雌激素受體和使用方法

專利名稱：雌激素受體和使用方法
雌激素受體和使用方法本申請是申請號為200580007467. 8 (PCT/US2005/007857)，申請日為 2005 年 3 月 10日的中國發明專利申請“雌激素受體和使用方法”的分案申請。繼續申請數據本申請要求享有2004年3月10日提交的美國臨時申請系列號60/552，067和2005 年1月13日提交的60/643，469的利益，其每篇都在這里引作參考。政府資助本文所述的發明是在健康和人類服務部(D^artment of Health and Human Services)資助號CA84328的支持下完成的。美國政府享有本發明的某些權利。
背景技術：
雌激素是在卵巢、睪丸和可能的腎上腺皮質中形成的類固醇化合物的總稱。雌激素和具有雌激素活性的化合物的實例包括二乙基己烯雌酚、己烯雌酚二磷酸酯、己雌酚、聚磷酸雌二醇、溴苯雌酚、氯烯雌醚、己二烯雌酚、二乙基己烯雌酚、丙甲雌酚、雙醋羥雌酮、6， 9-去氫馬烯雌酮、馬烯雌酮、雌二醇、雌三醇、雌酮、乙炔雌二醇、美雌醇、mexestrol、雌三醇環戊醚和炔雌醚。雌激素調節生殖組織和乳房、心血管、骨、肝和腦組織中的多種生理過程。 雌激素也用在口服避孕藥中。雌激素的其它用途包括，緩解絕經的不適，抑制泌乳，和治療骨質疏松癥、先兆流產和各種功能性卵巢病癥。抗雌激素藥被用于治療轉移性乳腺癌和晚期前列腺癌。雌激素的作用由雌激素受體介導。在1986年克隆了首個雌激素受體(ER) (Green 等，Nature, 320 :134(1986)和 Greene 等，Science, 231 1150 (1986))。在 1995 年之前， 認為僅有一個負責天然的和合成的雌激素和抗雌激素藥的所有生理和藥理作用的雌激素受體。然而，在1995年，克隆了第二個雌激素受體(Kuiper等，PNAS，93 :5925 (1996))。發現的首個雌激素受體現在稱作雌激素受體-α (ER- α )，而第二個雌激素受體稱作雌激素受體-β (ER- β )。ER-α 和 ER-β 共有共同的結構體系(Zhang 等，FEBS Letters, 546 :17(2003)和 Kong等，Biochem. Soc. Trans. ,31 :56(2003))。二者都由3個獨立的但是能相互作用的功能結構域組成N-末端A/B結構域、C或DNA-結合結構域和D/E/F或配體-結合結構域 (

圖1)。ER- α的N-末端結構域編碼獨立于配體的激活功能(AF-I)，即參加與輔激活物的相互作用和靶基因的轉錄活化的區域。DNA-結合結構域或C結構域含有2個鋅指結構，其在受體二聚化和與特定的DNA序列的結合中起重要作用。C-末端D/E/F結構域是一種配體-結合結構域，其能介導配體結合、受體二聚化、核轉位和配體-依賴性的反式激活功能 (AF-2)。AF-I和AF-2對轉錄控制的相對貢獻以細胞特異性的和DNA 啟動子特異性的方式變化(Berry 等，EMBO J.，9 :2811(1990)和 Tzukerman 等，Mol. Endocrin.，8 :21(1994)) 已經表明，缺少ER-α基因的全長基因產物的前173個氨基酸的46-kDa ER-α同種型(A/B或AF-I結構域)，源自跳過外顯子1的ER-α基因的可變剪接(Flouriot等，EMBO J.，19 :4688(2000))。該可變剪接事件會產生mRNA，其在有利于翻譯起始的Kozak序列內具有與原始可讀框的剩余部分符合讀框的AUG。因此，ER-a的該新同種型稱作ER-a 46，而原始同種型稱作 ER-α 66(Flouriot 等，EMB0J.，19 4688 (2000)) ER-α 46 形成同二聚體，并結合雌激素反應元件(ERE)，且它也可以與ER-α 66形成異二聚體(Flouriot等，EMBO J.， 19 :4688(2000))。與ER-α 66同二聚體相比，ER-α 46同二聚體表現出更高的對ERE的親和力。而且，ER-α 46/66異二聚體比ER-α 66同二聚體優先形成，且ER-α 46競爭地起作用，以抑制由結合了配體的-ER-α 66的AF-I結構域介導的反式激活，但是不影響AF-2-依賴性的反式激活(Floutiot等，EMBO J.，19 :4688 (2000))。因此，認為ER-α 46是天然產生的ER-α同種型，其調節由ER-a 66的AF-I結構域介導的雌激素信號傳導。ER-α能在大約15-30%內腔(luminal)上皮細胞中表達，但是根本不在正常人乳房中的任何其它細胞類型中表達。雙標記免疫熒光技術揭示，在正常的人和嚙齒動物乳腺中，ER-α -表達細胞能與用增殖標記物標記的細胞分開(Clarke等，Cancer Res. ,57 4987(1997))。在導管增生的最早期，ER-α表達會增加，甚至隨著異型的增加而增加更多，從而在低和中等核級的不典型導管增生和原位導管癌中的大部分細胞含有ER-α (Khan 等，Cancer Res.，54 :993 (1994)和 Lawson 等，Lancet，351 1787 (1994))。隨著 ER-α 表達的增加，受體表達和細胞增殖之間的反相關變得調節異常(Sioker等，Amer. Jour. Path.， 155 :1811 (1999))。大約70 %的侵入性乳腺癌表達ER- α，且這些腫瘤中的大部分含有 ER-α -陽性的增殖細胞(Clarke 等，Cancer Res. ,57 :4987 (1997))。雌激素受體是能控制許多生理過程的配體-活化的轉錄因子核受體超家族的成員。該控制經常通過調節基因轉錄來發生(Katzenellenbogen和Katzenellenbogen， Breast Cancer Res.，2 :335 (2000) ；Hull 等，J. Biol. Chem.，276 :36869 UOOl) ；McDonnell 和Norris，Science, 296 :1642 (2002))。雌激素受體使用多種機理，以激活或抑制它的靶基因的轉錄。這些機理包括(a)在雌激素反應元件處，配體-占據的受體與DNA的直接相互作用，隨后是轉錄輔調節物(coregulator)或介質復合物的募集，(b)配體-占據的ER 與其它轉錄因子相互作用，所述其它轉錄因子例如AP-I (Kushner等，J. Steroid Biochem. Mol. Biol. ,74 :311 (2000))、Spl (Safe, Vitam. Horm. ,62 :231 (2001))或 NF- κ B (McKay 和Cidlowski，Endocr. Rev.，20 :435(1999)),或(c)通過隔離一般的/普通的轉錄組分， 間接調節基因轉錄(Harnish 等，Endocrinology, 141 :3403(2000)和 Speir 等，Circ. Res. ,87 :1006(2000))。另外，雌激素受體通過這些不同的機理調節轉錄的能力，似乎是細胞類型特異性的，可能是由于在每種細胞類型中可得到的轉錄輔調節因子的補體的差異(Cerillo 等，J. Steroid Biochem. Mol. Biol.，67 :79 (1998) ；Evans 等，Circ. Res.，89 823(2001) ；Maret 等，Endocrinology, 140 :2876 (1999))。同樣，轉錄調節依賴于配體的性質，其中各種天然的和合成的選擇性的雌激素受體調節劑，通過這些不同機理中的每一種，起雌激素受體激動劑或拮抗劑的作用(Siang和Brown, Science, 295 =2465(2002)； Katzenellenbogen 禾口 Katzenellenbogen, Science,295 :2380(2002) ；Margeat 等，J. Mol. Biol.，326 77 (2003) ；Dang 等，J. Biol. Chem.，278 :962 (2003))。存在由雌激素介導的另一個信號傳導途徑，也稱作“非經典的”、“非基因組的”或 “膜信號傳導”途徑，其包含胞質蛋白、生長因子和其它膜-啟動的信號傳導途徑(Segars 等，Trends Endocrin. Met. , 13 :349 Q002))。已經表明，幾種細胞內的信號傳導途徑能與快速的雌激素-啟動的作用通訊腺苷酸環化酶途徑(Aronica等，PNAS，91 :8517 (1994))、磷脂酶 C 途徑(Le Mellay 等，J. Cell. Biochem. ,75 :138 (1999))、G-蛋白-偶聯的受體-活化的途徑(Razandi等，Mol. Endocrin.，13 :307(1999))和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK) 途徑(Watters等，Endocrinology, 138 :4030(1997))。但是，迄今為止描述的所有膜形式， 都與 ER- α 有關，但與 ER- β 無關(Segars 等，Trends Endocrin. Met.，13 :349 (2002))。病理上，雌激素信號傳導已經與乳腺癌和子宮內膜癌的高風險相關聯(Summer 禾口 Fuqua，Semin. Cancer Biol. , 11 :339(2001) ；Turner 等，Endocr. Rev. , 15 :275(1994)； Farhat 等，FASEB J.，10 :615 (1996) ；Beato 等，Cell，83 :851(1995) ；Dobrzycka 等，Endo. Rel. Cancer, 10 :517(2003)).結果，已經發現雌激素受體是大多數這樣的癌癥的開始和發展所必需的。雌激素受體-陽性的乳腺癌的當前內分泌療法主要針對雌激素水平、雌激素受體水平或雌激素和雌激素受體的活性設計。在早期乳腺癌的管理中，部分的抗雌激素藥他莫昔芬的使用，已經清楚地證實了無疾病和總存活的增加。另外，近期的研究證實，他莫昔芬可以用作激素-依賴性的乳腺癌的化學預防劑。使用他莫昔芬的長期療法的主要問題是它的親子宮作用，這會導致子宮內膜癌的高風險，和對他莫昔芬的獲得性臨床抗性。這已經導致了對更好的選擇性雌激素受體調節劑(SERM)的迫切尋求，所述調節劑在各種雌激素反應靶組織中表現出最佳的激動或拮抗活性。因此，需要可以用于篩選能調節雌激素信號傳導的其它方法和材料，以及可以用于調節雌激素信號傳導的方法和材料。發明概述本發明提供了分離的抗體，其能特異性地結合SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列， 或其免疫原性片段，優選地，SEQ ID NO :1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列。抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。任選地，抗體是人源化的抗體。抗體可以共價地附著化合物，例如，化療劑或檢測標記例如熒光標記。抗體可以存在于組合物中，且組合物可以包含藥學上可接受的載體。還提供了試劑盒，其包含本發明的抗體。本發明也提供了制備抗體的方法。抗體可以是多克隆的或單克隆的。該方法包括， 給動物施用具有SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列的多肽，或其免疫原性片段，優選地，SEQ ID NO 1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列。該方法還包括從動物分離抗體，其中該分離的抗體能特異性地結合氨基酸序列。多肽或其免疫原性亞基可以共價地附著載體多肽。分離可以包括，從動物得到產生該抗體的細胞，和使用該細胞制備能產生單克隆抗體的雜交瘤。 本發明還包括通過該方法生產的多克隆抗體和通過該方法生產的單克隆抗體。本發明也涉及包含外源編碼區的細胞，其中該編碼區編碼包含SEQ ID N0:20的多肽。編碼區可以編碼具有與SEQ ID NO :20具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽，其中該多肽具有ER-α 36活性。編碼區可以可操作地連接到組成型啟動子。細胞可以是真核細胞或原核細胞。本發明還提供了表達這樣的多肽的細胞。本發明還提供了鑒別結合多肽的試劑的方法。該方法包括，組合包含SEQ ID Ν0 1所述的氨基酸序列的多肽和試劑，檢測試劑和多肽之間的復合物形成，檢測多肽活性的改變，或其組合。通過直接檢測試劑與多肽的結合，使用競爭結合測定檢測試劑與多肽的結合，或其組合，可以檢測試劑與多肽的結合。任選地，該方法也包括，確定試劑是否結合包含 SEQ ID NO 18 的多肽。本發明還提供了檢測多肽的方法。一方面，該方法包括提供細胞，分析細胞中具有 ER- α 36活性和36kDa分子量的多肽，所述分子量如按照在十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠上電泳測得的，和確定細胞是否表達該多肽。細胞可以是離體的(ex vivo)或體內的。細胞可以是，例如，腫瘤細胞，例如乳腺腫瘤細胞。分析可以包括，使細胞接觸能特異性地結合SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列，或其免疫原性片段的抗體。分析可以包括，擴增 mRNA多核苷酸，以形成擴增的多核苷酸。擴增包括，使從細胞得到的多核苷酸接觸引物對， 后者能擴增mRNA多核苷酸，其包括SEQ ID N0:22或SEQ ID NO :25，或其組合，其中擴增的多核苷酸的存在表明該細胞表達多肽。引物對的一個引物可以選自SEQ ID N0:22的核苷酸，與SEQ ID NO 25的核苷酸互補的核苷酸，或其組合。本發明也提供了抑制細胞的ER-α 36活性的方法。該方法包括，使表達具有SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列的多肽的細胞接觸能抑制ER-a 36活性的化合物。這樣的化合物可以是能特異性地結合具有SEQ ID NO :1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列的多肽的抗體。細胞可以是體內的或離體的，且任選地可以是ER-α 66陰性的，ER-α 46陰性的，或其組合。在有些方面，化合物不是抗雌激素藥。本發明還提供了分離的多肽，其包含SEQ ID NO=I的氨基酸13-27所述的氨基酸序列，優選地SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列，更優選地，SEQ ID NO :20所述的氨基酸序列。在另一個方面，分離的多肽與SEQ ID NO :20具有至少70%同一性，其中該多肽具有 ER-α 36活性。本發明也包括SEQ ID NO :1的免疫原性片段。當這些術語出現在說明書和權利要求書中時，術語“包含”和其變體不具有限制含義。除非另有限定，可互換地使用“一個(a)”、“一個(an)”、“該(the) ”和“至少一個”，且指一個或多于一個。附圖簡述圖1解釋了人雌激素受體-a (ER-α)同種型的結構域結構代表。顯示了結構域 (用A-F標記的)、氨基酸序列編號、AF-I和AF-2、DNA結合結構域、配體-結合結構域和二聚化結構域。也指示了磷酸化位點和每個結構域的功能。圖2是證實ER-α的膜和基因組信號傳導途徑之間的可能的通訊的示意圖。Cav_l 代表小窩蛋白-1，ER-α，雌激素受體-α ；RTK，受體酪氨酸激酶；Ras，Ras癌基因；Mek， MAP/ERK激酶；MAPK，促分裂原活化蛋白激酶；PI3K，磷酸肌醇-三磷酸激酶；AKT，蛋白激酶 13 ；PDKl，磷酸肌醇-依賴性的蛋白激酶；RSK，p90核糖體S6激酶。圖3是顯示在有雌二醇(E》存在下，pRET-感染的MCFlOA細胞在軟瓊脂中生長成大菌落的照片。STl克隆在含有E2的軟瓊脂中表現出快速生長。分別包括MCF7和MCFlOA 細胞作為陽性和陰性對照。圖4是顯示pRET-感染的MCFlOA細胞中的小窩蛋白_1 (Cavl)表達的下調的蛋白印跡。通過使用兔抗-Cav-I抗體(N20)的蛋白印跡，分析來自不同細胞系的等量的全細胞提取物。用箭標指示Cav-I的位置，且在每個泳道上面指示在每個泳道中分析的細胞提取物。圖5是顯示pRET-感染的MCFlOA細胞中的ER-α表達的下調的蛋白印跡。通過使用針對ER-a (H222)和ER-β的抗體的蛋白印跡，分析來自不同細胞系的等量的全細胞提取物。用箭標指示ER-α和ER-β的位置，且在每個泳道上面指示在每個泳道中分析的細胞提取物。圖6是顯示pRET-感染的MCFlOA細胞中的ERK1/2磷酸化的活化的蛋白印跡。通過使用針對ERK1/2和磷酸化的ERK1/2的抗體的蛋白印跡，分析來自細胞系的等量的全細胞提取物。圖7是顯示3種ER-α蛋白在Cav-Ι單倍體不足(haploinsuff icient)細胞STl 和ST3和MCF7乳腺癌細胞中的存在的蛋白印跡。通過使用針對ER-α的Η222抗體的蛋白印跡，分析來自細胞系的等量的全細胞提取物。用箭標指示ER- α 66、ER- α 46和ER- α 36 的位置，且在每個泳道上面指示在每個泳道中分析的細胞提取物。圖8描繪了人ER-α基因的基因組組織。用箭標指示多個啟動子的位置。用AUG 和UGA指示翻譯起始和終止位置。用編號的框顯示外顯子。也用框中的外顯子1'顯示內含子1。下圖顯示了 ER-α同種型的mRNA結構。用AAA指示聚腺苷酸化位點。圖9是瓊脂糖凝膠的圖片，它顯示了通過PCR分離能編ER- α 36的可讀框的cDNA。 用箭標指示cDNA在凝膠中的位置。圖10顯示了 ER-α 36可讀框的預測的氨基酸序列。用氨基酸序列(SEQ ID NO 20)左側的編號，指示氨基酸位置。ER- α 36獨有的最后的27個氨基酸標有下劃線(SEQ ID NO :1)。圖11顯示了 ER-α 66、ER-α 46和ER-α 36的蛋白印跡分析。標記為ER-α 66、 ER-α 46和ER-a 36的泳道代表著用能編碼所述的雌激素受體同種型的表達質粒轉染、并在轉染后2天裂解的HEK 293細胞的分離的培養物。用抗-ER-α抗體0122 ，免疫檢測每種轉染子的裂解物。來自MCF7細胞的細胞提取物用作陽性對照。用箭標指示ER-α 66、 ER- α 46 禾口 ER- α 36 的位置。圖12顯示了 (a)能編碼ER-α 36且包含ER-α 36啟動子的基因的5'側翼序列的DNA序列(SEQ ID NO 22)，和(b)能編碼ER- α 36且包含由外顯子9編碼的核苷酸的基因的3'側翼序列的DNA序列(SEQ ID NO :25)。在5'側翼序列中，推定的轉錄結合位點標有下劃線，且也指示了能結合核酸序列的蛋白。也用箭標指示了 cDNA的起始位點。圖13顯示了不同的乳腺癌細胞MCF10A、T47D、MCF7和MDA-MB-231中的ER-α 36 的RNA印跡分析。用箭標指示了 ER- α 36和肌動蛋白的位置。圖14顯示了 ER- α 36對ER- α 66和ER- β的AF-1和AF-2結構域介導的轉錄轉反式激活活性的抑制。(+Ε》，Ε2處理的細胞；(-Ε》，未用Ε2處理的細胞。圖15顯示，ER-a 36能介導由E2刺激的膜-啟動的MAPK激酶途徑。(a)蛋白印跡顯示了用雌二醇-17 β (E2 β )處理ER 36-293細胞，會誘導Mekl/2和ERK1/2的快速磷酸化。P-Mekl/2和P-ERK1/2,分別是Mekl/2和ERK1/2的磷酸化形式。(b)血清(而不是E2 β )會誘導對照載體-293細胞中的ERK1/2的磷酸化。P-ERK1/2是ERK1/2的磷酸化形式。(c)不同的雌激素和抗雌激素藥會誘導ER36-293細胞中的ERK1/2的快速磷酸化。 P-ERK1/2是ERK1/2的磷酸化形式。(d)他莫昔芬處理能組成型地刺激ER36-293細胞中的 ERK1/2磷酸化。P-ERK1/2是ERK1/2的磷酸化形式。圖16表明，ER-α 36能介導Ε2 β誘導的MAI3K激酶核信號傳導，并刺激細胞生長。 (a) E2 β對MAPK激酶核信號傳導的作用。用5XGal4_LUC，即含有5個DNA結合位點的螢光素酶報告質粒，和含有與Gal4DNA結合結構域融合的ELK轉錄活化結構域的Gal-ELK 表達載體(上圖)，瞬時轉染了 ER36-293和對照載體-293細胞。轉染后，將細胞培養物維持在沒有雌激素的培養基中36小時，然后加入E2 β (InM或IOnM) 12小時。具有標準差的螢
9光素酶活性代表著一式兩份進行的超過3次實驗。(b)E2i3和抗雌激素藥能刺激ER36493 細胞的生長。顯示了在490nm的吸光度數據。平均了超過5次獨立實驗的結果；顯示了平均值和SEM。還通過成對的t-檢驗，評價了這些結果的統計學顯著性。ER36-293和載體-293 細胞的P-值小于0. 001。圖17表明，ER- α 36主要是基于膜的雌激素受體。(a)蛋白印跡分析ER-α 36在不同的確立的乳腺癌細胞系中的表達。剝離相同的印跡，并用抗-肌動蛋白抗體探測，以確保等量裝載。(b) ER-α 36在ER-α 36轉染的293細胞中的亞細胞定位。用ER-α 36特異性的抗體，免疫印跡不同的亞細胞級分中的ER-α 36。W，全細胞裂解物；ΡΜ，質膜；C，胞質溶膠；N，核。通過免疫印跡質膜、胞質溶膠、核和高爾基體的各種蛋白標記，檢查亞細胞級分純度。5' NT, 5'核苷酸酶；D4-GDI，GDP解離抑制劑；mSin3A，組蛋白重構復合物的組分； COPB，β外被蛋白。圖18表明，Ε2 β能促進ER- α 66陰性的乳腺癌細胞MDA-MB-231在軟瓊脂中的生長。在不存在Ε2β (0)、存在IOnM Ε2 β (Ε2)、存在IOnM Ε2 β和IOnM他莫昔芬(Ε2+ΤΑΜ) 和存在單獨的IOnM他莫昔芬(TAM)的情況下，使MDA-MB-231細胞在軟瓊脂上生長3周。圖19表明，Ε2 β能誘導ER- α 66陰性的乳腺癌細胞MDA_MB_231中的膜啟動的雌激素信號傳導。用雌二醇-17 β (E2 β )處理MDA-MB-231細胞，會誘導ERK1/2的快速磷酸化。用Ε2β (IOnM)處理細胞不同的時間點，使所述細胞裂解，并使用磷酸化依賴性的和非依賴性的抗體，通過蛋白印跡進行分析。本發明的優選實施方案的詳述已經發現，小窩蛋白-1 (Cav-I)系統的下調會組成型激活促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK)途徑，激活雌激素受體-a (ER-α)的表達，和觸發正雌激素信號傳導。該發現首次提供了活化的ΜΑΗ(信號傳導和乳房腫瘤發生(尤其是由雌激素刺激的乳腺癌發展)之間的清楚的聯系。該發現有力地提示，Cav-I通過協調MAPK和雌激素信號傳導途徑之間的通訊，在維持乳房上皮細胞的正常生長中起重要作用，且它的下調可能有助于這2個重要途徑的調節異常，這最終導致乳腺腫瘤發生。圖2顯示了雌激素信號傳導途徑和ΜΑΗ(信號傳導途徑的示意圖。還已經鑒別和克隆了雌激素受體-α同種型。從位于原始的66-kDa ER-α (ER-α 66)基因的第一個內含子中的啟動子，產生了雌激素受體-α的該36_kDa同種型(ER- α 36)。ER- α 36不同于ER- α 66，因為它缺少2個轉錄活化結構域(AF_1和AF_2)， 但是保留了 DNA-結合、二聚化和大部分的配體-結合結構域。ER-α 36的結構表明，ER-α 36 是雌激素信號傳導的調節劑。ER-a 36也可以介導雌激素信號傳導的膜作用，因為它主要在質膜上表達，且也在胞質溶膠和核中表達。已經將ER-β視作ER-a 66介導的雌激素信號傳導的組成型調節劑。發現缺少 AF-I結構域的ER- α 46可以二聚化成ER- α 66，并抑制由ER- α 66的AF-1結構域介導的反式激活活性，這表明ER-CI46在由ER-CI66的AF-I結構域介導的功能活性中起調節作用。 ER- α 36缺少AF-I和AF-2結構域。因而，認為ER- α 36會抑制由ER- α 66的AF-I和AF-2 介導的生物功能，以及由ER- α 46的AF-2介導的功能。利用ER- α 36和ER- α 46介導的調節，其二者可能在不同的組織中以不同的水平表達，ER-a 66可以在不同的靶組織中不同地起作用。認為這樣的機理能解釋不同生物過程中的雌激素信號傳導的多效性作用。
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本發明的多肽和肽模仿物(p^tidomimetic)本發明提供了多肽。如本文使用的，術語“多肽”泛指通過肽鍵連接到一起的2個或更多個氨基酸的聚合物。術語肽、寡肽和蛋白都包含在多肽的定義中，且這些術語可互換地使用。應當理解，這些術語不意味著氨基酸聚合物的特定長度，它們也無意暗示或區分多肽是否由重組技術、化學或酶促合成生成，或是天然產生。本文公開和描述了本發明范圍內的多肽的多個實例。在天然產生的多肽或多核苷酸的情況下，優選地，分離這樣的多肽或多核苷酸，并任選地純化。“分離的”多肽或多核苷酸是從它的天然環境分開和分離的多肽或多核苷酸。“純化的”多肽或多核苷酸是至少60%地不含、優選地75%地不含和最優選地 90%地不含它們天然地伴隨的其它組分的多肽或多核苷酸。認為在它們天然發生的生物外面生產(例如，通過化學或重組方法)的多肽和核苷酸，是定義的分離的和純化的，因為它們從未存在于天然環境中。“外源多肽”指外來多肽，即通常不存在于細胞中的多肽，或通常存在于細胞中、但是已經通過實驗方法導入細胞中(例如，通過導入能編碼該多肽的多核苷酸)的多肽。本發明的多肽可以是生物活性的。這樣的生物活性在本文中稱作“ER-a 36活性”。 可以用于確定本發明的多肽是否是生物活性的生物測定的實例包含，使能表達該多肽的細胞接觸雌激素或抗-雌激素藥，并測定在有雌激素或抗-雌激素藥存在的情況下，與不表達本發明的多肽的對照細胞中的MAPK活性相比，MAPK途徑的活性是增高還是降低。優選地， MAPK活性是ERK 1/2和Mek 1/2的磷酸化，且優選地，在有抗-雌激素藥存在的情況下，本發明的多肽誘導的ERK1/2的磷酸化不減少。優選地，ER-a 36活性是膜啟動的。通過暴露能表達具有對不同配體的ER-α 36活性的多肽的細胞，可以測量ER-α 36活性。可以使用的配體的實例，包括但不限于，雌酮(El)、17 α-雌二醇(Ε2α)、17β-雌二醇(Ε2β)、雌三醇(Ε3)、雌四醇(estetrol) (E4)或附著到不可透過膜的分子，例如牛血清清蛋白(BSA)的雌激素。通常，當待測ER- α 36活性限于膜啟動的ER- α 36活性時，使用附著到不可透過膜的分子上的雌激素。使用的雌激素的量可以變化，且優選地，在InM至IOnM的范圍內。暴露于雌激素的細胞優選地是休眠細胞。該暴露允許發生5-90分鐘，然后裂解細胞，并通過 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離存在于細胞中的多肽。將分離的多肽轉移到膜上后，使用針對非磷酸化和磷酸化形式的ERK 1/2和Mek 1/2的抗體，評價MAI3K途徑的活化。任選地， 可以包括抗-雌激素藥，例如他莫昔芬、40Η-他莫昔芬或ICI-182，780，以確定ERK 1/2的磷酸化是否對抗雌激素藥不敏感。本發明提供了具有SEQ ID NO :20所述的氨基酸序列的多肽。該多肽，和本文所述的有關多肽，在本文中也稱作ER-α 36、ER_ α 36同種型和ER受體α 36-亞基。如圖1所示， 當與ER- α 66同種型相比較時，ER- α 36同種型缺少氨基-末端氨基酸殘基1_183，羧基-末端氨基酸殘基430-595，且在它的C-末端具有27個氨基酸殘基的添加(見表1)。雌激素受體α異構體包括ER-α 36、ER-α 46、ER-α 66。雌激素受體β異構體包括ER-β。本發明也提供了雌激素受體，其包括ER-α 36同種型。無意進行限制，認為ER-α 36同種型能通過與ER- α 66、ER- α 46或ER- β形成二聚體，通過調節雌激素受體功能，來調節細胞對雌激素的反應。而且，認為ER- α 36缺少活化因子1 (AF-I)和活化因子2 (AF-2)活性，并因而缺少內在的轉錄活性。但是，認為ER- α 36保留了完整的二聚化結構域，其允許ER- α 36與 ER- α 46,ER- α 66或ER- β 二聚化。認為該相互作用允許ER- α 36調節含有雌激素受體的ER- α 46、ER- α 66 禾口 ER- β 的活性 c表 1氨基酸和核苷酸序列
權利要求
1.分離的抗體，其能特異性地結合SEQID NO :1所述的氨基酸序列的免疫原性片段， 所述免疫原性片段含有至少5個連續氨基酸。
2.權利要求1的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
3.權利要求1的抗體，其中所述抗體是多克隆抗體。
4.權利要求1的抗體，其中所述抗體是人源化的抗體。
5.權利要求1的抗體，其中所述抗體是抗體片段。
6.權利要求1的抗體，其中所述抗體共價附著到化合物。
7.權利要求6的抗體，其中所述化合物是化療劑。
8.權利要求6的抗體，其中所述化合物是檢測標記。
9.權利要求8的抗體，其中所述檢測標記是熒光標記。
10.組合物，其包含權利要求1的抗體。
11.權利要求10的組合物，還包含藥學上可接受的載體。
12.制備抗體的方法，其包括給動物施用包含SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列的免疫原性片段的多肽，和從該動物分離抗體，其中所述免疫原性片段含有至少5個連續的氨基酸，所述分離的抗體能特異性地結合該免疫原性片段。
13.權利要求12的方法，其中所述多肽共價附著到載體多肽上。
14.權利要求12的方法，其中所述分離包含從動物得到能產生該抗體的細胞，該方法還包含使用該細胞制備能產生單克隆抗體的雜交瘤。
15.通過權利要求12的方法生產的多克隆抗體。
16.通過權利要求14的方法生產的單克隆抗體。
17.包含外源編碼區的細胞，其中所述編碼區能編碼包含SEQIDNO :20的第一個多肽， 或包含與SEQ ID NO :20具有至少90%同一性的氨基酸序列的第二個多肽，其中所述第二個多肽具有ER-α 36活性。
18.權利要求17的細胞，其中所述編碼區可操作地連接到組成型啟動子上。
19.權利要求17的細胞，其中所述細胞是真核細胞。
20.權利要求17的細胞，其中所述細胞是原核細胞。
21.能表達外源多肽的細胞，其中所述多肽包含SEQID NO :20，或包含與SEQ ID NO: 20具有至少90%同一性且具有ER- α 36活性的氨基酸序列。
22.權利要求21的細胞，其中所述編碼區可操作地連接到組成型啟動子上。
23.權利要求21的細胞，其中所述細胞是真核細胞。
24.權利要求21的細胞，其中所述細胞是原核細胞。
25.鑒別能結合多肽的試劑的方法，該方法包含組合包含SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列的多肽和試劑，和檢測試劑和多肽之間的復合物形成。
26.權利要求25的方法，其中通過選自下述的方法，檢測所述試劑與多肽的結合直接檢測試劑與多肽的結合，和使用競爭結合測定檢測試劑與多肽的結合。
27.權利要求25的方法，還包含，確定試劑是否能結合包含SEQIDNO 18的多肽。
28.權利要求25的方法，還包含，確定試劑是否能抑制多肽的ER-α36活性。
29.檢測多肽的方法，其包括提供離體細胞，確定所述細胞中是否表達具有36kDa分子量且具有如SEQ ID NO :20所示氨基酸序列或與SEQ ID NO :20具有至少90%同一性的多肽，所述分子量如按照十二烷基硫酸鈉 (SDS)-聚丙烯酰胺凝膠上的電泳測得。
30.檢測多肽的方法，其包括提供離體細胞，確定所述細胞中是否表達具有36kDa分子量且含有SEQ ID NO 1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列的多肽，所述分子量如按照十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠上的電泳測得。
31.權利要求四或30的方法，其中所述細胞是腫瘤細胞。
32.權利要求31的方法，其中所述腫瘤是乳腺腫瘤。
33.權利要求四或30的方法，其中所述確定包括，使細胞接觸能特異性地結合SEQID NO 1所述的氨基酸序列，或其免疫原性片段的抗體。
34.權利要求33的方法，其中所述抗體共價附著到檢測標記上。
35.權利要求34的抗體，其中所述檢測標記是熒光標記。
36.權利要求四或30的方法，其中所述確定包括，擴增mRNA多核苷酸，以形成擴增的多核苷酸，其中所述擴增包含，使從細胞得到的多核苷酸接觸引物對，后者能擴增mRNA多核苷酸，其包括SEQ IDN0:22或SEQ ID NO :25，或其組合，其中擴增的多核苷酸的存在表明該細胞表達多肽。
37.權利要求36的方法，其中引物對的一個引物選自SEQID NO 22的核苷酸，與SEQ ID NO 25的核苷酸互補的核苷酸，或其組合，且其中每個引物具有至少15個核苷酸。
38.抑制細胞的ER-α36活性的方法，其包括使能表達包含SEQID NO 1的氨基酸 13-27所述的氨基酸序列的多肽的細胞，接觸能抑制ER-α 36活性的化合物。
39.權利要求38的方法，其中所述化合物包含權利要求1-9任一所述的抗體。
40.權利要求39的方法，其中所述化合物包含能特異性地結合包含SEQID Ν0:1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列的多肽的抗體。
41.權利要求38的方法，其中所述細胞是離體的。
42.權利要求38的方法，其中所述細胞是ER-α66陰性的。
43.權利要求38的方法，其中所述細胞是ER-α46陰性的。
44.權利要求38的方法，其中所述化合物不是抗-雌激素藥。
45.在體外抑制細胞中的ERK1/2或ΜΕΚ1/2磷酸化的方法，其包括使細胞接觸權利要求1-9任一所述的抗體；其中，所述細胞能表達具有36kDa分子量、能結合雌激素且包含SEQ ID NO :1的氨基酸 13-27所述的氨基酸序列的多肽，所述分子量如按照十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠上的電泳測得，且所述抗體的劑量能夠抑制雌激素和SEQ ID N0:20的結合。
46.權利要求45所述的方法，其中所述抗體能特異性地結合包含SEQID N0:1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列的多肽。
47.分離的多肽，其由SEQID NO :1的氨基酸1-27所述的氨基酸序列或其修飾的序列組成，所述修飾的序列是通過添加、取代或缺失一個或多個鄰接的或不鄰接的氨基酸來修飾的SEQ ID NO :1的氨基酸1-27，并且所述修飾的序列能夠刺激產生結合SEQ ID N0:1的氨基酸1-27的抗體。
48.分離的多肽，其由SEQID NO :1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列或其修飾的序列組成，所述修飾的序列是通過添加、取代或缺失一個或多個鄰接的或不鄰接的氨基酸來修飾的SEQ ID NO 1的氨基酸13-27，并且所述修飾的序列能夠刺激產生結合SEQ ID NO 1的氨基酸13-27的抗體。
49.分離的多肽，含有共價附著到載體多肽上的權利要求47或48所述的多肽。
50.分離的多核苷酸，其編碼權利要求47-49任一所述的多肽。
51.SEQ ID NO 1的免疫原性片段，含有SEQ ID NO=I中的至少5個連續氨基酸。
52.試劑盒，其包含權利要求1-9任一所述的分離的抗體和包裝材料。
53.權利要求1-9任一所述的抗體用于制備診斷試劑的用途，所述診斷試劑用于區分雌激素陽性和雌激素陰性的癌癥。
54.權利要求53的用途，所述區分雌激素陽性和雌激素陰性的癌癥是通過檢測細胞中是否表達具有36kDa分子量且能夠結合雌激素或抗雌激素的多肽，所述分子量如按照十二烷基硫酸鈉(SDQ -聚丙烯酰胺凝膠上的電泳測得。
55.權利要求1-9任一所述的抗體用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療個體中雌激素相關的癌癥，其中所述抗體能夠抑制雌激素與細胞的SEQ ID N0:20的結合。
全文摘要
本發明提供了分離的多肽，其氨基酸序列與SEQ ID NO20具有至少70％同一性，其中該多肽具有ER-α36活性。本發明還提供了鑒別能能結合這樣的多肽的試劑的方法，檢測這樣的多肽的方法，和改變這樣的多肽的活性的方法。還提供了能特異性地結合SEQ ID NO1所述的氨基酸序列，或其免疫原性片段的抗體，和制備和使用這樣的抗體的方法。
文檔編號C07K16/00GK102504025SQ20111035182
公開日2012年6月20日 申請日期2005年3月10日 優先權日2004年3月10日
發明者王兆一 申請人:克賴頓大學