sigma公司。蛋白合成抑制劑cycloheximide (CHX)購自Sigma公司。蛋白酶抑制劑(cocktail)購自Roche公司。。Protein A/G agarose購自 Santa Cruz ^b]。
Flag抗體購自Sigma公司。Myc抗體購自MBL公司。GAPDH抗體購自ProteiniTech 公司 Smurfl 抗體(ab57573)和 Smurf2 (ab53316)抗體購自 Abcam 公司。Cullinl 抗體、 Skpl抗體、Rocl抗體和CyclinA/Bl抗體購自hvitrogen公司。Smadl/5抗體和磷酸化 Smadl/5 (S463/465)抗體購自 Cell Signaling 公司。Smadl/5 抗體=CellSignaling, 97430 5111&(12/3抗體刃611 Signaling，3102。
實施例1、FBXL15蛋白的基本特征描述
一、序列的生物信息學分析
FBXL15蛋白由F_box結構域和6個亮氨酸富含區(LRR)所組成(圖1)。LRR是一大類介導蛋白相互作用的結構域，根據長度及序列特征可以分為6類，FBXL15及Skp2 等F-box蛋白屬于其中的CC(cysteine-containing)亞類。FBXL15在進化上較為保守，在果蠅、瘧蚊等無脊椎動物及魚類、鳥類等脊椎動物以及哺乳動物中都存在FBXL15的同源基因，其中哺乳動物中FBXL15高度保守，人與其它哺乳動物的同源性高達95%以上，與魚類、 鳥類的同源性在60%左右，與無脊椎動物的進化距離較遠，只有30%左右。從FBXL15與其它FBXL亞類的蛋白的進化樹關系分析，FBXL15分支獨立于大多數FBXL亞類蛋白，提示 FBXL15的功能可能比較保守。
二、正常及癌細胞系中的FBXL15蛋白的編碼基因的表達水平
在獲得FBXL15抗體后，在Hela (人子宮頸癌細胞)、MCF_7 (乳腺癌細胞)、U20S (骨肉瘤細胞)、HEK293T (人胚腎細胞)、H印G2 (肝癌細胞)、K562 (粒細胞來源白血病細胞)、 STOY(神經母細胞瘤細胞)、HCT-15(結腸癌細胞)中檢測FBXL15的表達水平。結果顯示，FBXL15在各細胞系中均有表達，但在K562白血病細胞系中表達特別高(圖2A)，在 Jurkat (淋巴細胞白血病)中也檢測到高表達。
三、FBXL15蛋白的細胞定位分析
在帶有載玻片直徑為30mm的confocal專用培養皿中，接種MCF-7細胞，培養至合適匯合度后分別轉染GFP-FBXL15、Myc_FBXL15。細胞培養24h后，轉染GFP-FBXL15細胞直接在熒光顯微鏡下觀察，轉染Myc-FBXL15細胞進行以下處理(1)4%多聚甲醛固定， 室溫 IOmin ； (2)PBS 洗滌，0. 2 % Triton-PBS 滲透，室溫 IOmin ； (3)PBS 洗滌，PBST (1%0Tween20+3 % BSA)封閉，37 °C 30min ； (4)棄封閉液，加入一抗(PBST 1 50 稀釋)， 37°C 3 4h或4°C過夜；(5) PBST洗滌三次，5min/次，靜置即可；(6)避光操作加入FITC標記二抗，Ih以內否則熒光易淬滅；(7)避光操作PBST洗滌三次；(S)DAPI染核，觀察。結果見圖2B，結果顯示FBXL15主要定位于胞質中。實施例2、重組質粒的制備一、重組質粒Flag_FBXL15的制備1、根據NCBI (美國國立生物技術信息中心)網站查到人FBXL15基因 (NM_024326. 3)的編碼區序列，設計擴增該基因的引物對如下正向引物5，-eg gaattc aatggagccaccgatggag-3'(斜體為 EcoR I 酶切位點)；反向弓丨物5‘-cgggatcctcagacctgcaggttgacaaa-3‘(斜體為 BamH I 酶切位點)。2、提取HEK293T細胞的總RNA，反轉錄為cDNA。3、以步驟2的cDNA為模板，用步驟1設計的引物對進行PCR擴增，回收PCR擴增產物。4、用限制性內切酶EcoR I和BamH I雙酶切步驟3的PCR擴增產物，回收酶切產物。5、用限制性內切酶EcoR I和BamH I雙酶切pFlag-CMV_2表達載體，回收載體骨架(約 4. 7kb)。6、將步驟4的酶切產物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質粒Flag_FBXL15。根據測序結果，對重組質粒Flag-FBXL15進行結構描述如下在pFlag-CMV-2表達載體的EcoR I和BamH I酶切位點之間插入了序列表的序列2所示的人FBXL15基因(序列表的序列2 所示的人FBXL15基因編碼序列表的序列1所示的人FBXL15蛋白)。重組質粒Flag_FBXL15 可以表達Flag-FBXL15融合蛋白(蛋白分子量約為38kDa)。二、重組質粒 Flag-FBXL15_ Δ F 的制備1、設計引物對如下正向引物5’-eg gaa ttc, aggtccgcagatcccg-3‘(斜體為 EcoR I 酶切位點)；反向弓丨物5 ‘ -cggga tcc tcagacctgcaggttgacaaa-3 ‘(斜體為 BamH I 酶切位點)。2、以重組質粒Flag_FBXL15為模板，用步驟1設計的引物對進行PCR擴增，回收 PCR擴增產物。3、用限制性內切酶EcoR I和BamH I雙酶切步驟2的PCR擴增產物，回收酶切產物。4、用限制性內切酶EcoR I和BamH I雙酶切pFlag-CMV_2表達載體，回收載體骨架(約 4. 7kb)。5、將步驟3的酶切產物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質粒 Flag-FBXL15-AF。根據測序結果，對重組質粒Flag-FBXL15_ Δ F進行結構描述如下在 pFlag-CMV-2表達載體的EcoR I和BamH I酶切位點之間插入了序列表的序列2自5’末端第211至903位核苷酸所示的人FBXL15-AF基因。重組質粒Flag-FBXL15_ Δ F可以表達 Flag-FBXL15-AF融合蛋白(蛋白分子量約為^kDa)。三、重組質粒Flag-FBXL15-F_box的制備1、設計引物對如下
正向弓I物5，_cg 貧 aat tea atg gag cca ccg atg gag(斜體為 EcoR I Bl切位占).
反向弓I物5，-eg 從a tcc tea cac ctg cgc ggc ate gaa(斜體為 BamH I 酶切位點)O
2、以重組質粒Flag_FBXL15為模板，用步驟1設計的引物對進行PCR擴增，回收 PCR擴增產物。
3、用限制性內切酶EcoR I和BamH I雙酶切步驟2的PCR擴增產物，回收酶切產物。
4、用限制性內切酶EcoR I和BamH I雙酶切pFlag-CMV_2表達載體，回收載體骨架(約 4. 7kb)。
5、將步驟3的酶切產物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質粒 Flag-FBXL15-F-boX。根據測序結果，對重組質粒Flag-FBXL15-F-boX進行結構描述如下 在pFlag-CMV-2表達載體的EcoR I和BamH I酶切位點之間插入了序列表的序列2自5’ 末端第1至210位核苷酸所示的人FBXL15-F-box基因。重組質粒Flag-FBXL15-F-boX可以表達Flag-FBXL15-F-boX融合蛋白(蛋白分子量約為IlkDa)。
四、重組質粒Myc_FBXL15的制備
1、設計引物對如下
正向引物5，-cg卵a cggatggagccaccgatggag-3，(斜體為EcoR I 酶切位點)；
反向弓丨物5，-ccgctcgag atcagacctgcaggttgacaaa-3，(斜體為 Xho I 酶切位點)ο
2、以重組質粒Flag_FBXL15為模板，用步驟1設計的引物對進行PCR擴增，回收 PCR擴增產物。
3、用限制性內切酶EcoR I和Bio I雙酶切步驟2的PCR擴增產物，回收酶切產物。
4、用限制性內切酶EcoR I和Bio I雙酶切pCMV_Myc表達載體，回收載體骨架(約 3. 8kb)。
5、將步驟3的酶切產物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質粒Myc_FBXL15。根據測序結果，對重組質粒Myc-FBXL15進行結構描述如下在pCMV_Myc表達載體的EcoR I和 Xho I酶切位點之間插入了序列表的序列2所示的人FBXL15基因。重組質粒Myc_FBXL15 可以表達Myc-FBXL15融合蛋白(蛋白分子量約為38kDa)。
五、重組質粒Flag-Smurfl (WT)的制備
1、根據NCBI (美國國立生物技術信息中心)網站查到人Smurfl基因 (NM_181349. 2)的編碼區序列，設計擴增該基因的引物對如下
正向引物5，-ccaa^rii;atgtcgaaccccgggaca-3，(斜體為Hind III 酶切位點)；
反向弓I物5‘-cggaattctcactccacagcaaacccgca-3‘(斜體為 EcoR I 酶切位點)。
2、提取HEK293T細胞的總RNA，反轉錄為cDNA。
3、以步驟2的cDNA為模板，用步驟1設計的引物對進行PCR擴增，回收PCR擴增產物。
4、用限制性內切酶Hind III和EcoR I雙酶切步驟3的PCR擴增產物，回收酶切產物。
5、用限制性內切酶Hind III和EcoR I雙酶切pFlag-CMV-2表達載體，回收載體骨架(約4. 7kb)。6、將步驟4的酶切產物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質粒 Flag-Smurfl (WT)。根據測序結果，對重組質粒Flag-Smurfl (WT)進行結構描述如下在 pFlag-CMV-2表達載體的Hind III和EcoR I酶切位點之間插入了序列表的序列4所示的人 Smurfl基因(序列表的序列4所示的人Smurfl基因編碼序列表的序列3所示的人Smurfl 蛋白)。重組質粒Flag-Smurf 1 (WT)可以表達Flag-Smurf 1 (WT)融合蛋白(蛋白分子量約為 ^kDa)。六、重組質粒Flag-Smurfl (C699A)的制備1、設計引物如下正向弓I 物 1 :5，-co aagctt atgtcgaaccccgggaca-3'(斜體為 Hind III 醇切位
占). /、、、 / 反向弓丨物 1 :5，-atccggttaaatgcggtatgggcc-3，；正向弓丨物 2 :5，-ggcccataccgcatttaaccggat-3，；反向弓I物 2 :5，-eg gaattc tcactccacagcaaacccgca-3，(斜體為 EcoR I 酶切位點)ο2、提取HEK293T細胞的總RNA，反轉錄為cDNA。3、以重組質粒Flag-Smurfl (WT)為模板，分別用步驟1設計的引物對1 (由正向引物1和反向引物1組成)和引物對2 (由正向引物2和反向引物2組成)進行PCR擴增，分別回收PCR擴增產物。4.將步驟3回收得到的PCR產物混合，以混合物為模板，以引物對3 (由正向引物 1和反向引物2組成)進行PCR擴增，回收PCR擴增產物。5、用限制性內切酶Hind I和EcoR I雙酶切步驟4的PCR擴增產物，回收酶切產物。6、用限制性內切酶Hind III和EcoR I雙酶切pFlag-CMV-2表達載體，回收載體骨架(約4. 7kb)。7、將步驟5的酶切產物和步驟6的載體骨架連接，得到重組質粒 Flag-Smurfl (C699A)。根據測序結果，對重組質粒Flag-Smurfl (C699A)進行結構描述如下與重組質粒Flag-Smurfl (WT)相比，重組質粒Flag-Smurfl (C699A)的差異僅在于將序列表的序列4所示的DNA自5，末端第2095-2097位核苷酸由“tgc”突變為了 “gca”；引起序列表的序列3所示蛋白質自N末端第699位氨基酸殘基由半胱氨酸突變為了丙氨酸，從而失去活性。重組質粒Flag-Smurf 1 (C699A)可以表達Flag-Smurf 1 (C699A)融合蛋白(蛋白分子量約為85kDa)。七、重組質粒HAIb的制備1、根據NCBI (美國國立生物技術信息中心)網站查到人證基因 (NM_001135592. 2)的編碼區序列，設計擴增該基因片段的引物對如下正向引物:5，-CCgtcgac catgcagattttcgtgaaa-3，(斜體為 Sal I 酶切位點)；反向弓丨物5‘-ccggcggccgc ttaccaccacgaagtctc-3‘(斜體為 Not I 酶切位點)。2、提取HEK293T細胞的總RNA，反轉錄為cDNA。
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3、以步驟2的cDNA為模板，用步驟1設計的引物對進行PCR擴增，回收PCR擴增產物。
4、用限制性內切酶Ml I和Not I雙酶切步驟3的PCR擴增產物，回收酶切產物。
5、用限制性內切酶Ml I和Not I雙酶切pCMV-HA表達載體，回收載體骨架(約 3. 8kb)。
6、將步驟4的酶切產物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質粒HA-Ub。根據測序結果，對重組質粒HA-Ub進行結構描述如下在pCMV-HA表達載體的Ml I和Not I酶切位點之間插入了序列表的序列5所示的人證基因片段。
八、重組質粒Myc-Smadl的構建
1、根據NCBI (美國國立生物技術信息中心)網站查到人Smadl基因 (NM_001003688. 1)的編碼區序列，設計擴增該基因的引物對如下
正向引物5，-CCCtCgagi gtatgaatgtgacaagttta-3，(斜體為 Xho I 酶切位點)；
反向引物5，-ccg^r^grc^rttaagatacagatgaaat-3，(斜體為 Not I 酶切位點)。
2、提取HEK293T細胞的總RNA，反轉錄為cDNA。
3、以步驟2的cDNA為模板，用步驟1設計的引物對進行PCR擴增，回收PCR擴增產物。
4、用限制性內切酶Bio I和Not I雙酶切步驟3的PCR擴增產物，回收酶切產物。
5、用限制性內切酶Bio I和Not I雙酶切pCMV-Myc表達載體，回收載體骨架(約 3. 8kb)。
6、將步驟4的酶切產物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質粒Myc-Smadl。根據測序結果，對重組質粒Myc-Smadl進行結構描述如下在pCMV_Myc表達載體的Β ο I和 Not I酶切位點之間插入了序列表的序列6所示的Smadl基因。重組質粒Myc-Smadl可以表達Myc-Smadl融合蛋白(蛋白分子量約為55kDa)。
九、重組質粒Myc_Smad3的構建
1、根據NCBI (美國國立生物技術信息中心)網站查到人Smad3基因 (NM_001145102. 1)的編碼區序列，設計擴增該基因的引物對如下
正向引物5，-cg卵a cggatggagctgtgtgagttc-3，(斜體為EcoRI 酶切位點)；
反向弓丨物5，-ccgcic^,actaagacacactggaaca-3，(斜體為 Xho I 酶切位點)。
2、提取HEK293T細胞的總RNA，反轉錄為cDNA。
3、以步驟2的cDNA為模板，用步驟1設計的引物對進行PCR擴增，回收PCR擴增產物。
4、用限制性內切酶EcoR I和Bio I雙酶切步驟3的PCR擴增產物，回收酶切產物。
5、用限制性內切酶EcoR I和Bio I雙酶切pCMV_Myc表達載體，回收載體骨架(約 3. 8kb)。
6、將步驟4的酶切產物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質粒Myc-Smad3。根據測序結果，對重組質粒Myc-Smad3進行結構描述如下在pCMV_Myc表達載體的EcoRI和 Xho I酶切位點之間插入了序列表的序列7所示的Smad3基因。重組質粒Myc-Smad3可以表達Myc-Smad3融合蛋白(蛋白分子量約為40kDa)。
十、重組質粒Myc_Smad5的構建
1、根據NCBI (美國國立生物技術信息中心)網站查到人Smad5基因 (NM_001001419. 1)的編碼區序列，設計擴增該基因的引物對如下正向引物5，-coctcgag\ gtatgacgtcaatggccagc-3，(斜體為 Xho I 酶切位點)；反向引物-.W-觀 gcggccgc ttatgaaacagaagatat-3，(斜體為 Not I 酶切位點)。2、提取HEK293T細胞的總RNA，反轉錄為cDNA。3、以步驟2的cDNA為模板，用步驟1設計的引物對進行PCR擴增，回收PCR擴增產物。4、用限制性內切酶Bio I和Not I雙酶切步驟3的PCR擴增產物，回收酶切產物。5、用限制性內切酶Bio I和Not I雙酶切pCMV_Myc表達載體，回收載體骨架(約
3.8kb)。6、將步驟4的酶切產物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質粒Myc-Smad5。根據測序結果，對重組質粒Myc-Smad5進行結構描述如下在pCMV_Myc表達載體的Β ο I和 Not I酶切位點之間插入了序列表的序列8所示的Smad5基因。重組質粒Myc-Smad5可以表達Myc-Smad5融合蛋白(蛋白分子量約為55kDa)。實施例3、FBXL15形成SCF復合體并反式調控Smurfl蛋白穩定性一、FBXL15 形成 SCF 復合體絕大多數F-box均可與Skpl、Cullinl、R0cl等形成SCF復合體參與對底物的識別和降解，但其中也有例外，如FBX045則不能形成經典的SCF復合體，而是與PAM等蛋白形成其它類型的復合體，有的F-box蛋白甚至不能形成復合體。設置三組處理如下第一組(空載體組)在HEK293T細胞中轉染pFlag-CMV-2表達載體，轉染劑量為
4.Oug質粒/IX IO6細胞；第二組(Flag-FBXL15組)在HEK293T細胞中轉染重組質粒Flag_FBXL15，轉染劑量為4. Oug質粒/IX IO6細胞；第三組(Flag-FBXL15_AF組)在HEK293T細胞中轉染重組質粒 Flag-FBXL15- Δ F，轉染劑量為4. Oug質粒/1 X IO6細胞。轉染3 后加入蛋白酶體抑制劑(20 μ Μ)處理他，然后收集細胞。向細胞中補加450μ1 HEPES裂解液，并補加蛋白酶抑制劑(20 μ 1)和磷酸酶抑制劑(IOmM NaF和 ImMNa3VO4),冰上裂解并短暫超聲至裂解液清亮。4°C 12000rpm離心lOmin，取上清。50 μ 1 上清(Iys樣本)進行western blot分析。剩余的上清加入Flag抗體約2 μ g，4°C旋轉混合3_4h后加入protein A/G agarose 40 μ 1孵育過夜，離心收集agarose，經裂解液洗滌3 次后煮樣(IP樣本)進行western blot分析。western blot分析的一抗分別采用Cullinl 抗體、Skpl抗體、Rocl抗體和Flag抗體。結果見圖3A。各組細胞的上清中，均可檢測到Cullinl、Skpl和Rocl。第二組和第三組的上清中都可以檢測到Flag。第二組的IP樣本中可以檢測到Cullinl、Skpl和 Rocl，第三組的IP樣本中沒有檢測到Cullinl、Skpl和Rocl。結果表明，FBXL15在體內確實能與Cullinl、Skpl和Rocl形成經典的SCF復合體，為其發揮E3功能奠定基礎，而 Flag-FBXL15 Δ F因缺失募集Skpl的關鍵F_box模序無法與Cullinl、Skpl和Rocl形成SCF 復合體。
13
二、FBXL15下調外源Smurfl蛋白穩定性1、實驗 1設置六組處理如下第一組(無FBXL15)在HEK293T細胞中轉染重組質粒Flag-Smurfl (WT)，轉染劑量為0. 5ug質粒/IX IO6細胞；第二組(FBXL15低劑量)在HEK293T細胞中轉染重組質粒Flag-Smurf 1 (WT)和重組質粒Flag-FBXL15，重組質粒Flag-Smurfl (WT)的轉染劑量為0. 5ug質粒/1 X IO5細胞， 重組質粒Flag-FBXL15的轉染劑量為1. Oug質粒/1 X IO5細胞；第三組(FBXL15高劑量)在HEK293T細胞中轉染重組質粒Flag-Smurf 1 (WT)和重組質粒Flag-FBXL15，重組質粒Flag-Smurfl (WT)的轉染劑量為0. 5ug質粒/1 X IO5細胞， 重組質粒Flag-FBXL15的轉染劑量為2. Oug質粒/1 X IO5細胞；第四組(無FBXL15)在HEK293T細胞中轉染重組質粒Flag-Smurf 1 (C699A)，轉染劑量為0. 5ug質粒/1 X IO5細胞；第五組(FBXL15低劑量)在HEK293T細胞中轉染重組質粒Flag-Smurfl (C699A) 和重組質粒Flag-FBXL15，重組質粒Flag-Smurf 1 (C699A)的轉染劑量為0. 5ug質粒/1 X IO5 細胞，重組質粒Flag-FBXL15的轉染劑量為1. Oug質粒/1 X IO5細胞；第六組(FBXL15高劑量)在HEK293T細胞中轉染重組質粒Flag-Smurfl (C699A) 和重組質粒Flag-FBXL15，重組質粒Flag-Smurf 1 (C699A)的轉染劑量為0. 5ug質粒/1 X IO5 細胞，重組質粒Flag-FBXL15的轉染劑量為2. Oug質粒/1 X IO5細胞。轉染M小時后，每組細胞分成兩組(其中一組加入蛋白酶體抑制劑)，繼續培養 12小時，然后將各組細胞進行western blot分析。western blot分析的一抗采用Flag抗體。以GAPDH抗體檢測的結果作為對照。結果見圖;3B。隨著Flag-FBXL15轉染劑量的增加，外轉Smurfl (WT)蛋白(野生型)水平逐步減低，這說明FBXL15可降低Smurfl(WT)蛋白的穩定性，而該效應可被蛋白酶體抑制劑MG132所阻斷，說明FBXL15對Smurfl (WT)蛋白的降解依賴蛋白酶體。隨著 Flag-FBXL15轉染劑量的增加，外轉Smurfl (C699A)蛋白(失活型突變體)水平逐步減低， 說明FBXL15對Smurfl蛋白的降解不依賴Smurfl自身的E3活性(cis activity)，而很有可能為反式降解(trans activity)。2、實驗 2設置四組處理如下第一組在HEK293T細胞中轉染重組質粒Flag-Smurfl (WT)，轉染劑量為0. 5ug質粒/IX IO5細胞；第二組在HEK293T細胞中轉染重組質粒Flag-Smurfl (WT)和重組質粒 Flag-FBXL15,重組質粒Flag-Smurfl (WT)的轉染劑量為0. 5ug質粒/1 X IO5細胞，重組質粒Flag-FBXL15的轉染劑量為2. Oug質粒/1 X IO5細胞；第三組在HEK293T細胞中轉染重組質粒Flag-Smurfl (WT)和重組質粒 Flag-FBXL15- Δ F，重組質粒Flag-Smurfl (WT)的轉染劑量為0. 5ug質粒/1 X IO5細胞，重組質粒Flag-FBXL15- Δ F的轉染劑量為2. Oug質粒/1 X IO5細胞；第四組在ΗΕΚ293Τ細胞中轉染重組質粒Flag-Smurfl (WT)和重組質粒
14Flag-FBXL15-F-box,重組質粒 Flag-Smurfl (WT)的轉染劑量為 0. 5ug 質粒 /IX IO5 細胞， 重組質粒Flag-FBXL15-F-box的轉染劑量為2. Oug質粒/1 X IO5細胞。
轉染M小時后，每組細胞分成兩組(其中一組加入蛋白酶體抑制劑)，繼續培養 12小時，然后將各組細胞進行western blot分析。western blot分析的一抗采用Flag抗體。以GAPDH抗體檢測的結果作為對照。
結果見圖3C。FBXL15的突變體FBXL15-Δ F、FBXL15_F_box因不能形成功能性的 SCF復合體而無法降低Smurfl的穩定性，初步說明FBXL15發揮降解功能依賴其SCF復合體的完整性。
3、實驗 3
另外，又考察了其它的F-box蛋白，如FBXL亞類的Skp2、FBXL3、FBXL5及FBXL21， FBXff 類的 β -Trcpl，FBXO 類的 FBX042 對 Smurfl 的影響。ΗΕΙ^93Τ 細胞轉染 Flag-Smurfl 和不同的F-box蛋白真核表達載體(BXL、FBXff, FBXO亞類的幾個蛋白真核表達載體均購自 Origene公司)，細胞收獲后檢測Smurfl水平。發現除FBXL15外，其它F_box蛋白均不能降解Smurf 1，說明FBXL15對Smurfl的調控是特異的(圖3D)。
三、通過抑制FBXL15上調內源Smurfl蛋白水平
為了在內源條件下更真實的反映FBXL15及其復合體對內源Smurfl蛋白水平的影響，擬考察FBXL15及復合體其它組分敲低后Smurfl內源水平的變化。
1、設計合成如下siRNA
靴向人中FBXL15蛋白的編碼基因的siRNA(FBXL15 siRNA)
1#(序列表的序列 9) :5，-CACCCUGGAGCUUCAAAUATT-3，；
2#(序列表的序列 10) :5，-GGAACUGCCCAGAACUCCATT-3，；
3#(序列表的序列 11) :5，-GCCUGAGCCGCUUGCGGAATT-3，；
陰性對照 s iRNA 5，-UUCUCCGAAC⑶⑶CAC⑶TT-3，。
siRNA均由上海吉瑪公司負責合成。
2、實驗 1
借助Lipofectamine 2000轉染試劑分別將步驟1合成的l#siRNA(1#組)、姊 siRNA(2#組)、3# siRNA(3#組)和陰性對照siRNA(NC組)分別與重組質粒Flag_FBXL15 共轉染HEK293T細胞，觀察siRNA對外源表達的FBXL15蛋白的敲低效率。siRNA的轉染劑量為ΙΟΟηΜ/1 X IO5細胞，重組質粒Flag_FBXL15轉染量為0. 5ug質粒/1 X IO5細胞。
轉染48小時后，收取細胞。將各組細胞進行western blot分析。western blot 分析的一抗采用Flag抗體，以GAPDH抗體檢測的結果作為對照。western blot分析結果見圖4A，結果表明，2#、3# siRNA均可有效敲低內源的FBXL15。
3、實驗 2
借助Lipofectamine 2000轉染試劑分別將步驟1合成的^siRNA (2#組)、 3#siRNA (3#組)和陰性對照siRNA (NC組)轉染HEK293T細胞，siRNA的轉染劑量為 ΙΟΟηΜ/ΙΧ IO5細胞，觀察2#、3# siRNA對內源FBXL15蛋白的敲低效率。
轉染48小時后，收取細胞。將各組細胞進行western blot分析。western blot 分析的一抗采用FBXL15多克隆抗體(人FBXL15多克隆抗體由北京博爾邁生物技術公司負責制備；抗原表位為序列表的序列1所示的FBXL15蛋白自N末端第1-17位氨基酸殘基組成的多肽“MEPPMEPSGGEQEPGAVC”;將抗原表位與KLH載體蛋白偶聯后免疫新西蘭大耳兔獲得抗血清，親和純化后得到多克隆抗體)，以GAPDH抗體檢測的結果作為對照。western blot 分析結果見圖4B。結果表明，2#、3#siRNA均可有效敲低內源FBXL15的表達，其中姊siRNA 敲低效果更好。4、實驗 3借助Lipofectamine 2000轉染試劑分別將步驟1合成的邶siRNA (2#組)、 3# siRNA (3#組)和陰性對照siRNA (NC組)轉染HEK293T細胞，siRNA的轉染劑量為 ΙΟΟηΜ/ΙΧΙΟ5細胞。轉染48小時后，收取細胞。將各組細胞進行western blot分析。 western blot分析的一抗分別為Smurfl抗體和FBXL15多克隆抗體。以GAPDH抗體檢測的結果作為對照。western blot分析結果見圖4C。結果表明，結果顯示敲低FBXL15后內源 Smurfl蛋白水平呈現2-3倍不同程度的上調。5、實驗 4借助Lipofectamine 2000轉染試劑分別將步驟1合成的邶siRNA (2#組)、 3# siRNA (3#組)和陰性對照siRNA (NC組)轉染HEK293T細胞，siRNA的轉染劑量為 ΙΟΟηΜ/1 X IO5細胞，轉染48小時后，在細胞中加入放線菌酮(cyclohemixde ；CHX)，使其終濃度為50 μ g/ml (放線菌酮的作用為終止細胞合成新的Smurfl蛋白)，分別于加入CHX后 0、4、8和12小時取細胞進行western blot分析。western blot分析的一抗分別為Smurfl 抗體和FBXL15多克隆抗體。以GAPDH抗體檢測的結果作為對照。結果見圖4D。從加入放線菌酮開始，細胞內的Smurfl蛋白量變化見圖4E，蛋白量下降至初始時刻蛋白量的50%的時間即為Smurfl蛋白的半衰期。結果表明，加入siRNA后內源Smurfl的半衰期從Mi延長至9h左右。綜合以上實驗說明，FBXL15確實影響Smurfl的內源蛋白穩定性，并且該功能的發揮依賴其形成的SCF復合體。四、SCFfbxu5復合體促進Smurfl的泛素化1、實驗 1設置五組處理如下第一組在HEK293T細胞中轉染重組質粒HA-Ub，轉染劑量為2. Oug質粒/1 X IO6 細胞；第二組在HEK293T細胞中轉染重組質粒HA-Ub和重組質粒Flag-Smurfl (WT)，重組質粒HA-Ub的轉染劑量為2. Oug質粒/1 X IO6細胞，重組質粒Flag-Smurfl (WT)的轉染劑量為3. Oug質粒/1 X IO6細胞；第三組在HEK293T細胞中轉染重組質粒HA_Ub、重組質粒Flag-Smurfl (WT)和重組質粒Myc-FBXL15，重組質粒HA-Ub的轉染劑量為2. Oug質粒/1 X IO6細胞，重組質粒 Flag-Smurfl (WT)的轉染劑量為3. Oug質粒/1 X IO6細胞，重組質粒Myc_FBXL15的轉染劑量為2. Oug質粒/IX IO6細胞；第四組在HEK293T細胞中轉染重組質粒HAIb和重組質粒Flag-Smurfl (C699A)， 重組質粒HA-Ub的轉染劑量為2. Oug質粒/1 X IO6細胞，重組質粒Flag-Smurfl (C699A)的轉染劑量為3. Oug質粒/1 X IO6細胞；第五組在HEK293T細胞中轉染重組質粒HA_Ub、重組質粒Flag-Smurfl (C699A)重組質粒HA-Ub的轉染劑量為2. Oug質粒/1 X IO6細胞，重組質粒 Flag-Smurfl (C699A)的轉染劑量為3. Oug質粒/1 X IO6細胞，重組質粒Myc_FBXL15的轉染劑量為2. Oug質粒/1 X IO6細胞；
轉染3 后加入蛋白酶體抑制劑(20 μ M)處理他，然后收集細胞。向細胞中補加 450 μ 1 RIPA 裂解液(IOmM ρΗ 7.5 Tris-HCl,5mM EDTA, 150mM NaCl, 1% Nonidet P-40， 1% sodium deoxycholate,0. 025% SDS)，并補加蛋白酶抑制劑(20 μ 1)和磷酸酶抑制劑 (IOmM NaF和ImM Na3VO4)，冰上裂解并短暫超聲至裂解液清亮。4°C 12000rpm離心lOmin， 取上清。50 μ 1上清(Iys樣本)進行western blot分析。剩余的上清加入Flag抗體約 2μ g，4°C旋轉混合3-4h后加入protein A/G agarose 40 μ 1孵育過夜，離心收集agarose， 經裂解液洗滌3次后煮樣(IP樣本)進行western blot分析。western blot分析的一抗分別采用Flag抗體和Myc抗體。
結果見圖5A。彌散狀泳道顯示泛素化。在沒有外源FB)(L15條件下，Smurfl (WT)存在自身泛素化，Smurfl (C699A)也能檢測到微弱的泛素鏈，說明存在內源FBXL15對Smurfl 的泛素化。當引入外源表達的FBXL15時，Smurfl (包括野生型和C699A突變型)的泛素化水平均得到明顯的增強。
2、實驗 2
靶向人中Cullinl蛋白編碼基因的siRNA(Cullinl siRNA)
1# :5，-G⑶UAUAUCA⑶UGUCUAA-3，；
2# 5，-CAACGAAGAGUUCAG⑶UU-3，。
靴向人中Rocl蛋白編碼基因的siRNA(Rocl siRNA)
1# 5，-GAAGCGCUUUGAA⑶GAAA-3，；
2# 5，-GCAUAGAAU⑶CAAGCUAA-3，。
借助Lipofectamine 2000 轉染試劑分別將 Cullinls iRNA(l# 和 2#)、Rocl 8士1 離(1#和姊)、步驟三的1制備的FBXL15 SiRNA ( 和3#)和步驟三的1制備的陰性對照 siRNA (NC組)和重組質粒HA-Ub共轉染HEK293T細胞，siRNA的轉染劑量均為luM/1 X IO6 細胞，重組質粒HA-Ub的轉染劑量為2. Oug質粒/1 X IO6細胞。
轉染3 后加入蛋白酶體抑制劑(20μΜ)處理他，然后收集細胞。向細胞中補加450μ1 RIPA裂解液，并補加蛋白酶抑制劑(20μ 1)和磷酸酶抑制劑(IOmM NaF和 ImMNa3VO4)，冰上裂解并短暫超聲至裂解液清亮。4°C 12000rpm離心lOmin，取上清，加入 Smurfl抗體約4 μ g，4°C旋轉混合3_4h后加入protein A/G agarose 40 μ 1孵育過夜，離心收集agarose，經裂解液洗滌3次后煮樣進行western blot分析。western blot分析的一抗采用Smurfl抗體。
結果見圖5B。轉染siRNA后，SCFfbxu5復合體各組分Cullinl、Rocl及FBXL15蛋白水平均敲低，內源Smurfl的泛素化水平削弱，這就證明FBXL15確實能夠增強Smurfl的泛素化水平。
實施例4、FBXL15反式調控Smurfl的功能研究(FBXL15拮抗Smurfl對BMP通路的抑制效應)
一、實驗 1
設置十二組處理如下17
第一組在HEK293T細胞中轉染重組質粒Myc-Smadl，轉染劑量為0. 2ug質粒 /IX IO5 細胞；第二組在HEK293T細胞中轉染重組質粒Myc-Smadl和重組質粒 Flag-Smurfl (WT)，重組質粒Myc-Smadl的轉染劑量為0. 2ug質粒/1 X IO5細胞，重組質粒 Flag-Smurfl (WT)的轉染劑量為0. 4ug質粒/1 X IO5細胞；第三組在HEK293T細胞中轉染重組質粒Myc-Smadl、重組質粒Flag-Smurfl (WT) 和重組質粒Flag-FBXL15，重組質粒Myc-Smadl的轉染劑量為0. 2ug質粒/1 X IO5細胞，重組質粒Flag-Smurfl (WT)的轉染劑量為0. 4ug質粒/1 X IO5細胞，重組質粒Flag_FBXL15的轉染劑量為0. Sug質粒/1 X IO5細胞；第四組在HEK293T細胞中轉染重組質粒Myc-Smadl、重組質粒Flag-Smurfl (WT) 和重組質粒Flag-FBXL15，重組質粒Myc-Smadl的轉染劑量為0. 2ug質粒/1 X IO5細胞，重組質粒Flag-Smurfl (WT)的轉染劑量為0. 4ug質粒/1 X IO5細胞，重組質粒Flag_FBXL15的轉染劑量為1. 2ug質粒/1 X IO5細胞；第五組在HEK293T細胞中轉染重組質粒Myc_Smad3，轉染劑量為0. 2ug質粒 /IX IO5 細胞；第六組在HEK293T細胞中轉染重組質粒Myc_Smad3和重組質粒 Flag-Smurfl (WT)，重組質粒Myc_Smad3的轉染劑量為0. 2ug質粒/1 X IO5細胞，重組質粒 Flag-Smurfl (WT)的轉染劑量為0. 4ug質粒/1 X IO5細胞；第七組在HEK293T細胞中轉染重組質粒Myc_Smad3、重組質粒Flag-Smurfl (WT) 和重組質粒Flag-FBXL15，重組質粒Myc_Smad3的轉染劑量為0. 2ug質粒/1 X IO5細胞，重組質粒Flag-Smurfl (WT)的轉染劑量為0. 4ug質粒/1 X IO5細胞，重組質粒Flag_FBXL15的轉染劑量為0. Sug質粒/1 X IO5細胞；第八組在HEK293T細胞中轉染重組質粒Myc_Smad3、重組質粒Flag-Smurfl (WT) 和重組質粒Flag-FBXL15，重組質粒Myc_Smad3的轉染劑量為0. 2ug質粒/1 X IO5細胞，重組質粒Flag-Smurfl (WT)的轉染劑量為0. 4ug質粒/1 X IO5細胞，重組質粒Flag_FBXL15的轉染劑量為1. 2ug質粒/1 X IO5細胞；第九組在HEK293T細胞中轉染重組質粒Myc_Smad5，轉染劑量為0. 2ug質粒 /IX IO5 細胞；第十組在HEK293T細胞中轉染重組質粒Myc_Smad5和重組質粒 Flag-Smurfl (WT)，重組質粒Myc_Smad5的轉染劑量為0. 2ug質粒/1 X IO5細胞，重組質粒 Flag-Smurfl (WT)的轉染劑量為0. 4ug質粒/1 X IO5細胞；第十一組在HEK293T細胞中轉染重組質粒Myc_Smad5、重組質粒 Flag-Smurfl (WT)和重組質粒Flag_FBXL15，重組質粒Myc_Smad5的轉染劑量為0. 2ug質粒 /1 X IO5細胞，重組質粒Flag-Smurfl (WT)的轉染劑量為0. 4ug質粒/1 X IO5細胞，重組質粒Flag-FBXL15的轉染劑量為0. 8ug質粒/1 X IO5細胞；第十二組在HEK293T細胞中轉染重組質粒Myc_Smad5、重組質粒 Flag-Smurfl (WT)和重組質粒Flag_FBXL15，重組質粒Myc_Smad5的轉染劑量為0. 2ug質粒 /1 X IO5細胞，重組質粒Flag-Smurfl (WT)的轉染劑量為0. 4ug質粒/1 X IO5細胞，重組質粒Flag-FBXL15的轉染劑量為1. 2ug質粒/1 X IO5細胞；
轉染36小時后，收取細胞。將各組細胞進行western blot分析。western blot 分析的一抗分別為Myc抗體和Flag抗體。以GAPDH抗體檢測的結果作為對照。western blot分析結果見圖6A。結果顯示，Smurfl能明顯降低底物Smadl/5的蛋白水平，對非底物 Smad3沒有影響。隨著FBXL15的梯度增強，Smurfl蛋白水平下調，Smadl/5蛋白水平則明顯回升，說明FBXL15的表達可拮抗Smurfl對底物的降解效應。
二、實驗 2
設置兩組處理如下
第一組在H印G2細胞中轉染實施例3的步驟三的1制備的陰性對照siRNA，siRNA 轉染劑量為80ηΜ/1Χ105細胞。
第二組在H印G2細胞中轉染實施例3的步驟三的1制備的^siRNA，siRNA轉染劑量為80ηΜ/1Χ105細胞。
轉染4 后，加入BMP-2(50ng/ml)刺激H印G2細胞lh，然后更換新的細胞培養基， 并在不同時間點取樣檢測Smadl/5的磷酸化水平，來說明BMP通路被激活的程度。將各時間點(從更換培養基開始計時)取樣的細胞進行western blot分析。western blot分析的一抗分別為磷酸化Smadl/5抗體、Smadl/5抗體、Smurfl抗體和FBXL15多克隆抗體。以 GAPDH抗體檢測的結果作為對照。
western blot分析結果見圖6B。當敲低FBXL15后，Smurfl蛋白水平在刺激后期有較明顯的上升，而磷酸化Smadl/5的水平則明顯減弱，說明BMP通路的活化程度被明顯削弱。
三、實驗3
設置三組處理如下
第一組在H印G2細胞中轉染實施例3的步驟三的1制備的陰性對照siRNA(NC 組)，siRNA的轉染劑量為50nM/5X IO4細胞。
第二組在H印G2細胞中轉染實施例3的步驟三的1制備的^isiRNA( 組)， siRNA的轉染劑量為50nM/5X IO4細胞。
第三組在H印G2細胞中轉染實施例3的步驟三的1制備的3# siRNA(3#組)， siRNA的轉染劑量為50nM/5X IO4細胞。
轉染3 后，每組分成兩個小組，其中一組加入BMP-2 (50ng/ml)刺激!fepG2細胞 Ih (第1組)，另一組不加入BMP-2 (第2組)。刺激結束后，!fepG2細胞經Trizol裂解后提取RNA，后反轉錄成cDNA。以cDNA為模板，通過實時定量PCR檢測BMP通路靶基因IDl和 Smad6的相對變化(借助GAPDH基因調整各組細胞至相同濃度)。qRCR在Bio-Rad IQ5系統上進行，結果通過Pfaffl法進行分析。
檢測GAPDH基因的引物對如下
5，-GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT-3，；5，-TTGAGGTCAATGAAGGGGTCA-3，。
檢測IDl基因的引物對如下
5’ -AGGCTGGATGCAGTTAAGGG-3，；5，-GACGATCGCATCTTGTGTCG-3，。
檢測Smad6基因的引物對如下
5，-TGCAACCCCTACCACTTCA-3，；5，-CGAGGAGACAGCCGAGAGT-3，。
以NC組不加入BMP-2的小組中目的基因的表達量作為100%，計算各個處理組的19相對表達量，見圖6C。結果顯示，在BMP刺激條件下，敲低FBXL15后BMP通路靶基因(如 IDl、Smad6)的表達水平受到明顯抑制。以上這些實驗證實，FBXL15確實可通過抑制Smurfl 來增強BMP通路的活性，是BMP通路的一個正向調控因子。
實施例5、FBXL15增強成骨細胞的分化
1、在24孔板中加入含10%胎牛血清(GIBCO)的α -MEM培養基(Hyclone)，每孔 500微升，然后每孔接種0. 5 X IO5個UMR106細胞。
2、待細胞生長至匯合度約70%時，設置以下三組處理(每組設置三個復孔)
第一組(Flag-FBXL15-Δ F 組；第 1 組)利用 Lipofectamine 2000 轉染試劑 (Invitrogen)將重組質粒Flag_FBXL15_ Δ F轉染細胞，細胞數與質粒比例為1 X IO5個細胞Iyg質粒；
第二組(Flag_FBXL15組；第2組)利用Lipofectamine 2000轉染試劑將重組質粒Flag-FBXL15轉染細胞，細胞數與質粒比例為1 X IO5個細胞= Iyg質粒；
第三組(pFlag-CMV-2組；第3組)利用Lipofectamine 2000轉染試劑將 pFlag-CMV-2表達載體轉染細胞，細胞數與質粒比例為1 X IO5個細胞1 μ g質粒。
3、轉染4 后，吸棄上清，每孔加入500微升誘導培養基(含100 μ g/ml維生素C、 5mM β-甘油磷酸鈉、100ng/ml BMP-2的α-MEM培養基)進行誘導。
4、誘導7 后，用4%多聚甲醛固定細胞，然后用ALP染色試劑盒(Sigma，產品目錄號為86-C)染色并用ALP活性測定試劑盒(WakhLabAssay ALP)進行活性測定(ALP染色和活性檢測方法均按試劑盒說明書進行)。
空白孔不接種細胞且不轉染質粒，其它同上。
ALP染色后的細胞照片見圖7。可見與第三組相比，第一組(Flag-FBXL15_ Δ F組) 成骨細胞的數量顯著降低，第二組(Flag-FBXL15組)成骨細胞的數量顯著升高，即FBXL15 蛋白促進成骨細胞分化，FBXL15-AF蛋白抑制成骨細胞分化。
ALP活性檢測試劑盒利用對硝基苯酚磷酸鹽(p-Nitrophenylphosphate)在pH9. 8 緩沖液中可被堿性磷酸酶(ALP)水解為對硝基苯酚(p-Nitrophenol)和磷酸鹽，釋放的對硝基苯酚在溶液中呈現黃色的特性，通過測定黃色溶液的吸光度來反映對硝基苯酚的濃度從而表征ALP的活性。因此ALP活性測定試劑盒得到的原始結果為405nm波長下溶液的吸光值(A)。用對硝基苯酚制作標準曲線，函數式為y (吸光值)=1.2Xx(對硝基苯酚濃度)。
ALP的相對活性通過下面公式換算得到
ALP 舌個生(nmol p-NP/min/mg protein) = C*a/t*c ；
C 樣品中對硝基苯酚的濃度，A樣品-Ase (nmol/uL)；
a:樣品的稀釋倍數；
t 反應時間(min)；
c 樣品中蛋白含量(mg/uL)；
pFlag-CMV-2 組的 ALP 活性為 105. 5士 10. 3，Flag_FBXL15_ΔF 組的 ALP 活性為 94. 7 士 14. 7，Flag-FBXL15 組的 ALP 活性為 170. 7 士 18. 5。
各組的ALP活性比較見圖8。結果顯示，FBXL15表達能明顯增強成骨細胞的分化， FBXL15-Δ F則表現出顯性負效應，一定程度上抑制成骨細胞的分化。
權利要求
1.FBXL15蛋白、所述FBXL15蛋白的編碼基因或含有所述編碼基因的重組表達載體在如下①或②中的應用①促進成骨細胞的分化；②制備促進所述成骨細胞分化的產品； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質；所述FBXL15蛋白的編碼基因是如下⑴或⑵或(3)所述的DNA分子(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的 DNA分子。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于所述成骨細胞為UMR106細胞。
3.FBXL15蛋白或其編碼基因在如下③或④中的應用③促進Smurfl蛋白的降解；④制備促進所述Smurfl蛋白降解的產品； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質；所述FBXL15蛋白的編碼基因是如下⑴或⑵或(3)所述的DNA分子(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的 DNA分子；所述Smurfl蛋白是如下(c)或(d)(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(d)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白質。
4.FBXL15蛋白或其編碼基因在如下⑤或⑥中的應用⑤促進Smurfl蛋白的泛素化；⑥制備促進所述Smurfl蛋白泛素化的產品； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質；所述FBXL15蛋白的編碼基因是如下⑴或⑵或(3)所述的DNA分子 (1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的 DNA分子；所述Smurfl蛋白是如下(c)或(d)(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(d)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白質。
5.FBXL15蛋白或其編碼基因在如下⑦或⑧中的應用⑦增強BMP通路活性；⑧制備增強所述BMP通路活性的產品；所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質；所述FBXL15蛋白的編碼基因是如下⑴或(2)或(3)所述的DNA分子(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的 DNA分子。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述FBXL15蛋白通過抑制Smurfl蛋白增強BMP通路活性；所述Smurfl蛋白是如下(c)或(d)(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(d)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白質。
7.核酸，為序列表的序列10所示核酸、序列表的序列11所示核酸或序列表的序列9所示核酸。
8.FBXL15蛋白的抑制劑在降低FBXL15蛋白的編碼基因的表達量中的應用；所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質。
9.FBXL15 蛋白的抑制劑在如下(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)或(VIII)中的應用(I)延長細胞和/或組織和/或生物體內源Smurfl蛋白的半衰期；(II)抑制所述Smurfl蛋白的降解；(III)抑制所述Smurfl蛋白的泛素化；(IV)抑制BMP通路活性；(V)制備延長細胞和/或組織和/或生物體內源Smurfl蛋白的半衰期的產品；(VI)制備抑制所述Smurfl蛋白降解的產品；(VII)制備抑制所述Smurfl蛋白泛素化的產品；(VIII)制備抑制BMP通路活性的產品； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質；所述Smurfl蛋白是如下(c)或(d)(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(d)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白質。
10.如權利要求8或9所述的應用，其特征在于所述抑制劑為權利要求7所述的核酸。
全文摘要
本發明公開了一種FBXL15蛋白及其抑制劑以及它們的應用。本發明保護FBXL15蛋白、所述FBXL15蛋白的編碼基因或含有所述編碼基因的重組表達載體在促進成骨細胞的分化中的應用。FBXL15蛋白或其編碼基因還可用于促進Smurf1蛋白的降解、促進Smurf1蛋白的泛素化、增強BMP通路活性。所述FBXL15蛋白是由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質。FBXL15本身能明顯增強成骨細胞的分化，即促進骨形成，可用于治療骨質疏松等疾病。
文檔編號C07K14/47GK102504021SQ201110375338
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月23日 優先權日2011年5月3日
發明者何珊, 崔宇, 張令強, 賀福初, 邢桂春 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所