專利名稱：一種從混合植物甾醇中分離制備甾醇單體的方法
技術領域：
本發明涉及生物化工或者精細化工領域，具體涉及一種從混合植物留醇中分離制備多種留醇單體的方法。
背景技術：
天然植物留醇是一類存在于植物中的天然活性物質，是以環戊烷全氫菲為主體骨架(甾核)的留體化合物，C_3i3位為醇羥基，環結構上通常有雙鍵，在結構上與膽固醇相似。根據雙鍵位置在留核環結構上的C5-C6位和C7-C8位不同，可以將它們分為Δ5-植物甾醇和△ 7-植物留醇等大類，而由于側鏈的細微差別或C4位是否有甲基也代表了不同的植物留醇。可以說，官能團或化學鍵的不同，使植物留醇單體的化學結構復雜而多樣。已從植物中鑒定出了近百種植物留醇及相關衍生物，其中谷留醇(β-Sitosterol)、豆甾醇 (Migmasterol)、菜油甾醇(Campesterol)和菜籽甾醇(Brassicasterol)相對含量較多。 從化學結構上看，谷留醇比菜油留醇在支鏈上多一個CH2基團，豆留醇比菜籽留醇在支鏈上多一個CH2基團，菜籽留醇和豆留醇在支鏈上均含有一個雙鍵。植物留醇化學結構只有細微差別，導致了目前對它們的分離分析和純化的困難。植物留醇具有十分重要的生理功能，β -谷留醇具有類似氫化可的松和羥基保泰松的功能，有較強的抗炎作用；植物留醇對治療潰瘍性皮膚鱗癌有明顯功能，并且對血栓癥有預防作用。植物留醇除了在藥物上的應用外，最為引人注目的是其具有降低膽固醇吸收的功效，并可有效降低血清中低密度脂蛋白(LDL-C)水平。基于植物留醇對人體的諸多功能及其特有的性質，植物甾醇已在醫藥、食品、化妝品及飼料等行業中得到了廣泛的應用。目前市場上銷售的為甾醇混合物和2-3種Δ 5-植物甾醇單體(見Sigma-Aldrich 產品目錄，包括克數級豆留醇、毫克級谷留醇、以及純度為60%的毫克級菜油留醇，且價格較貴)，其他高純度Δ5-植物留醇單體和所有的△ 7-植物留醇單體均無市售產品。我國對植物留醇的研究現在大多只停留在對總植物留醇的提取和分析方面，對其活性成分的具體研究及應用鮮有報道。特別是對植物留醇單體的研究，國內尚不多見。隨著國內外對甾醇研究的日益關注和快速進展，植物留醇的藥用價值越來越受到人們的重視。國外利用高品質的留醇開發研究出許多高檔的藥物，對高純度留醇單體的需求量大幅上升。這主要是因為(1)結構的不同使不同留醇的功能也有一定的差異。例如谷留醇具有明顯的抗炎性，可用于皮膚潰瘍和皮膚腫瘤；而豆留醇具有一定的表面活性作用，可用作制備液晶的乳化助劑、無刺激保濕劑及營養劑和調理劑等，還可根據需要用于各種適宜所需的地方。(2)不同甾醇的功效可能會相互影響。例如，有報道稱，菜油甾醇會降低谷甾醇的降膽固醇的作用， 因而要求在谷甾醇的產品中菜油甾醇的最大含量要小于40%。(3)合成的需求。目前在以甾醇為前體合成藥物時，要求單個留醇具有較高的純度以利于控制反應的條件及產品的性質和療效。國外發達國家十分重視天然留體(植物留醇)資源的開發利用，重視食用油工業生產中脫臭餾出物等工業廢棄物的綜合利用，不僅原料來源穩定，而且價格相對便宜，在產品競爭上具有很大的優勢。因此，如何將混合植物留醇分離成留醇單體產品，并提高其純度和收率，是當前植物留醇分離精制研究的熱點。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種從混合植物留醇中分離制備植物留醇單體的方法，可以快速同時獲得多種不同結構的高純度植物留醇單體。本發明解決其技術問題所采用的技術方案如下
一種從混合植物留醇中分離制備留醇單體的方法，包括以下步驟
①將植物留醇混合物完全溶解于丙酮中，室溫冷卻至結晶析出，抽濾并干燥；
②將步驟①所的產物溶解于乙腈中，進樣入高效液相色譜柱，以乙腈/異丙醇/水作為流動相，對混合留醇中的各化合物實現基線分離，對各單峰分別進行回收；多次循環進樣，分別回收相同餾分的各單峰物質于相應回收瓶中；
③旋轉蒸發去除各餾分中的溶劑，得最終產品。所述步驟①中的植物甾醇混合物與丙酮的質量體積比1 :5 1 :10克/毫升，用 5(T60°C丙酮完全溶解甾醇混合物后，室溫冷卻6 12小時，有針狀結晶析出，抽濾并干燥結晶，得白色針狀或粉末狀留醇混合物。所述步驟②中的植物留醇混合物室溫溶解于有機溶劑乙腈中，質量體積比1 0. 5^1 2毫克/毫升，視混合留醇在乙腈中的溶解度而定。每次色譜進樣量在廣2毫升。所述步驟②中采用高效液相色譜作為分離植物留醇混合物的主要裝置，所述的色譜柱，包括所有半制備型或制備型C18和C8高效液相色譜柱，柱尺寸大于等于9. 4X250 mmD所述步驟②中液相色譜流動相為乙腈和異丙醇的混合試劑，二者的體積比為 60 95 40^5 ；或為乙腈、異丙醇和水的混合試劑，三者之間的體積比為60 80 :38 15 :2 5。所述步驟②中液相色譜流速為0. 5 2 min/mL，紫外檢測波長設為206 210 nm，每個循環的保留時間為2(Γ45分鐘。所述步驟③在5(T60°C水浴中減壓旋轉蒸發去除各餾分中的有機溶劑；對旋蒸后有未除凈的水，用氯仿及乙酸乙酯萃取除水后減壓蒸發有機溶劑得最終產品。所述的最終產品可以室溫下以氮氣或氦氣吹干。本發明的有益效果是該方法可在一次分離過程中同時獲得多種留醇單體，多次進樣可實現各單體從毫克級到克數級的分離制備，且純度較高。由于該色譜條件為等梯度洗脫，因此可連續進樣，節省分離時間，回收效率高。本發明的高效液相色譜方法對于包括植物留醇在內的天然產物純品的提取方面具有重要的理論及實際意義，將在植物的分析化學、精細化工中發揮重要作用，應用前景廣闊。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
具體實施例方式下述實施例中所用高效液相色譜儀為Agilent 1200型，配備四元泵、手動進樣閥、紫外檢測器、色譜工作站等。半制備型液相色譜柱均為Agilent公司的C18和C8柱。結晶用有機溶劑丙酮為分析純。流動相的組成中，乙腈為色譜級，分析級異丙醇經過濾蒸餾后備用，水為二次蒸餾水。采用的原料是市場上可購買的從玉米或大豆的脫臭餾出物中提取的植物留醇混合物，為淡黃色片狀或粉末狀物質。實施例1:
①用天平稱量10克淡黃色植物留醇混合物，倒入250毫升錐形瓶中，加入50毫升丙酮，將該錐形瓶置于60°C水浴中，攪拌至固體完全溶解。將該錐形瓶從溫水浴中拿出，靜置于平臺上，室溫冷卻，有白色針狀晶體緩慢析出。該結晶過程持續12小時，有白色針狀晶體緩慢析出。減壓條件下，用50毫升布氏漏斗抽濾，濾液為淡黃色的溶液，為初始混合物中可溶于丙酮的雜質，可舍去。白色針狀結晶物濾餅，為初步純化的植物留醇混合物。②稱取20毫克初步純化后的植物留醇混合物，置于干凈樣品瓶中，加入10毫升乙腈，水浴加溫40°C，使樣品完全溶解于乙腈中，制成備用的飽和樣品溶液。用2毫升色譜進樣針吸取1毫升上述溶液，手動進樣入高效液相色譜體系；色譜柱Agilent C18柱 (9.4X250 mm, 5 μ m)，流動相乙腈/異丙醇/水=60382，流速1. 5 mL/min，紫外檢測波長206 nm，保留時間45分鐘，對基線分離的各化合物的單峰，分別回收入各餾分瓶。完成一次分離過程后，立即再用進樣針抽取1毫升上述樣品溶液，重復上述操作步驟及分離過程，經10次循環進樣一分離一回收，每次進樣的相同出峰化合物可回收至同一餾分瓶。③對各餾分瓶中的被分離和累積的留醇單體溶液，在60°C水浴中，先減壓旋轉蒸發去除有機溶劑，未除凈的水，用氯仿萃取留醇，再以減壓旋轉蒸發法去除氯仿，室溫氮氣吹干，得最終白色留醇單體產品，密封低溫保存。各留醇單體純度經檢測可達90、5%。實施例2
①用天平稱量5克淡黃色植物留醇混合物，倒入250毫升錐形瓶中，加入50毫升丙酮，在60°C水浴中完全溶解后，室溫冷卻6小時，有白色針狀晶體緩慢析出。減壓條件下，用 50毫升布氏漏斗抽濾，濾餅為白色針狀植物留醇混合物。②稱取20毫克初步純化后的植物留醇混合物，水浴加溫40°C，使樣品完全溶解于20毫升乙腈中，制成備用樣品溶液。用2毫升色譜進樣針吸取1毫升上述溶液，手動進樣入高效液相色譜體系色譜柱Agilent C18柱(20 X 250 mm，5 ym)，流動相乙腈/異丙醇/水=80:15:5，流速2 mL/min，紫外檢測波長208nm ；保留時間40分鐘，對基線分離的各化合物的單峰，分別回收入各餾分瓶。經10次循環進樣一分離一回收，每次進樣的相同出峰化合物可回收至同一餾分瓶。③對各餾分瓶中的被分離和累積的留醇單體溶液，在60°C水浴中，先減壓旋轉蒸發去除有機溶劑，未除凈的水，用乙酸乙酸萃取留醇，再以減壓旋轉蒸發法去除乙酸乙酸，室溫氦氣吹干，得最終白色留醇單體產品，密封低溫保存。各留醇單體純度經檢測可達 90 95%。實施例3
①用天平稱量10克淡黃色植物留醇混合物，倒入250毫升錐形瓶中，加入100毫升丙酮，在50°C水浴中完全溶解后，室溫冷卻6小時，有白色針狀晶體緩慢析出。減壓條件下，用 100毫升布氏漏斗抽濾，濾餅為白色粉末狀植物留醇混合物。②稱取20毫克初步純化后的植物留醇混合物，水浴加溫30°C，使樣品完全溶解于40毫升乙腈中，制成備用樣品溶液。用2毫升色譜進樣針吸取2毫升上述溶液，手動進樣入高效液相色譜體系色譜柱Agilent C8柱(9. 4X250 mm，5 ym)，流動相乙腈/異丙醇=6:4，流速0.5 mL/min，紫外檢測波長206 nm，保留時間30分鐘，對基線分離的各化合物的單峰，分別回收入各餾分瓶。經20次循環進樣一分離一回收，每次進樣的相同出峰化合物可回收至同一餾分瓶。③對各餾分瓶中的被分離和累積的留醇單體溶液，在50°C水浴中，減壓旋轉蒸發去除有機溶劑，室溫氮氣吹干，得最終白色留醇單體產品，密封低溫保存。各留醇單體純度經檢測可達90 95%。實施例4
①用天平稱量5克淡黃色植物留醇混合物，倒入250毫升錐形瓶中，加入50毫升丙酮，在50°C水浴中完全溶解后，室溫冷卻10小時，有白色針狀晶體緩慢析出。減壓條件下， 用100毫升布氏漏斗抽濾，濾餅為白色粉末狀植物留醇混合物。②稱取50毫克初步純化后的植物留醇混合物，水浴加溫40°C，使樣品完全溶解于25毫升乙腈中，制成備用樣品溶液。用2毫升色譜進樣針吸取1毫升上述溶液，手動進樣入高效液相色譜體系色譜柱Agilent C8柱(9.4X250 mm, 5 ym)，流動相乙腈/異丙醇=8:2，流速1 mL/min，紫外檢測波長210 nm，保留時間20分鐘，對基線分離的各化合物的單峰，分別回收入各餾分瓶。經30次循環進樣一分離一回收，每次進樣的相同出峰化合物可回收至同一餾分瓶。③對各餾分瓶中的被分離和累積的留醇單體溶液，在50°C水浴中，減壓旋轉蒸發去除有機溶劑，室溫氮氣吹干，得最終白色留醇單體產品，密封低溫保存。各留醇單體純度經檢測可達90 95%。實施例5
①用天平稱量5克淡黃色植物留醇混合物，倒入250毫升錐形瓶中，加入50毫升丙酮，在60°C水浴中完全溶解后，室溫冷卻12小時，有白色針狀晶體緩慢析出。減壓條件下， 用100毫升布氏漏斗抽濾，濾餅為白色粉末狀植物留醇混合物。②稱取50毫克初步純化后的植物留醇混合物，水浴加溫30°C，使樣品完全溶解于100毫升乙腈中，制成備用樣品溶液。用2毫升色譜進樣針吸取2毫升上述溶液，手動進樣入高效液相色譜體系色譜柱Agilent C8柱(20X 250 mm，5 μ m)，流動相乙腈/異丙醇=95 15，流速2 mL/min,紫外檢測波長208 nm,保留時間25分鐘，對基線分離的各化合物的單峰，分別回收入各餾分瓶。經20次循環進樣一分離一回收，每次進樣的相同出峰化合物可回收至同一餾分瓶。③對各餾分瓶中的被分離和累積的留醇單體溶液，在50°C水浴中，減壓旋轉蒸發去除有機溶劑，室溫氦氣吹干，得最終白色留醇單體產品，密封低溫保存。各留醇單體純度經檢測可達90 95%。
權利要求
1.一種從混合植物留醇中分離制備留醇單體的方法，其特征在于包括以下步驟①將植物留醇混合物完全溶解于丙酮中，室溫冷卻至結晶析出，抽濾并干燥；②將步驟①所的產物溶解于乙腈中，進樣入高效液相色譜柱，以乙腈/異丙醇/水作為流動相，對混合留醇中的各化合物實現基線分離，對各單峰分別進行回收；多次循環進樣，分別回收相同餾分的各單峰物質于相應回收瓶中；③旋轉蒸發去除各餾分中的溶劑，得最終產品。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟①中的植物留醇混合物與丙酮的質量體積比1 :5 1 10克/毫升，用5(T60°C丙酮完全溶解甾醇混合物后，室溫冷卻6 12 小時，有針狀結晶析出，抽濾并干燥結晶，得白色針狀或粉末狀留醇混合物。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟②中的植物留醇混合物室溫溶解于有機溶劑乙腈中，質量體積比1 :0. 5^1 :2毫克/毫升，視混合留醇在乙腈中的溶解度而定，每次色譜進樣量在廣2毫升。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟②中采用高效液相色譜作為分離植物留醇混合物的主要裝置，所述的色譜柱，包括所有半制備型或制備型C18和C8高效液相色譜柱，柱尺寸大于等于9. 4X250 mm。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟②中液相色譜流動相為乙腈和異丙醇的混合試劑，二者的體積比為6(Γ95 :4(Γ5 ；或為乙腈、異丙醇和水的混合試劑，三者之間的體積比為60 80 :38 15 :2 5。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟②中液相色譜流速為0.5^2 min/mL，紫外檢測波長設為206 210 nm，每個循環的保留時間為20、5分鐘。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟③在5(T60°C水浴中減壓旋轉蒸發去除各餾分中的有機溶劑；對旋蒸后有未除凈的水，用氯仿及乙酸乙酯萃取除水后減壓蒸發有機溶劑得最終產品。
8.根據權利要求1或7所述的方法，其特征在于所述的最終產品可以室溫下以氮氣或氦氣吹干。
全文摘要
本發明公開了一種從混合植物甾醇中分離制備甾醇單體的方法。該方法利用高效液相色譜，在反相半制備型高效液相色譜柱上循環進樣和等度洗脫，分離植物甾醇混合物，對所分離的各個餾分，即植物甾醇單體分別收集，再經減壓蒸餾去除溶劑后，得白色結晶或粉末狀物質。本發明經多次進樣可實現對多種植物甾醇單體從毫克級到克數級的分離制備。本發明對于包括植物甾醇在內的天然產物純品的提取方面具有重要的理論及實際意義，將在植物的分析化學、精細化工中發揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號C07J9/00GK102351935SQ20111021974
公開日2012年2月15日 申請日期2011年8月2日 優先權日2011年8月2日
發明者岳秋林, 張欣, 程備久, 高俊蘭 申請人:安徽農業大學