一種抗病毒蛋白TRAIL_114-281及其制備方法

專利名稱：一種抗病毒蛋白TRAIL_114-281及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種抗病毒蛋白TRAIL114_281及其制備方法，屬于生物技術領域。背景介紹
艾滋病(AIDS, Acquired Immunodeficiency Syndrome)、非典(SARS, Severe Acute Respiratory Syndrome)、禽流感(Al，Avian hfluenza)等病的爆發和流行，不斷向人們敲響警鐘，人類與傳染病的斗爭是一個長期和持續的過程。為此，各國政界、業界、學界和科界人士都通過不同的思路、途徑、策略等來研究和探討對付這些傳染病的方法。月中瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis inducing ligand, TRAIL)又稱凋亡素2配體(Apo2 ligand，Apo_2L)，是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)超家族的成員之一，可誘導多種腫瘤細胞凋亡，而對正常細胞無殺傷作用。但在抗病毒方面關于TRAIL的研究不多，尤其是TRAIL是否對單純皰疹病毒(HSV-1，DNA病毒) 和脊髓灰質炎病毒(PV，RNA病毒)有作用還沒有相關研究。

發明內容
本發明目的在于提供一種抗病毒蛋白TRAIL114.，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，蛋白的分子量為MKD。本發明另一目的在于提供抗病毒蛋白TRAIL114_281制備方法，包括如下步驟
(1)TRAIL全基因的獲得
提取Hela細胞的RNA，用逆轉錄PCR方法獲得TRAIL部分基因，然后用套疊PCR方法補全TRAIL全基因；
(2)原核表達載體TRAIL114_281/pET-30a的構建
以上一步所得的TRAIL全基因為模板利用AfcoI和歷'/^III位點設計引物，PCR擴增后獲得TRAIL114_281基因并插入pET-30a載體中，得到原核表達載體TRAIL114_281/pET-30a ；
(3)重組表達載體TRAIL114_281/pET-30a的表達
在大腸桿菌BL21(DE3)中重組表達，IPTG誘導表達出正確的TRAIL114.蛋白，蛋白以可溶性和包涵體兩種形式存在，表達后使用鎳離子親和層析方法對可溶性的TRAIL114J1蛋白進行純化，目的蛋白純度達90%以上。TRAIL114.段蛋白位于TRAIL蛋白的胞外C端區，具有可溶性且是TRAIL的功能性部分，以TRAIL114_281段蛋白代替TRAIL蛋白具有操作方便，便于純化等特點。本發明通過融合表達的TRAIL114^功能蛋白，經實驗證實，對病毒HSV-I和PV無直接滅活作用，但可以干擾病毒向宿主細胞吸附，且經TRAIL114_281功能蛋白預處理的細胞， 可明顯阻滯病毒產生細胞病變，同時還發現TRAIL114_281功能蛋白可有效地抑制病毒的增殖，但不影響子代病毒的釋放。純化后的TRAIL114J1功能蛋白以不同劑量在正常細胞KMB17中作用于病毒復制周期的各個階段，結果顯示TRAIL114_281功能蛋白對病毒HSV-I和PV均有明顯的抗病毒作用， 且有劑量依賴性，但在RNA病毒和DNA病毒中卻無明顯差別，這為下一步探討TRAIL抗病毒作用的機制奠定了基礎。


圖1是為獲取TRAIL全基因的套疊PCR圖。圖2是TRAIL114_281/pET-30a/DH5 α菌落PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，泳道1 為DNA Marker (DL2000),泳道2為空白對照，泳道3為菌落PCR。圖3是重組質粒TRAIL114_281/pET-30a的酶切鑒定電泳圖，泳道1為重組質粒，泳道 2 為 DNA Marker (DL5000),泳道 3 為質粒 TRAIL114_281/pET_30a 經 AfcoI 單酶切，泳道 4 為質粒 TRAIL114_281/pET-30a 經 AfcoI 和歷III雙酶切，泳道 5 為質粒 TRAIL114_281/pET_30a 經 Hind III單酶切，泳道6為空載質粒pET-30a經Nco I和Hind III雙酶切。圖4是重組蛋白TRAIL114_281的SDS-PAGE檢測圖，泳道1為ftOtein Marker,泳道 2 為 pET-30a/BL21 誘導前，泳道 3 為 pET_30a/BL21 誘導后，泳道 4 為 TRAIL114_281/pET_30a/ BL21誘導前，泳道3為TRAIL114_281/pET-30a/BL21誘導后，目的蛋白大小為MKD。圖5是重組蛋白TRAIL114^281免疫印跡電泳檢測圖，泳道1為Protein Marker, TRAIL114_281/pET-30a/BL21 誘導后。
具體實施例方式實施例1 TRAIL114_281蛋白的制備
大腸桿菌感受態的制備與轉化、質粒的提取及限制性內切酶的消化、DNA片段的回收、 線性DNA片段的連接、重組質粒的篩選與鑒定、PCR擴增反應等均參照《分子克隆實驗指南》 (黃培堂等譯，第三版，科學出版社，2002 )相關章節進行。1、目的基因的獲得
提取Hela細胞的RNA，用逆轉錄PCR獲得TRAIL部分基因，后用套疊PCR方法補全 TRAIL基因(圖1)。測序正確后，PCR獲取TRAIL功能區即114-281段基因。2、重組質粒 TRAIL114_281/pET_30a 的構建 2. 1雙酶切反應
用限制性內切酶Afco I和/Ziz7i/III消化原核表達載體pET-30a，獲得線性化的載體片段， 具體步驟如下取3ug的質粒DNA與適量的水混勻，使其總體積為25ul，各加入兩種限制性內切酶IOU及3ul相應的IOX限制性內切酶反應緩沖液，輕彈管壁混勻并離心，置最適反應溫度水浴他，取3ul反應液進行瓊脂糖凝膠電泳檢查。完全酶切后，回收片段備用。2. 2連接反應
將獲得TRAIL114.段蛋白基因片段定向插入到pET-30a載體中，獲得TRAIL114./ pET-30a重組質粒。具體步驟如下取1. Oug回收的載體DNA加2_10倍摩爾量的外源DNA 片段，2ul IOX連接緩沖液加水定容至20ul，最后加入適量的T4 DNA連接酶，混勻后并瞬間離心以使液滴聚集管底，至16°C水浴過夜，取:3ul連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞。最后挑取單個菌落，進行質粒提取和菌落PCR驗證，結果如圖2所示。2. 3重組質粒的鑒定將提取的質粒用PCR及雙酶切(AfcoI + Λ /^ΙΙΙ)反應進行鑒定(圖3)，獲得正確的原核重組質粒 TRAIL114_281/pET-30a。3、TRAIL114_281蛋白的誘導表達
用空表達載體pET-30a作對照，與重組質粒同步轉化表達宿主菌BL21 (DE3)感受態細胞，挑取4個轉化單菌落，接種于aiil LB液體培養基中，37°C振蕩培養至0D_=0. 6^1. 0， 放入4°C冰箱放置4 6h。4°C 5000r/m離心5min收集菌體，用^il LB培養基重懸沉淀，取 0. Iml 混懸液接種 IOml LB 培養基(50ug/ml Kan), 37°C 200r/m 振蕩培養 OD600=O. 6 1. 0， 加IPTG進行誘導表達，同時設置不同的溫度、誘導時間、IPTG濃度，然后4°C 5000r/m離心 5min收集菌體。用1/10培養基體積lOmmol/L Tris · HCl (pH 8. 0)重懸菌體，分別取適量誘導表達菌體及其對照菌體，加等量2XSDS加樣緩沖液(lOOmmol/L Tris · HCl pH 6.8、 4% SDS,0. 2%溴酚藍、20%甘油、5%巰基乙醇)，100°C水浴^iin后，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察表達量，與空表達載體相比重組質粒經誘導后可見非常一條非常明顯的大小約為MKD的條帶。4、表達條件的優化
通過設置不同的表達參數，對表達條件進行了優化，具體實驗如下 4. 1溫度梯度實驗
固定IPTG的誘導濃度為lmmol/L，誘導時間為6h，設溫度梯度為16°C、觀°C、37°C、 42°C，結果為在表達量最高。4.2 IPTG濃度梯度實驗
固定溫度為，誘導時間為6h，設IPTG濃度梯度為0. 4mmol/L、0. 6mmol/L、0. 8mmol/ L、1. 0mmol/L、1. 2mmol/L,結果為在 1. Ommo 1/L 表達量最高。4. 3誘導時間梯度實驗
固定溫度為^°C，誘導濃度為1. 0mmol/L，誘導時間梯度為ai、4h、Mi、8h、10h、12h。5、目的蛋白的鑒定 5.1 SDS-PAGE凝膠電泳
誘導結束后，4°C 5000r/m離心5min收集菌體。用1/10培養基體積的lOmmol/L Tris · HCL(pH 8. 0)重懸菌體，以含質粒pET_30a的對照菌體和標準蛋白做對照，分別取適量樣品加等量2X上樣緩沖液，用微量移液器加入加樣槽，以8V/cm電壓電泳，當溴酚藍前沿進入分離膠后，以12V/cm電壓電泳，溴酚藍電泳至分離膠底部后，取出凝膠，進行考馬斯亮藍染色或蛋白印跡，結果顯示目的蛋白有大量表達(見圖4)。5. 2 Western Blot 檢測
SDS-PAGE凝膠電泳結束后，切出含待轉移蛋白的凝膠，剪6張同樣大小的Whatman 3mm 濾紙和一張PVDF膜，用軟鉛筆在PVDF膜一角做好標記。將它們懸浮于ddH20水平面上， 潤濕后浸于水中5min，驅除膜上的氣泡，在浸泡于轉移緩沖液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris,0. 037% SDS，20%甲醇)中。在塑料支架上依次疊放浸濕的海綿、3層濾紙、凝膠、PVDF 膜、3層濾紙和海綿，使濾紙、凝膠和PVDF膜對齊，且各層之間無氣泡存在；將塑料支架夾緊插入電泳槽中，PVDF膜一側接陽極，凝膠一側接陰極，加轉移液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/ L Tris，0.037% SDS，20%甲醇)稍超過凝膠，以30疒:35V電壓，4°C轉移14 16h。轉移完畢， 將PVDF膜浸于封閉液(5%脫脂奶粉或3% BSA，150 mmol/L NaCl, 0. 02% Tween-20)中約室溫2h，以封閉無關蛋白結合位點，同時對凝膠進行染色，檢查蛋白轉移是否完全。封閉后， 用洗滌液(10mmol/L Tris · HCl pH7. 5,0. 15mol/L NaCl,0. 05% Tween-20)洗膜 3 次，每次5min ；將一抗(抗TRAIL的多克隆抗體)用抗體稀釋液(0. 01mol/L TBS,1% BSA,0. 05% Tween-20)適當稀釋，滴在保鮮膜上，然后將PVDF膜正面(吸附抗原面)向下覆蓋在加抗體的保鮮膜上，室溫反應池；用洗滌液洗膜3次，每次5min ；同樣方法加酶標二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG)，室溫反應池；用洗滌液洗膜3次，每次5min ；膜稍干，加酶底物反應液進行反應(酶底物反應液配制Mmg DAB溶于IOml TTBS中，加5ul 30% H2O2混勻)， 結果見圖5。
實施例2 TRAIL114^281蛋白的抗病毒實驗 1、病毒滴度的確定
取制備好的毒株HSV-I和PV，做10倍系列稀釋，ΙΟ"1至10_1(1。將各稀釋度的毒株接種于KMB17細胞，各6個復孔，同時以BSA做為陰性對照。以TCID5tl表示病毒毒力。37°C培養3d后，觀察細胞病變，以出現細胞病變的最高稀釋倍數的倒數作為TCID5Q。用HSV-I和 PV感染KMB17細胞，獲得攜有HSV-I和PV的KMB17細胞感染株，按Reed-Muench法計算得 HSV-I的TCID50為10_6，PV的TCID50為10_7，本實驗采用病毒的量為IOOTCID50o2、TRAIL114^281 對 KMB17 細胞的作用
采用96孔細胞培養板培養KMB17細胞，制成2 X IO5 / ml細胞懸液，每孔加入100 μ 1 細胞，于5% CO2培養箱37°C培養24h 48h后棄生長液，加約100 TCID5tl病毒液100 μ 1， 37°C吸附濁。吸出病毒液，加用維持液稀釋的不同稀釋度TRAILQOOyg / mlUOOyg / πι1、50μ g / ml、25 μ g / mlU2. 5 μ g / ml、6. 25 μ g / ml、3. 12 μ g / ml) 100 μ 1，置 5% CO2培養箱中37°C繼續培養。7 后，當病毒對照細胞病變達75%以上，判斷結果，以 Reed-Mueneh法計算TCID5tl或MTT法測A值。實驗同時設細胞對照、藥物對照、病毒對照及病毒TCID50的滴定。TRAIL114_281對KMB17細胞的增殖無明顯作用，且對KMB17細胞毒性極低(TC50為0. 9g/L)，光鏡下KMB17細胞形態無明顯變化。3、TRAIL對病毒與細胞吸附的影響實驗 3.1 TRAIL114_28Jf病毒的直接作用實驗
取不同稀釋度的TRAIL114^各100 μ 1分別與病毒原液100 μ 1混合于EP管中，37°C接觸lh，同時以400 μ g/ml的BSA作為陰性對照。各管病毒依次10倍稀釋，在KMB17細胞內滴定各管病毒TCID5tl，結果見表1。兩種病毒的各管TCID5tl與陰性對照相同，說明TRAIL114_281 對兩種病毒無直接作用。
表1 :TRAIL114_281對病毒直接作用的結果
權利要求
1.一種抗病毒蛋白TRAIL114_281，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.根據權利要求1所述的蛋白TRAIL114_281，其特征在于其分子量為MKD。
3.一種抗病毒蛋白TRAIL114_281的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)TRAIL全基因的獲得提取Hela細胞的RNA，用逆轉錄PCR方法獲得TRAIL部分基因，然后用套疊PCR方法補全TRAIL全基因；(2)原核表達載體TRAIL114_281/pET-30a的構建以第(1)步所得的TRAIL全基因為模板利用AfcoI和^ifli/III兩個酶切位點設計引物，PCR擴增獲得TRAIL114_281基因并插入pET-30a載體中，得到原核表達載體TRAIL114_281/ pET_30a ；(3)重組表達載體TRAIL114_281/pET-30a的表達在大腸桿菌BL21(DE3)中重組表達，IPTG誘導表達1肌11^114_281蛋白，表達后使用鎳離子親和層析的方法對可溶性的TRAIL114_281蛋白進行純化，即得TRAIL114J1蛋白。
全文摘要
本發明公開了一種抗病毒蛋白TRAIL114-281及其制備方法，TRAIL114-281蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，將TRAIL114-281基因插入pET-30a載體中構建重組表達載體TRAIL114-281/pET-30a，通過轉化大腸桿菌BL21菌株，獲得含TRAIL114-281基因的工程菌，最后通過誘導表達純化獲得純度＞90％的TRAIL114-281蛋白，本發明的抗病毒蛋白TRAIL114-281具有良好的抗病毒活性，為治療病毒感染提供了新的途徑。
文檔編號C07K14/525GK102329387SQ20111028535
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月23日 優先權日2011年9月23日
發明者周靜煒, 季秀玲, 張琦, 林連兵, 王志, 魏云林 申請人:昆明理工大學