專利名稱：卵黃抗體中病毒的滅活工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及卵黃抗體中病毒的滅活工藝，是專門滅活卵黃中攜帶的病毒，屬于生物制藥中抗體治療劑領域。二
背景技術：
雞卵黃抗體(Egg Yolk Immunoglobulin)是存在于卵黃中的免疫球蛋白，它是由母雞血清中的免疫球蛋白轉移而來。卵黃抗體可以應用于臨床疾病的治療，如雞傳染性法氏囊病、新城疫、鴨瘟、小鵝瘟、豬瘟等等。在臨床實踐中，卵黃抗體的預防和治療效果非常理想， 同時卵黃抗體的制造工藝簡單價廉，幾年前在養禽業生產中用量很大，發揮過十分重要的作用。但是，現有抗體類治療劑存在十分明顯的問題，因此被農業部叫停。其原因是由于制備抗體采用的都不是SPF禽，所以其中極易攜帶垂直傳播性病原，如大腸桿菌、沙門氏菌、減蛋綜合征病毒、禽流感病毒等；并且由于企業生產條件簡單，在生產中也容易混雜入一些外源性病毒。鑒于此種情況，脫脂卵黃抗體必須進行禽源、外源性病原微生物的滅活處理，防止使用卵黃抗體后造成傳播病原的擴散甚至疾病的爆發β -丙內酯(BPL)是一種雜環化合物，對病毒具有很強的滅活作用，比福爾馬林作用強25倍，而且對病毒抗原影響或破壞作用較小。其作用機制通過與嘌呤堿基(主要是鳥嘌呤)反應改變病毒核酸結構達到滅活病毒的目的，不蛋白發生反應，不影響抗體的效價。 BPL雖是一種致癌物，但極易水解，37°C 2小時可以完全水解，水解后形成人體脂肪代謝產物β-羥基丙酸，對人體無害，在國外已廣泛用于各種疫苗的滅活。將BPL用于卵黃抗體外源型病毒滅活，具有安全的和不影響抗體效價等優點。現在技術中未見有β -丙內酯滅活卵黃抗體中病毒的報道。
發明內容技術問題
本發明的目的是提供一種滅活卵黃中所帶的病原微生物技術，以丙內酯作為滅活齊U，既能滅活病原微生物，又不破壞抗體活性。采用該技術滅活后的卵黃抗體安全、無毒并活性高。技術方案
卵黃抗體中病毒的滅活工藝，其特征在于，利用丙內酯加入到中，混合作用，滅活卵黃中的病毒，獲得安全無毒的卵黃抗體。其中脫脂卵黃抗體的制備方法為攪拌卵黃， 加等體積水稀釋勻漿，然后將勻漿的卵黃用質量體積比為7%的PEG-6000溶液稀釋，使 PEG-6000終濃度為質量體積比3. 5%，攪拌30min后，靜置于4°C，過夜，待水脂分層后，分離上清液，取上清液即為脫脂卵黃抗體。所述滅活方法具體為，將丙內酯與脫脂卵黃抗體按體積比為0. 0759Γ0. 1%混合后，在4°C作用24小時，37°C 2小時水解殘留β _丙內酯，終止滅活，即獲得安全無毒的卵黃抗體。有益效果本發明具有一下優點1、安全β-丙內酯極易水解，水解后形成人體脂肪代謝產物羥基丙酸，對人體無害。2、簡單、易于操作基本不需要使用儀器，操作比較簡便。3、不影響效價β -丙內酯不與抗體反應，不影響抗體效價，對抗體的治療效果沒影響。
具體實施例方式
1、材料
1. 1滅活劑β -丙內酯(β -propionolactone,BPL )，深圳邁瑞爾化學技術有限公司進口分裝，CAS 號 57-57-8。1. 2 PEG-6000 聚乙二醇，北京海淀精細化工廠，批號061017
1. 3指示病毒雞新城疫病毒NDV (La Sota株)批號20010322，0. 25ml。劑型凍干
毒。購自中監所。禽腺病毒EDS (AV127株)批號20010517，0. 5ml。劑型凍干毒。購自中監所。1.4 SPF雞胚10日齡雞胚購自南京藥械廠。2、方法
1)脫脂卵黃的制備
將雞蛋用清水洗去污物，再放入含0. 5%新潔爾滅溶液浸泡20min，然后晾干。用75%酒精棉擦拭蛋殼，無菌操作打開蛋殼，將蛋清和蛋黃分開，把蛋黃放于滅菌燒杯中，加等體積水稀釋勻漿，然后將勻漿的卵黃用質量體積比為7%的PEG-6000溶液稀釋，使PEG-6000終濃度為質量體積比3. 5%，攪拌30min后，靜置于4°C，過夜，待水脂分層后，分離上清液，上清液即為脫脂卵黃抗體。2) β-丙內酯滅活
將β-丙內酯加入上述制備的脫脂卵黃抗體，β-丙內酯與脫脂卵黃抗體比例(ν/ν)為 0. 059Γ0. 1%。震蕩30min，置4°C，作用M小時，然后在37°C水浴中水解2 h。本發明方法中β -丙內酯與卵黃液的比例(ν/ν)為0. 0759Γ0. 1%。β -丙內酯滅活流感病毒試驗在卵黃抗體中加入指示病毒ND，使病毒終濃度為 106EID50/0. 1ml。隨后分為三組，每組300ml，加入10%的β -丙內酯，邊加邊搖，使其充分混合，0-丙內酯終濃度分別為0.01%、0.025(%、0.5%，然后將胚液倒于另一滅菌容器中。置 4°C下滅活，每小時振搖1次。當卵黃液內部溫度達到4°C時開始計時，20小時、24小時、30 小時、36小時分別取樣盲傳，做滅活檢驗。HA<4為陰性，即病毒被滅活。β -丙內酯滅活禽腺病毒試驗在卵黃抗體中加入指示病毒EDS，使病毒終濃度為 106EID50/0. 1ml。隨后分為三組，每組300ml，加入10%的β -丙內酯，邊加邊搖，使其充分混合，0-丙內酯終濃度分別為0.05%、0.075(%、0.1%，然后將胚液倒于另一滅菌容器中。置 4°C下滅活，每小時振搖1次。當卵黃液內部溫度達到4°C時開始計時，20小時、24小時、30 小時、36小時分別取樣盲傳，做滅活檢驗。HA<4為陰性，即病毒被滅活。滅活檢驗將滅活后的卵黃抗體接種SPF雞胚，0. Iml/枚接種尿囊腔，3枚為一組， 盲傳三代。分別取脫脂卵黃和滅活后卵黃，檢測H9N2抗體HI效價為例，比較抗體損失情況。
表1滅活前后H9N2抗體HI效價
權利要求
1.卵黃抗體中病毒的滅活工藝，其特征在于，利用β-丙內酯加入到脫脂卵黃抗體中， 混合作用，滅活卵黃中的病毒，獲得安全無毒的卵黃抗體。
2.根據權利要求1所述的滅活工藝，其中脫脂卵黃抗體的制備方法為攪拌卵黃， 加等體積水稀釋勻漿，然后將勻漿的卵黃用質量體積比為7%的PEG-6000溶液稀釋，使 PEG-6000終濃度為質量體積比3. 5%，攪拌30min后，靜置于4°C，過夜，待水脂分層后，分離上清液，取上清液即為脫脂卵黃抗體。
3.根據權利要求1或2所述的滅活工藝，其特征在于，將β-丙內酯與脫脂卵黃抗體按體積比為0. 0759Γ0. 1%混合后，在4°C作用M小時，37°C 2小時水解殘留β -丙內酯，終止滅活，獲得安全無毒的卵黃抗體。
全文摘要
本發明是卵黃抗體中病毒的滅活工藝，屬于生物制藥中抗體治療劑領域。本發明以β-丙內酯做為滅活劑，滅活脫脂后卵黃中的病毒。本發明所用的技術方案是使用PEG-6000溶液與卵黃液混合，使卵黃中脂質顆粒與可溶蛋白分離，過濾之后獲得脫脂卵黃抗體，然后加入一定量的β-丙內酯滅活，最后滅活結束37℃水解剩余β-丙內酯終止滅活。本方法制備的卵黃抗體具有安全、無毒，無需精密儀器的優點，并且操作簡單適合大規模生產。
文檔編號C07K16/02GK102284070SQ20111023365
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月16日 優先權日2011年8月16日
發明者侯繼波, 盧宇, 徐海, 鄧碧華, 魏平華 申請人:廣州格雷特生物科技有限公司, 江蘇省農業科學院