專利名稱：一種阿霉素-多肽復合物、藥物組合物的制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及腫瘤治療相關的藥物領域，具體而言，本發明涉及一種小分子抗癌藥物阿霉素與一種兩性多肽的復合物，該復合物能夠增加阿霉素的吸收效果，并且具有緩釋效果。本發明還涉及該復合物的制備方法及其應用。
背景技術：
阿霉素(Adriamycin)又稱輕柔紅霉素、輕正定霉素、多柔比星(Doxorubicin)、ADR,屬于蒽環霉素類抗生素，于上世紀60年代初由米蘭Farmitalia ResearchLaboratories從一種鏈霉菌中分離出來。阿霉素是繼柔紅霉素之后發現的第二個蒽環霉素類抗生素，其與柔紅霉素的結構基本相同(差異只在一個羥基上)，但柔紅霉素只對急性白血病(leukemia)有效，而阿霉素對惡性腫瘤的治療范圍則很寬。阿霉素是一種光譜抗腫瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，對RNA的抑制作用最強，對多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用。主要適用于急性白血病，對急性淋巴細胞白血病、粒細胞白血病、乳腺癌、肉瘤、肺癌、膀胱癌等其他各種癌癥都有一定療效。阿霉素此類蒽環霉素類抗生素具有阻斷DNA和RNA合成的作用，因此處于活躍細胞周期的速增生組織如腫瘤組織(但也包括骨髓、胃腸道和粘膜、毛囊)細胞對此種藥物最為敏感。阿霉素對腫瘤細胞的殺傷作用主要包括以下幾方面:I)嵌入到DNA鏈中的兩個核苷酸之間，形成DNA-阿霉素復合物，從而阻斷DNA的合成與轉錄；2)與細胞內的負責DNA合成的拓撲異構酶II (Topoisomerase II)相結合,阻止其進行DNA合成；3)參與 細胞內的氧化還原反應，代謝產生自由基，可形成細胞毒化合物如過氧化物、活性的氫氧基和過氧化氫；4)作用于細胞膜上的脂類，產生多種不同的作用。阿霉素的作用機制決定了其具有一定程度的細胞毒作用，尤其體現在心臟毒性上。阿霉素的心臟毒性主要來自于有損傷作用的氧自由基，也可能是部分因拓撲異構酶II受到抑制而產生的。氧自由基導致脂膜的過氧化，抑制線粒體呼吸，氧自由基還通過改變鈣離子釋放通道的敏感性導致心臟內的鈣釋放。另外由于心肌組織中也缺乏能破壞自由基的酶，所以與其它組織相比，心肌組織對阿霉素的細胞毒作用更為敏感。目前針對阿霉素的研究主要致力于保證腫瘤抑制療效的同時降低其心臟毒性，例如采用前藥形式、采用脂質載體、與抗自由基藥物聯合給藥等。其中應用最多的是采用脂質體包裹阿霉素，某些研究還將靶向單抗附著在脂質體上以增加藥物靶向性。脂質體的包裹能夠使藥物具有一定的靶向性和緩釋性，使藥物特異性地集中作用于腫瘤組織(尤其是硬質腫瘤)而提高治療指數和藥物療效，減少藥物毒性
發明內容
本發明的一個目的是針對臨床上采用阿霉素治療腫瘤所產生的心臟毒性、靶向性、吸收性等問題，提供了一種阿霉素與親疏水兩性多肽復合物，該復合物能夠增強細胞對藥物的吸收，一定程度上增加藥物對腫瘤組織尤其是硬性腫瘤的靶向性，并降低阿霉素對心臟產生的細胞毒作用，且具有緩釋藥物的特性。本發明的另一個目的是提供上述阿霉素-兩性多肽復合物的制備方法，同時也提供上述復合物在治療腫瘤方面的藥物制備及應用。本發明的又一個目的是提供一種以阿霉素-兩性多肽復合物為主要有效成分的藥用組合物。用于實現上述目的的技術方案如下所述:I)阿霉素-兩性多肽復合物的組成該復合物由阿霉素和兩性多肽組成，其中優選的兩性多肽Ppl的序列如式I (SEQID NO I)所示，兩性多肽Pp2的序列如式II (SEQ ID NO I)所示。Ppl:GLffffKAffffKAffffKSLffffRKRKRKA式I (SEQ ID NO I)Pp2 =GLffffKVffffKLffffKSLffffRKRLRKA式II (SEQ ID NO 2)2)阿霉素-兩性多肽復合物組分比例阿霉素(MW:543.52)能與兩性多肽Ppl (MW:3329)或兩性多肽Pp2 (MW:3384)形成的不同比例的復合 物，以摩爾計算，從10:1到1: 100，不同的比例得到的復合物具有不同的包裹特性，從1:1到1: 50之間的比例形成的復合物具有更強的作為藥用的實用性，更優先的范圍為1: 2.5到1: 25。3)復合物的制備上述多肽復合物的制備方法包括:按照摩爾比例，稱取適量的阿霉素，溶于適量的生理鹽水、純水或PBS緩沖液中，稱取適量的兩性多肽Ppl或Pp2，溶于適量的生理鹽水(或PBS^K )中，在O 5°C溫度下，超聲混合I 15分鐘，或者攪拌I 3小時，也可放置過夜。所制備得到的溶液可以直接加輔料做成制劑，也可以冷凍干燥后再與其他輔料一起制成制劑。注:PBS為磷酸鹽。4)藥物組合物的制備所述的藥物組合物可包含一種或多種藥學上可接受的輔料，這些輔料包括:水溶性填充劑、PH調節劑、穩定劑、注射用水、滲透壓調節劑等等。本發明所述的水溶性填充劑輔料為選自以下的一種或一種:甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等。PH調節劑為選自以下的一種或一種:枸櫞酸、磷酸、乳酸、酒石酸、鹽酸等非揮發性的酸以及氫氧化鉀、氫氧化鈉或氫氧化鉀或氫氧化銨、碳酸鈉或碳酸鉀或碳酸銨鹽、碳酸氫鈉或碳酸氫鉀或碳酸氫銨鹽等生理可接受的有機或無機酸和堿及鹽等。穩定劑為選自以下的一種或一種:EDTA_2Na、硫代硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸鈉或三羥甲基氨基甲烷等。優選焦亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、精氨酸、聚乙二醇6000、三羥甲基氨基甲烷。
滲透壓調節劑是氯化鈉、氯化鉀的一種或兩種的組合。所述藥物組合物中阿霉素-兩性多肽復合物和輔料的摩爾比優選為1:1到I: 50，進一步優選1: 2.5到1: 25。本發明的藥用組合物可以通過肌肉、靜脈內、皮下注射途經進行給藥，優選的劑型為凍干粉或溶液注射劑。冷凍干燥注射劑的制備方法:取阿霉素和兩性多肽溶液適量，加入水溶性填充劑、穩定劑、滲透壓調節劑等，加入注射用水適量，調節PH值至4-8使其溶解，加水稀釋至適當濃度，加入0.1 0.5%活性炭，在O 10°C下攪拌10 20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液進行分裝，采用冷凍干燥法，制得白色疏松塊狀物，封口即得，每個規格含有阿霉素在5mg到IOmg之間。注射液的制備方法:取阿霉素和兩性多肽溶液或凍干粉適量，加入水溶性填充劑、穩定劑、滲透壓調節劑等，加入注射用水適量，調節PH值至4 8使其溶解，加水稀釋至適當濃度，加入0.1 0.5%活性炭，在O 10°C下攪拌10 20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液進行分裝，封口即得，每個規格含有阿霉素在5mg到IOmg之間。5)藥用組合物用法本發明的藥用組合物可以用在制備糖尿病治療藥物方面。具體地，本發明的復合物可以靜脈、肌肉或皮下注射劑形式給藥。雖然劑量依治療對象、給藥方式、癥狀及其它因素而改變，本發明的組合物在相當寬的劑量范圍內是有效的。在臨床治療中，單獨用藥時，成人劑量為按體表面積一次60 90mg/m2,聯合化療時,每次50 60mg/m2靜脈注射。根據病人血象可間隔21天重復使用。。實際劑量應該由醫生根據有關的情況來決定，這些情況包括被治療者的身體狀態、給藥途徑、年齡、體重、患者對藥物的個體反應，患者癥狀的嚴重程度等等，因此上述劑量范圍并不是以任何方式限制本發明的范圍。
圖1為阿霉素-兩性多肽復合物對Hela細胞增殖的抑制效果；圖2為阿霉素-兩性多肽復合物對MCF-7細胞增殖的抑制效果。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。實施例1:兩性多肽Ppl和Pp2的制備、 鑒定和純化根據兩性多肽Ppl序列(如SEQ ID NO I)和Pp2序列(如SEQ ID NO I)合成所需的氨基酸，以氨基端受Fmoc保護的氨基酸為原料，采用固相合成法于Libertyl單通道全自動微波多肽合成系統(購于美國培安科技公司北京辦事處)上進行合成，合成方法參照生產商的儀器說明書進行。經過Fmoc氨基酸(購于上海吉爾生化)的脫保護、耦合以及最后的切割反應，最終形成目的多肽。所得多肽經由質譜檢測分子量確定，HPLC純化，并經上海生工生物技術公司測序確認。本專利同樣適用于使用其它的多肽制備方法，例如細菌、酵母、哺乳動物細胞蛋白表達體系及無細胞蛋白表達體系。
實施例2:阿霉素與兩性多肽Ppl的1: 10復合物按照阿霉素與兩性多肽Ppl摩爾比例(以下比例沒有注明同為摩爾比)1: 10，稱取0.1mg的阿霉素(MW:543.52)凍干粉，溶于Iml生理鹽水，充分混勻后，稱取6.12mg兩性多肽Ppl (MW:3329)溶于上述含阿霉素的生理鹽水中，充分混勻后，在O 10°C溫度下，超聲混合5分鐘，得到復合物溶液，如果立即制備制劑，可以直接往下操作不需要凍干。實施例3:阿霉素與兩性多肽Ppl的10: I復合物稱取Img的阿霉素凍干粉,溶于Iml生理鹽水,充分混勻后,稱取0.61mg兩性多肽Ppl凍干粉溶于上述阿霉素生理鹽水中，充分混勻后，在O 10°C溫度下，攪拌3小時，冷凍干燥得到復合物固體粉末。實施例4:阿霉素與兩性多肽Ppl的1: 2.5復合物稱取0.1mg的阿霉素凍干粉,溶于Iml純水，充分混勻后，稱取1.53mg兩性多肽Ppl凍干粉溶于上述阿霉素水溶液 中，充分混勻后，在O 5°c溫度下，攪拌3小時，冷凍干燥得到復合物固體粉末。實施例5:阿霉素與兩性多肽Ppl的1: 25復合物稱取0.1mg的阿霉素凍干粉,溶于Iml純水，充分混勻后，稱取15.3mg兩性多肽Ppl凍干粉溶于上述阿霉素水溶液中，充分混勻后，在O 5°C溫度下，攪拌3小時，冷凍干燥得到復合物固體粉末。實施例6:阿霉素與兩性多肽Pp2的1:1復合物稱取0.1mg的阿霉素凍干粉，溶于Iml PBS緩沖液，充分混勻后，稱取0.62mg兩性多肽Pp2(MW:3384)凍干粉溶于上述含阿霉素的PBS緩沖液中，充分混勻后，在O 5°C溫度下，放置過夜，冷凍干燥得到復合物固體粉末。實施例7:阿霉素與兩性多肽Pp2的1: 10復合物稱取0.1mg的阿霉素凍干粉,溶于Iml純水中，充分混勻后,稱取6.2mg兩性多肽Pp2凍干粉溶于上述含阿霉素的溶液中，充分混勻后，在O 5°C溫度下，放置過夜，冷凍干燥得到復合物固體粉末。實施例8:阿霉素與兩性多肽Pp2的1: 25復合物稱取0.1mg的阿霉素凍干粉，溶于Iml PBS緩沖液，充分混勻后，稱取15.5mg兩性多肽Pp2凍干粉溶于上述含阿霉素的PBS緩沖液中，充分混勻后，在O 10°C溫度下，攪拌I小時，冷凍干燥得到復合物固體粉末。實施例9:阿霉素與兩性多肽Pp2的1: 50復合物稱取0.1mg的阿霉素凍干粉，溶于Iml PBS緩沖液，充分混勻后，稱取31mg兩性多肽Pp2凍干粉溶于上述含阿霉素的PBS緩沖液中，充分混勻后，在(TC左右超聲混合5分鐘，(TC左右放置，備用，I 3小時內用于制備注射劑。實施例10:阿霉素與兩性多肽Pp2的1: 100復合物稱取0.1mg的阿霉素凍干粉,溶于2ml生理鹽水,充分混勻后，稱取62mg兩性多肽Pp2凍干粉溶于上述含阿霉素的生理鹽水中，充分混勻后，在O 10°C溫度下，放置過夜，冷凍干燥得到復合物固體粉末。實施例U:凍干粉型藥物組合物的制備取適量的容器加泊洛沙姆0.05g、甘露醇0.2g、乳糖0.lg、注射用水3ml，攪拌使溶解，加lmol/L的枸櫞酸或氫氧化鈉調節PH至6.0，冷卻至5°C，取實施例2方法制備的復合物溶液5ml加入其中，繼續調補PH至6.0，加水至10ml。加入20mg活性碳，在5°C下攪拌20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液按每支0.2ml進行分裝，預凍2小時后，冷凍下減壓干燥12小時，至樣品溫度到5°C后，再干燥2小時，制得白色疏松塊狀物，封口即得阿霉素-兩性多肽復合物的藥物組合物，置于預充式的注射器中，規格為100 μ g/支，rc以下保存，注射前以200 μ I注射用水溶解后給藥。實施例12: 溶液注射劑型藥物組合物的制備取適量的容器加山梨醇0.lg、乳糖0.lg、NaCl 20mg,枸櫞酸10mg、注射用水7ml,攪拌使溶解，加lmol/L的枸櫞酸或氫氧化鈉調節PH至6.5，冷卻至0°C，取以實施例4的方法制得的復合物粉末適量加入其中，繼續攪拌溶解，調補PH至6.5，加水至10ml。加入IOmg活性碳，在O 4°C下攪拌20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液按每支100 μ I分裝入預充式注射器，樣品溫度到5°C以下保存，規格為50 μ g/支。實施例13:凍干粉型藥物組合物的制備取適量的容器加山梨醇0.05g、乳糖0.06g和注射用水5ml，攪拌使溶解，加Imol/L的鹽酸或氫氧化鈉調節PH至7.5，冷卻至5°C，按實施例5方法制備的復合物適量加入其中，繼續調補PH至6.0,加水至10ml。加入IOmg活性碳,在5°C下攪拌20分鐘,脫碳,采用微孔濾膜過濾除菌，濾液按每支Iml進行分裝，預凍2小時后，冷凍下減壓干燥12小時，至樣品溫度到5°C后，再干燥5小時，制得白色疏松塊狀物，封口即得阿霉素-兩性多肽藥物復合物凍干粉針，規格為500 μ g/支。實施例14:溶液注射劑型藥物組合物的制備取適量的容器加NaCl 40mg,注射用水7ml，攪拌使溶解，加lmol/L的枸櫞酸或氫氧化鈉調節PH至6.5，冷卻至0°C，取以實施例6的方法制得的復合物粉末適量加入其中，繼續攪拌溶解，調補PH至6.5，加水至10ml。加入IOmg活性碳，在0_4°C下攪拌20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液按每支200 μ I分裝入預充式注射器，樣品溫度到5°C以下保存，規格為IOOyg/支。實施例15:
凍干粉型藥物組合物的制備取適量的容器加NaCl 20mg和注射用水5ml，攪拌使溶解，加lmol/L的鹽酸或氫氧化鈉調節PH至7.5，冷卻至5°C，取實施例6方法制備的復合物適量加入其中，繼續調補PH至6.0，加水至10ml。加入IOmg活性碳，在5°C下攪拌20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液按每支0.5ml進行分裝，預凍2小時后，冷凍下減壓干燥12小時，至樣品溫度到5°C后，再干燥5小時，制得白色疏松塊狀物，封口即得Exendin-4多肽藥物復合物凍干粉針，規格為2501^/支。實施例16:阿霉素-兩性多肽復合物對Hela細胞增殖的抑制效果收集處于對數生長期的Hela細胞，調細胞濃度為2.5X IO4個/ml，分5組接入96孔板內，每組設4個孔作為重復實驗。將細胞置于CO2培養箱內培養24h后,吸出培養液,選3組分別加入不同濃度梯度(5 μ g/mlU0y g/mlU5y g/ml)的阿霉素-兩性多肽復合物,另選3組分別加入不同濃度梯度(5 μ g/ml、10 μ g/ml、15 μ g/ml)的阿霉素。余I組為對照組(加細胞不加藥)，另外設調零組(只加培養液)。將已加入藥物的Hela細胞置于培養箱內再培養72h，每孔加5mg/ml的MTT溶液20 μ 1，繼續孵育4h，棄去上清液后每孔加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μ 1，放于震蕩器上震蕩15min后，用酶標儀(492nm波長)測每孔的OD值。根據OD值求出腫瘤細胞抑制率，計算公式為抑制率=(對照組OD值均數-實驗組OD值均數)/對照組OD值均數。用卡平方測驗法比較各濃度的藥物對細胞增殖抑制率的差異(見表I)。表1.阿霉素-兩性多肽復合物對Hela細胞增殖的抑制實驗數據
ADR-PNP ADR-PNP ADR-PNPADRADRADR
Blank CK
(5 g/mL) (10 g/mL) (15 g/mL) (5 g/mL) (10 g/inL) (15 g/mL)
OD value 0.063 0.455 0.2540.1950.1670.2890.2520.198
Inhibitor
--42.92%56.18%62.47%36.48%44.61%56.48%
rate實施例17:阿霉素-兩性多肽復合物對MCF-7細胞增殖的抑制效果收集處于對數生長期的MCF-7細胞，調細胞濃度為2.5X IO4個/ml，分5組接入96孔板內，每組設4個孔作為重復實驗。將細胞置于CO2培養箱內培養24h后,吸出培養液,選3組分別加入不同濃度梯度(5 μ g/ml、10 μ g/ml、15 μ g/ml)的阿霉素-兩性多肽復合物,另選3組分別加入不同濃度梯度(5 μ g/ml、10 μ g/ml、15 μ g/ml)的阿霉素。余I組為對照組(加細胞不加藥)，另外設調零組(只加培養液)。將已加入藥物的MCF-7細胞置于培養箱內再培養72h，每孔加5mg/ml的MTT溶液20 μ 1，繼續孵育4h，棄去上清液后每孔加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μ 1，放于震蕩器上震蕩15min后，用酶標儀(492nm波長)測每孔的OD值。根據OD值求出腫瘤細胞抑制率，計算公式為抑制率=(對照組OD值均數-實驗組OD值均數)/對照組OD值均數。用卡平方測驗法比較各濃度的藥物對細胞增殖抑制率的差異(見表2)。表2.阿霉素-兩性多肽復合物對MCF-7細胞增殖的抑制實驗數據
權利要求
1.一種藥物-多肽復合物，其特征在于，所述復合物包含阿霉素和親疏水兩性多肽。
2.如權利要求1所述的藥物-多肽復合物，其特征在于，所述兩性多肽為如式I(SEQIDNO I)所示序列的兩性多肽Ppl Ppl: GLffffKAffffKAffffKSLffffRKRKRKA式 I(SEQ ID NO I)。
3.如權利要求1所述的藥物-多肽復合物，其特征在于，所述兩性多肽為如式II(SEQID NO 2)所示序列的兩性多肽Pp2 Pp2:GLffffKVffffKLffffKSLffffRKRLRKA式 II(SEQ ID NO 2)。
4.如權利要求1-3任一項所述的藥物-多肽復合物，其特征在于，所述阿霉素和兩性多肽的摩爾比為10:1 1: 100，優選1:1 1: 50，更優選1: 2.5 1: 25。
5.權利要求1-4任一項所述的藥物-多肽復合物的制備方法，其特征在于，所述方法包括:按照摩爾比例分別稱取阿霉素和兩性多肽Ppl或Pp2，溶于適量的生理鹽水、純水或PBS緩沖液中，在O 5°C溫度下，通過一定方法充分混合制得。
6.如權利要求5所述的藥物-多肽復合物的制備方法，其特征在于，所述的一定方法充分混合為超聲混合I 15分鐘、攪拌1 3小時、放置過夜。
7.權利要求1-4任一項所述的藥物-多肽復合物在制備治療和/或預防癌癥相關的藥物中的應用。
8.一種藥物組合物，其包含如權利要求1-4任一項所述的藥物-多肽復合物及一種或多種藥學上可接受的輔料。
9.如權利要求8所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物中多肽復合物和輔料的重量比為5:1 1: 50，優選1:1 1: 25。
10.如權利要求8-9中任一項所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物為注射齊U，優選為凍干粉針或溶液注射劑。
全文摘要
本發明公開了一種藥物-多肽復合物，其包含包含阿霉素和親疏水兩性多肽。所述兩性多肽能夠有效增強細胞對藥物的吸收，一定程度上增加藥物對腫瘤組織尤其是硬性腫瘤的靶向性，并降低阿霉素對心臟產生的細胞毒作用，且具有緩釋藥物的特性，在腫瘤治療藥物領域有較廣泛的應用前景。本發明還公開了所述藥物-多肽復合物的制備方法及其應用。此外，本發明進一步公開了包含所述多肽復合物的藥物組合物的制備方法及應用。
文檔編號C07K14/00GK103071159SQ20111032735
公開日2013年5月1日 申請日期2011年10月25日 優先權日2011年10月25日
發明者付剛, 龔珉, 孟凡翠, 徐為人, 湯立達 申請人:天津藥物研究院