一種特異識別血小板α_IIbβ₃的抗栓藥物RWR的制作方法

專利名稱：一種特異識別血小板α_IIbβ₃的抗栓藥物RWR的制作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質多肽領域，具體地講，涉及一種能夠特異識別血小板表面整合素α IIb β 3的多肽及其制備和應用。
背景技術：
心腦血管疾病如心肌梗死、腦梗塞是一種嚴重威脅人類健康的重大疾病，全世界每年死于心腦血管疾病的人數高達1500萬人，居各種死因首位。心腦血管疾病具有發病率高、致殘率高、死亡率高、復發率高，并發癥多即“四高一多”的特點，已成為人類死亡病因最高的頭號殺手。即使應用目前最先進、完善的治療手段，仍有50%以上心腦血管疾病幸存者生活不能自理。眾多心腦血管疾病的發生、發展都和病理性血栓形成有關。迄今已用于臨床的血栓抑制劑有很多種。傳統的溶栓抗栓藥物雖具有一定的抑制血栓生成作用，但其局限性不容忽視。例如溶栓藥尿激酶、鏈激酶，TPA等在不同程度上存在著特異性差，需用量大，有出血傾向以及使用后再次栓塞等缺點，抗栓藥阿斯匹林對高切應力所致的血小板活化無抑制作用，而且當冠脈狹窄程度增加時抗栓效果減弱。而且現有絕大多數的抗血小板聚集藥，只能阻止血小板活化途徑中的一條通路，當某一特定通路被充分抑制時，血小板仍可通過其它途徑活化，引起血小板聚集。基于傳統血栓生成抑制劑的局限性，科學家們仍在繼續研究新的血栓抑制劑，不斷探索療效確切、成本低廉的抗血栓藥。血栓形成的共同通路也即關鍵環節是纖維蛋白α鏈的RGD(Arg-Gly-Asp)模體特異識別血小板表面α IIb β 3受體，介導纖維蛋白與血小板的結合，該過程猶如鏈條，把相鄰的血小板連在一起，形成血栓。由于R⑶模體具有與α IIb β 3受體特異結合的特性，因此含有RGD序列的多肽即可以競爭性抑制纖維蛋白與血小板的結合，從而抑制血栓形成，即可以阻斷血栓形成的最后通路。RGD是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸組成的三肽。1984年PiersctAacher和 Ruoslahti首次確定了 RGD序列為人纖維連接蛋白與其受體結合位點。研究發現RGD廣泛存在于細胞識別系統。基質蛋白中的RGD是與細胞表面特異受體相互作用的識別位點，這些細胞表面膜蛋白是廣泛分布的超級家族-粘附受體的成員，稱為整合素。整合素在正常情況下無活性，一旦在激素，細胞因子或其它因素的刺激下，其構型和親合力發生改變，整合素受體與特異性配體的RGD結構結合，引起細胞內一系列生化改變，進而影響多種組織細胞功能的調控，包括細胞凋亡，分化，增殖，遷移，粘附，血小板聚集等一系列病理生理過程。國內外對RGD多肽的生物學活性進行的大量研究，證明了 RGD多肽在疾病治療方面具有廣闊的應用前景。RGD及類似物對預防和治療心腦血管疾病、骨質疏松以及由細胞粘連異常而導致的腫瘤等疾病具有重要作用，人工合成的RGD多肽或化合物也具有類似的生物學活性，含有R⑶多肽已成為醫學研究的熱點。1991年J. Samanen等合成了一系列含有 RGD序列的小肽，經過藥理活性試驗發現了它們可抑制纖維蛋白原與血小板的結合，抑制血栓的形成。眾多實驗研究表明，RGD多肽作為ciIIbi33受體拮抗劑，可以阻斷血栓形成的最終通路，理論上具有徹底抑制血栓形成的功能。目前一些科學家通過人工合成一些RGD序列的小肽進行基礎及臨床試驗，已取得一定的成果。如RGDS，DRGDW，GRGDSPA等都可抑制纖維蛋白與血小板結合，抑制血栓形成。 新近的實驗研究表明，用氨基酸替代法研究RGD與血小板α IIbi3 3結構和活性的關系時發現，用Val取代Arg將使RGD的活性降低10倍，用Ala取代Gly出現類似結果，用Glu取代 Asp將使其功能完全喪失。逆轉RGDS和RGDV序列將使其對血小板抑制功能完全喪失。另有實驗研究表明，GRGDSP六肽(Gvy-Ay-Gy-Asy-Ser-Pro)可直接抑制纖維蛋白(Fg)與血小板的結合；Eward等發現RGDS明顯抑制Fg和ADP激活的血小板結合；Rote等發現含RGD 序列的SC-4992呈量依賴抑制血栓形成，抑制ADP和花生四烯酸引起的血小板聚集。其中 RGD序列是高度保守的，是識別受體必需的。天然存在的含RGD的多肽和人工合成含RGD的小肽，一般都具有相似的功能，既可以抑制血栓形成、也具有抑制腫瘤轉移和骨質疏松的功能。因此，RGD類似物作用廣泛但不特異，如何提高其作用的特異性及活性，是研究人員的關注熱點，也是本課題組多年來的研究重點。近年來，本實驗室通過突變Echistatin RGD模體周邊部分氨基酸，得到兩種不同的突變體，建立了這兩種突變體的基因工程生產工藝，并進行了藥效學研究，系統研究了 RGD周邊氨基酸的變化對其活性的影響，在RGD模體周邊氨基酸突變研究方面積累了不少的經驗。研究表明，第四位氨基酸對其活性影響最大，以疏水氨基酸為佳，疏水性越強，其抑制纖維蛋白與aIIbi33結合力越強。本項研究即對RGD進行改造，增加兩個氨基酸，以增強其作用的特異性和高效性。本發明的目的，在于提供一種能夠特異識別和抑制血栓形成的多肽，從而克服現有血栓生成抑制劑及一些溶栓藥物存在的副作用大、特異性不強等問題，以期在臨床治療中發揮高效、特異抑制血栓形成的功效。本發明所述一種特異識別血小板α IIb β 3的抗栓藥物RWR，迄今尚未見有國內外的相關報道。

發明內容
本發明提供了一種全新的小分子多肽，對RGD進行改造。根據RGD能特異結合anbi33的特點，增加一個疏水性氨基酸和一個堿性氨基酸，第四位增加一個疏水性氨基酸W，第五位增加一個堿性氨基酸R，可提高其特異結合α IIbi3 3能力，又能以較小的分子量降低免疫原性，解決現有抗血栓制劑存在的缺陷。本發明所述小肽序列為 Arg-Gly-Asp-Trp-Arg,其蛋白質一級結構為RGDWR，該化合物能顯著提高其生物學活性，降低RGD類似物的副作用。本發明的要點之一在于，提供一種新的小分子多肽設計與合成，將氨基酸序列設計為Arg-Gly-Asp-Trp-Arg，其蛋白質一級結構為RGDWR，將其命名為RWR。本發明的要點之二在于，RWR作用機理獨特，與纖維蛋白原競爭ciIIbi33受體拮抗齊U，競爭性地抑制纖維蛋白原與血小板結合(即抑制血栓形成的最后共同通路)的作用，尤其是，課題組創造性引入第四位氨基酸W，第五位氨基酸R與RGD模體共同發揮作用，大大增強了 RGD的作用，提高了其活性和特異性，可以高效抑制任何激活劑引起的血小板聚集，因此它作用的徹底性和高效性是不言而喻的。
發明優點本發明的優點與積極效果在于，可以利用化學合成、基因工程與蛋白質工程技術， 設計并制備一種小分子多肽，所述多肽具有明顯抑制血栓生成的作用，且具有副作用小，特異性強，活性高和較小的免疫原性；同時具有結構簡單，成本低廉，易于合成的特點，具有廣闊的市場和臨床應用前景。實施方案以下實施例僅為幫助本領域技術人員更好地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。

<實施例DArg-Gly-Asp-Trp-Arg的合成、純化與鑒定應用9-芴甲氧羰基(Fmoc)方法，采用Wang樹脂(Wang Resin)多肽合成載體， 首先將Arg的羧基通過酰胺鍵與wang-Resin連接，然后根據五肽序列從C端向N端延伸肽鏈，每步縮合都加入縮合劑如苯并三氮唑-N，N, N, N-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，1-羥基-苯并-三氮唑(HOBt)，縮合后用20%的DMF( 二甲基甲酰胺)溶液去除Fmoc保護基。 肽鏈合成后，用TFA(三氟乙酸)在室溫下攪拌，震蕩，過濾，在去除側鏈保護基的同時，使肽鏈從樹脂上解離下來。利用茚三酮試劑檢測脫保護和縮合的完全程度。合成的RWR經 RP-HPLC (反相高壓液相色譜)C18反相色譜柱純化，0. TFA和乙腈(0-30% )梯度洗脫， 流速lOmL/min，檢測波長215nm，純度大于90%。應用ESI-MS，元素分析確證其結構與理論值一致。<實施例2> 體外抗栓作用的活性實驗及量效關系研究于清晨空腹經肘靜脈采人血，以3. 8%枸櫞酸鈉抗凝(血與抗凝劑的體積比為 9 1)，室溫下，1000r/min離心8min，取上層血漿即為富血小板血漿(PRP platelet-rich plasma)，分離PRP。將余血再以3000r/min離心lOmin，取上層血漿得貧血小板血漿(PPP platelet-poor plasma)，用 PPP 調整 PRP，使血小板數約為 25 萬 / μ L。取 PRP400 μ L,分別加入NS (陰性對照)及不同濃度的替羅非班(Tirofiban) (200、100、50、25、12. 5 μ M陽性對照)/小肽RWR(100、50、20、12. 5、6· 25 μ M終濃度)50 μ 1，采用比濁法測定血小板聚集率 (測定儀為Helena的Packs-4型血小板聚集儀)，37°C以900r/min，在血小板聚集儀上攪拌，孵育2min后分別加入二磷酸腺苷(ADP) 50 μ 1，同時開始測定。所有接觸血液用品均為一次性塑料制品。 結果表明，RffR在體外對ADP誘導的家兔血小板聚集具有明顯抑制作用。隨著劑量增加，作用增強，呈現出量效相關性。各劑量組與對照組比較，均有顯著性差異(P < 0. 05)。 RWR 的 IC5tl 值為 19. 7 μ mol/L ；替羅非班的 IC5tl 值為 39. 5 μ mol/1，見表 1。表1RWR、Tirofiban對ADP誘導血小板聚集的IC5tl值
權利要求
1.一種小分子多肽RWR，其蛋白質一級結構為RGDWR，即Arg-Gly-Asp-Trp-Arg。
2.制備權利要求1所述多肽RWR的方法，其特征是，該方法采用9-芴甲氧羰基法，首先將Arg的羧基通過酰胺鍵與Wang樹脂多肽合成載體連接，然后在縮合劑作用下根據五肽序列從C端向N端延伸肽鏈，縮合后用20%的二甲基甲酰胺溶液去除9-芴甲氧羰基保護基； 肽鏈合成后，用三氟乙酸在室溫下攪拌，震蕩，過濾，在去除側鏈保護基的同時，使肽鏈從樹脂上解離下來，利用茚三酮試劑檢測脫保護和縮合的完全程度；合成的產物經RP-HPLC C18 反相色譜柱純化，得到RWR。
3.權利要求1所述多肽RWR在制備治療血栓性疾病藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種小分子多肽，對RGD三肽進行改造，根據RGD特異結合αIIbβ3的特點，在其N端增加疏水性氨基酸和堿性氨基酸，第四位增加一個疏水性氨基酸W，第五位增加一個堿性氨基酸R，該小肽序列為Arg-Gly-Asp-Trp-Arg，其蛋白質一級結構為RGDWR，可提高其特異結合αIIbβ3能力，又能以較小的分子量降低免疫原性，解決現有抗血栓制劑存在的缺陷。
文檔編號C07K7/06GK102351948SQ20111032182
公開日2012年2月15日 申請日期2011年10月21日 優先權日2011年10月21日
發明者劉海桃, 孫海飚, 常冰梅, 楊利軍, 楊濤, 王惠珍, 趙海霞 申請人:山西醫科大學