專利名稱：用于治療和預防阿爾茨海默病的抗Aβ31-35抗體及其制備方法
技術領域：
本發明涉及抗Αβ抗體，具體屬于一種用于治療和預防阿爾茨海默病的抗 A β 31-35抗體及其制備方法。
背景技術：
阿爾茨海默病(Alzheimer，s disease, AD)，又名老年性癡呆，是一種中樞神經系統原發性退行性疾病，主要表現為進行性認知功能障礙、學習和記憶能力喪失、個性改變， 晚期出現嚴重癡呆。AD最典型的病理特征是腦內出現大量、高密度的老年斑，其主要成分是淀粉樣β蛋白(Amyloid β protein，Αβ)。Αβ的神經毒性作用已被廣泛報道。如圖 1所示，Αβ來自于跨膜的淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein, APP)，但APP本身具有神經營養作用。傳統的AD免疫療法多使用針對A β N-末端的抗體，其雖然具有一定療效，但副作用較大，能與APP位于細胞外的結構域結合從而傷害正常的ΑΡΡ。因此，目前臨床實驗已經暫停。
發明內容
本發明的目的是提供一種用于治療和預防阿爾茨海默病的抗Αβ 31-35抗體及其制備方法，抗Αβ 31-35抗體在預防和治療AD中應具有副作用小、特異性強的特點。本發明提供的一種用于治療和預防阿爾茨海默病的抗Αβ 31-35抗體，通過包括如下步驟的方法制得(1)采用有機固相合成法合成氨基酸序列為IIe-IIe-Gly-Leu-Met的Αβ 31-35片段，固相載體用HMP樹脂，保護氨基酸采用Fmoc (9-fluorenylmethyloxycarbony)，從多肽羧基端向氨基端合成，用TFA法裂解肽樹脂，經減壓蒸餾和乙醚萃取方法處理后得到粗品 Aβ 31-35 片段；再用高效液才目反才目色譜法(high-performance liquid chromatography, HPLC)進行純化，分析；取純化后的A β 31-35片段與血藍蛋白偶聯，偶聯方法是用碳化二亞胺法[l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide, EDC]進行縮合反應，得到 Αβ31-35片段-血藍蛋白偶聯物(抗原)；(2)用該偶聯物對大白兔進行基礎免疫和加強免疫后獲得抗A β 31-35抗體。我們已經研究了抗Aβ 31-35抗體對腦室注射Aβ或神經細胞培養中加入Αβ所致腦功能或細胞傷害的保護效應，效果明顯。這種抗體可以在制備治療和預防阿爾茨海默病藥物中應用。與現有技術相比本發明設計并制備針對A β 31-35序列的抗A β 31-35抗體，不僅能特異性封閉或阻斷內源性Αβ發揮神經毒性作用的活性中心，而且更重要的是，由于抗 Αβ31-35抗體只能與細胞外的Αβ特異結合，不能與跨膜結構中APP分子上處于膜結構內相應的31-35序列接觸，因而抗Αβ 31-35抗體在結合、清除Αβ的同時，可避免與跨膜蛋白APP的結合，從而不會影響APP發揮正常的促神經元生長、發育的作用。因此，與傳統的針對A β N-末端的抗體相比，抗A β 31-35抗體在預防和治療AD中將具有副作用更小、特異性更強的特點。
圖1人Αβ淀粉樣前體蛋白(ΑΡΡ695)結構示意圖。圖2抗Αβ 31-35抗體預處理對Αβ 1-42引起的大鼠空間學習記憶行為傷害的影響。其中Α，各組大鼠在第1-4訓練日的尋臺潛伏期變化；B，第3訓練日典型的大鼠游泳軌跡。圖3抗Αβ 31-35抗體預處理對Αβ 1-42引起的大鼠海馬LTP抑制的影響。其中 Α，連續記錄的海馬CAl區場電位幅度變化，顯示0. 5nmol抗Αβ 31-35抗體對Aβ 1-42引起的LTP壓抑具有部分恢復效應；B，不同處理組在高頻刺激后三個時間點的幅度變化比較， 顯示抗A β 31-35抗體對LTP的劑量依賴性保護效應。圖4Α β 1-42對培養神經元的傷害作用和抗A β 31-35抗體的預處理效應。圖5Αβ 31-35 (A)和Αβ 25_35(Β)對海馬培養細胞細胞內鈣水平的劑量依賴性升
高效應。
具體實施例方式實施例1用于治療和預防阿爾茨海默病的抗A β 31-35抗體的制備步驟(1)抗原制備采用有機固相合成法合成A β 31-35片段，固相載體用HMP樹脂，保護氨基酸采用 Fmoc (9-fluorenylmethyloxycarbony)保護的氨基酸，從多肽羧基端向氨基端合成，用TFA 法裂解肽樹脂，經減壓蒸餾和乙醚萃取方法處理后得到粗品A β 31-35片段。再用高效液相反相色譜法(high-performance liquid chromatography, HPLC)進行純化，純化后的樣品再用HPLC分析，純度為95%，將純化后的A β 31-35片段冷凍抽干。取純化后的Αβ 31-35片段與血藍蛋白偶聯，偶聯方法是用碳化二亞胺法[l_et hyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide, EDC]進行縮合反應，得到 Αβ 31_；35 片段-血藍蛋白偶聯物(抗原)。⑵抗體制備新西蘭大白兔2只，雄性，經過檢疫無病原菌的一級動物，體重為1. ^g，免疫前行耳靜脈采血分離血清，凍存作為陰性對照血清。基礎免疫取Aβ 31-35片段-血藍蛋白偶聯物ang/ml與等量CFA充分乳化后于兩只兔背部皮下多點注射，每次免疫的抗原量為IOOOyg/只。加強免疫第一次免疫后間隔2周，再以lmg/lml抗原加等體積的IFA充分乳化后注入兔背部皮下多點加強免疫。而后每隔2周按第二次免疫法重復加強免疫6次。每次免疫后的第12天，行頸動脈插管取血，分離血清得到抗A β 31-35抗體，效價為1 16000。實施例2我們觀察了抗A β 31-35抗體對腦室注射A β或神經細胞培養中加入A β所致腦功能或細胞傷害的保護效應。主要結果如下
(I)Morris水迷宮實驗圖2顯示了各組大鼠尋找水下平臺的平均潛伏期㈧和典型的游泳軌跡(B)。與正常大鼠比較，腦室內注射5nmol Αβ 1_42可導致尋臺潛伏期明顯延長；不同濃度的抗A β 31-35抗體處理后，潛伏期和游泳距離縮短，特別是0. 5和5nmol的抗 Aβ 31-35抗體預處理組在各訓練日均明顯小于單獨使用Aβ 1-42組(P < 0. 01)，表明Aβ 引起的行為學傷害可被抗A β 31-35抗體所逆轉。(2)在體海馬LTP預實驗如圖3所示，急性給予A β 1-42不影響高頻刺激前測試刺激引起的fEPSP，但HFS誘導的LTP受到Αβ 1-42片段的顯著壓抑。聯合給予不同濃度的抗Αβ 31-35抗體后，Aβ 1-42引起的LTP壓抑效應被明顯逆轉。圖3Α顯示了 0. 5nmol的抗Αβ 31-35抗體對Αβ 1-42引起的LTP壓抑的恢復效應。較高濃度(5nmol)抗Αβ31_35 抗體幾乎完全逆轉了 Αβ 1-42引起的LTP損害(圖:3Β)。(3)細胞生存和細胞毒性預實驗圖4顯示了 Aβ 1-42對培養神經元的損害作用和抗Αβ 31-35抗體的預處理效應。發現20μΜ Aβ 1-42預處理M小時后細胞存活率較對照組明顯下降(綠色細胞為Calcein-AM染色標記活細胞，紅色細胞為PI染色標記的死亡細胞)；給予20 μ M抗A β 31-35抗體預處理后可以明顯抑制A β 1-42誘導的細胞損傷。(4)細胞內鈣成像預實驗初步結果顯示，A β 31-35(圖5A)的效應類似于 Αβ 25-35(圖5B)，兩者均能升高[Ca2+] 且都具有一定程度的劑量依賴性。其中，給予 10 μ M禾口 20 μ M的Αβ 31-35時，熒光比值R(F34Q/F38。)可分別增加21. 和70. 7% (P值均 <0.05)。提示小片段的A β 31-35具有類似于A β 25-35以及內源性大分子A β的效應， 可以劑量依賴性引起海馬細胞內Ca2+水平升高，這可能與Αβ產生的細胞毒性有關。目前，
抗 Αβ31"35抗體對細胞鈣超載的研究正在進行中。
SEQUENCE LISTING
<110>山西醫科大學
<120>用于治療和預防阿爾茨海默病的抗A β 31-35抗體及其制備方法
<130>0
<160>1
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>人工合成
<400>1
lie lie Gly Leu Met
1 5。
權利要求
1.一種用于治療和預防阿爾茨海默病的抗A β 31-35抗體，其特征在于，通過包括如下步驟的方法制得(1)采用有機固相合成法合成氨基酸序列為IIe-IIe-Gly-Leu-Met的Αβ31-35片段，其中固相載體用HMP樹脂，保護氨基酸采用9-fluorenylmethyloxycarbony，從多肽羧基端向氨基端合成，用TFA法裂解肽樹脂，經減壓蒸餾和乙醚萃取方法處理后得到粗品 Αβ 31-35片段；再用高效液相反相色譜法進行純化；取純化后的Αβ 31-35片段與血藍蛋白偶聯，偶聯方法是用碳化二亞胺法進行縮合反應，得到A β 31-35片段-血藍蛋白偶聯物；(2)用該偶聯物對大白兔進行基礎免疫和加強免疫后獲得抗Aβ 31-35抗體。
2.如權利要求1所述的抗Aβ 31-35抗體在制備治療和預防阿爾茨海默病藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種用于治療和預防阿爾茨海默病(AD)的抗Aβ31-35抗體，制備方法采用有機固相合成法合成氨基酸序列為Ile-Ile-Gly-Leu-Met的Aβ31-35片段，純化，分析，與血藍蛋白偶聯，偶聯物對大白兔進行基礎免疫和加強免疫后獲得抗Aβ31-35抗體。將該抗體用于在體AD動物實驗或臨床AD患者治療，可有效避開APP上處于跨膜部分的結合位點，選擇性清除細胞外的Aβ。與傳統的針對AβN-末端的抗體相比，抗Aβ31-35抗體在預防和治療AD中將具有副作用更小、特異性更強的特點。
文檔編號C07K16/18GK102260349SQ20111019671
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月12日 優先權日2011年7月12日
發明者楊威, 武美娜, 王昭君, 王曉暉, 祁金順, 蔡紅艷 申請人:山西醫科大學