專利名稱：重組抗菌肽buforin IIb的生產方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及重組抗菌肽buforin IIb的生產方法。
背景技術：
抗菌肽是先天性免疫的分子受動器，通常它們含有15-45個氨基酸殘基，凈電荷為正。CeciOpins類型的不含半胱氨酸線性肽是最早發現的，來源于昆蟲。現已發現抗菌肽、蛋白有800個以上，來源于動物、植物領域。抗菌肽主要作用的靶點是細菌的膜，而且殺傷過程必須比細菌生長的速度快。人們發現許多傳統的抗生素，特別是青霉素，能夠誘導耐藥菌株的產生。為了解決抗生素耐藥性的問題，研制新的抗生素或抗菌肽就顯得特別重要。抗菌肽具有良好的抗菌選擇性和獨特的抗菌模式，而且不會誘導產生耐藥菌株，容易被降解，不易在微生物體內富集，因此，被認為能夠成為替代抗生素的首選藥物。1996年Park首次在亞洲蟾餘Bufo bufo gargarizans胃組織中發現了 buforinI,buforin II是由buforin I在胞內蛋白酶Lys-C的作用下裂解而來,是buforin I從Thr到Lys共21個氨基酸殘基的烈性抗菌肽。兩者在體外都有很強的抗菌活性，其中buforin
II的抗菌活性較 buforin I 更強。buforin IIb (RAGLQFPVG[RLLR] 3)是在研究 buforin II的結構-活性關系時發現的一種人工合成多肽，其核苷酸序列見SEQ ID No. I所示，氨基酸序列見SEQ ID No. 2所示,其表現出比buforin II更強的抗菌活性。目前，許多抗菌肽正在開發成藥，但是，抗菌肽天然產量非常低，合成肽成本又太高，這成為開發成藥的一個瓶頸，通過基因工程技術生產抗菌肽具有廣闊的應用前景。國內外對于buforin IIb的基因工程生產方法很少有報道，查到僅有的報道曾采用大腸桿菌表達系統以PruF融合蛋白的形式表達buforin IIb,結果不是十分理想,表達的buforin IIb產物絕大部份以包涵體形式存在,給后續的分離純化帶來不便,設計輕氨切割融合產物對buforin IIb活性也有影響。近年來，SUM0(smallubi quit in-re lated modifier,一種小分子泛素樣修飾蛋白)融合表達技術日益受到人們的重視。與傳統的融合蛋白表達系統相比，SUMO融合表達系統有兩個明顯的優勢= (I)SUMO不僅能夠提高蛋白質在大腸桿菌的表達量，尤其是一些毒性或者小肽，而且能夠大大增加蛋白的可溶性；SUM0被發現可用作分子伴侶來增加外源蛋白的穩定性和可溶性，其作用機理可能是SUMO蛋白作為一個高度疏水的核心為目的蛋白的折疊提供成核位點，促進蛋白間的相互作用并使其正確折疊，最終增強了融合蛋白的可溶性。有人對各種不同的融合標簽在對蛋白總量及可溶蛋白含量的作用進行了實驗比較，他們將三個蛋白模型融合到MBP，GST，TRX, NusA, Ub和SUMO標簽的C端，結果表明，在增加蛋白總表達量上為TRX > SUMO > NusA > Ub > MBP > GST ;在可溶蛋白含量上為SUM0> NusA > Ub > GST > MBP > TRX。總體來說，SUMO和NusA在提高蛋白表達量和可溶含量上是等同的。但是，SUMO在一定程度上比NusA更有優勢SUM0分子量小；SUM0可以精確的被切除而不留下氨基酸殘基。(2) SUMO蛋白酶具有高比活性和高度特異性，IU的SUMO蛋`白酶可以切割100 μ g SUMO融合蛋白。與其它酶切割原理不同的是SUMO蛋白酶識別SUMO
3的空間結構，而不是一級結構，這就避免了靶蛋白的非特異切割。由于SUMO蛋白酶的N-端添加了 6xHis標簽，大大簡化該酶的去除以及目標產物的進一步純化。而且經過切割的目標產物N-端不會攜帶多余的氨基酸。另外，IPTG是非常高效的乳糖啟動子誘導劑，但其只適用于實驗室規模的小量樣品制備，應用于大規模發酵生產基因工程重組藥物則有一定的局限性一方面IPTG對于人體具有潛在的毒性，從安全角度而言并不合適；另一方面，IPTG較為昂貴。乳糖具備無毒和價廉的優點，使得其在重組蛋白的大規模發酵生產中，具有優于IPTG的潛在價值和優勢。我們用乳糖作為誘導劑來啟動T7RNA聚合酶基因和bufroin IIb目的蛋白基因的轉錄，從而短時間大量表達目的蛋白。
發明內容
本發明所要解決的技術問題，是提供一種表達效率高、蛋白純度高、適于大規模工業化生產的重組抗菌肽buforin IIb的生產方法。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下重組抗菌肽buforin IIb的生產方法,包括如下步驟(I)應用重組DNA技術，將buforin IIb基因插入pSUMO載體中，構建pSUMO/buforin IIb原核表達載體；(2)pSUM0/buforin IIb原核表達載體轉化大腸桿菌，構建表達工程菌；(3)將步驟⑵得到的工程菌以廉價無毒的乳糖為誘導劑誘導表達SUMO-buforinIIb融合蛋白；(4)收集步驟(3)誘導表達后的菌體，經細胞破碎后釋放出SUMO-buforin IIb融合蛋白，使用鎳離子親和層析純化，得到純化后的SUMO-buforin IIb融合蛋白；(5)將純化后的SUMO-buforin IIb融合蛋白經酶切反應,釋放出buforin IIb,經鎳離子親和層析分離得到含有His6標簽的SUMO蛋白和不含His6的buforin IIb蛋白。步驟(2)中，所述的大腸桿菌為E. coli Rosetta(DE3)。步驟(3)中，誘導表達方法為將步驟(2)得到的工程菌接種于含卡那霉素50 60mg/L的LB液體培養基，37°C振蕩培養16h，然后取IOmL接種到IL LB液體培養基，37°C振蕩培養2 4h，0D600達到0. 8 I時，加乳糖至終濃度為0. 8 lg/L，32°C 37°C繼續振蕩培養8 10h，離心收集菌體。步驟(4)中，所述的細胞破碎方法為超聲破碎。步驟(4)或(5)中，所述的鎳離子親和層析使用的是Ni2+-NTA樹脂。有益效果本發明應用基因工程技術在原核宿主細胞中高效表達了重組抗菌肽buforin IIb,經實驗驗證該重組抗菌肽buforin IIb對多種細菌和真菌具有殺菌作用，且本發明表達效率高，分離純化簡單，重組蛋白純度高，易操作，易放大，表達產物穩定性好，適于大規模工業化生產，對研制新型高效的buforin IIb抗菌藥物具有重要價值。
圖I為pSUMO-buforin IIb表達載體圖譜。圖2為重組SUMO-buforin IIb融合蛋白表達SDS-PAGE分析及鑒定。其中，I為未誘導的全菌蛋白；2，3,4分別為挑取三個克隆誘導后的全菌蛋白；5為Western Blotting
4鑒定的誘導表達產物。圖3為O. 5mMIPTG誘導和lg/L乳糖誘導的重組buforin IIb表達產物SDS-PAGE分析。其中，I為未誘導的菌體蛋白；2，5分別為經lg/L乳糖誘導和O. 5mMIPTG誘導的全菌蛋白；3，6分別為經lg/L乳糖誘導和O. 5mMIPTG誘導破碎后的上清蛋白；4，7分別為經Ig/L乳糖誘導和O. 5mMIPTG誘導破碎后的沉淀蛋白。圖4為重組buforin IIb的純化。其中，a為LPDataView監控下的融合蛋白Ni-NTA親和純化；b為SDS-PAGE分析乳糖誘導下重組可溶性buforin IIb融合蛋白的純化；1為誘導破碎后上清蛋白；2為上樣流出液；3為洗滌液；4為洗脫液。圖5為Tricine/SDS-PAGE分析SUMO-buforin IIb融合蛋白的酶切及進一步純化。其中，a為Tricine/SDS-PAGE分析SUMO蛋白酶對SUMO-buforin IIb融合蛋白的切割；1為純化后的SUMO-buforin IIb融合蛋白；2為SUMO蛋白酶對融合蛋白切割后的混合物。b為Tricine/SDS-PAGE分析重組buforin IIb的再純化；1為切割后再純化的重組buforinIIb0圖6為重組buforin IIb蛋白的質譜圖。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例I :(I)構建表達載體根據大腸桿菌偏愛的密碼子和抗菌肽buforin IIb的氨基酸序列，以及pSUMO的多克隆位點，設計合成如下四條引物進行ovrelap PCR,其中Buforin IIb_F2和Buforin
IIb-R2做為模板。
Buforin
Bsa I
Buforin
Hind III
Buforin
BuforinAAC TGG AA-3'
在 50 μ I
GCG CA-31
GGC
ACG
CGT
CAG
CTG-3'
CAG ACGGCC
權利要求
1.重組抗菌肽buforinIIb的生產方法,其特征在于,它包括如下步驟 (1)應用重組DNA技術，將buforinIIb基因插入pSUMO載體中，構建pSUMO/buforinIIb原核表達載體； (2)pSUMO/buforinIIb原核表達載體轉化大腸桿菌，構建表達工程菌； (3)將步驟(2)得到的工程菌以乳糖為誘導劑誘導表達SUMO-buforinIIb融合蛋白； (4)收集步驟(3)誘導表達后的菌體，經細胞破碎后釋放出SUMO-buforinIIb融合蛋白，使用鎳離子親和層析純化，得到純化后的SUMO-buforin IIb融合蛋白； (5)將純化后的SUMO-buforinIIb融合蛋白經酶切反應,釋放出buforin IIb,經鎳離子親和層析分離得到含有His6標簽的SUMO蛋白和不含His6的buforin IIb蛋白。
2.根據權利要求I所述的重組抗菌肽buforinIIb的生產方法,其特征在于,步驟(2)中，所述的大腸桿菌為E. coli rosetta(DE3)。
3.根據權利要求I所述的重組抗菌肽buforinIIb的生產方法,其特征在于,步驟(3)中，誘導表達方法為將步驟(2)得到的工程菌接種于含卡那霉素50 60mg/L的LB液體培養基，37°C振蕩培養16h，然后取IOmL接種到IL LB液體培養基，37°C振蕩培養2 4h，0D600達到O. 8 I時，加乳糖至終濃度為O. 8 lg/L，32°C 37°C繼續振蕩培養8 10h，離心收集菌體。
4.根據權利要求I所述的重組抗菌肽buforinIIb的生產方法,其特征在于,步驟(4)中，所述的細胞破碎方法為超聲破碎。
5.根據權利要求I所述的重組抗菌肽buforinIIb的生產方法,其特征在于,步驟(4)或(5)中，所述的鎳離子親和層析使用的是Ni2+-NTA樹脂。
全文摘要
本發明公開了重組抗菌肽buforin IIb的生產方法，應用重組DNA技術，構建pSUMO/buforin IIb原核表達載體，再轉化大腸桿菌，構建表達工程菌；工程菌以乳糖為誘導劑誘導表達SUMO-buforin IIb融合蛋白；然后經細胞破碎后釋放出融合蛋白，使用鎳離子親和層析純化，純化后的融合蛋白經SUMO酶切反應，釋放出buforin IIb，經鎳離子親和層析分離得到含有His6標簽的SUMO蛋白和不含His6的buforin IIb蛋白。本發明方法在原核宿主細胞中高效表達了重組抗菌肽buforin IIb，分離純化簡單，重組蛋白純度高，易操作，易放大，表達產物穩定性好，適于大規模工業化生產。
文檔編號C07K1/22GK102925432SQ20111023101
公開日2013年2月13日 申請日期2011年8月12日 優先權日2011年8月12日
發明者殷志敏, 王期, 周軍 申請人:南京巴傲得生物科技有限公司