專利名稱：一種從血漿分離組分Ⅰ+Ⅲ中純化人免疫球蛋白的方法
技術領域：
本發明屬于生物制藥血液制品領域，具體涉及一種用正辛酸沉淀結合一步陰離子交換層析技術從血漿生產廢棄組分I +III中分離純化人免疫球蛋白的方法。
背景技術：
免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)是人體對外來抗原(如細菌、病毒及其它毒素或異物)進行免疫應答的主要物質。血漿來源的人免疫球蛋白制品按注射途徑分為靜脈注射人免疫球蛋白(Intravenous Immunoglobulin G，IVIG)和肌肉注射人免疫球蛋白，其主要成分為免疫球蛋白G (IgG)，它是最重要的血漿蛋白之一，分子量150kDa，在血漿中的含量大概是6. 6^14. 5g/L。自20世紀80年代問世以來，已經成功用于免疫缺陷造成的感染性疾病的預防，治療原發性免疫缺陷、感染性疾病、獲得性免疫缺陷等疾病。目前人免疫球蛋白的獲取主要是從血漿及相關組分II中純化制備，由于原料血漿來源有限，人血漿來源的免疫球蛋白供不應求，同時由于原料的特殊性(為寶貴的人血)以及嚴格的血漿篩選(對混合血漿進行病毒抗體、特異性抗原及核酸的篩查)都使得血漿蛋白產品價格變得非常昂貴。綜上，目前人免疫球蛋白的制備主要存在以下問題
1、目前國內外人免疫球蛋白的獲取主要是從低溫乙醇沉淀組分II制備，經過純化得到人免疫球蛋白。提取人免疫球蛋白后會產生組分I +III沉淀，被作為廢物處理，鮮有從組分 I +III中純化人免疫球蛋白的制備方法。這主要是因為組分I +III中成分復雜，其主要成分有脂蛋白、纖維蛋白原、纖維結合蛋白、IgG、IgM、凝血因子VDI等，同時也含有各種微量的其他蛋白，如igA、凝血因子π、νπ、ιχ、χ、銅藍蛋白等。組分I +III中的各類凝血因子，極容易在分離過程中活化，從而造成分離過程中成分不穩定，產生大量的沉淀或絮狀。組分 I +III中的脂蛋白也是難以徹底去除的物質，脂蛋白的殘留將影響產品過濾以及后續步驟中所使用凝膠的壽命。將組分I +III溶解液進行非還原十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(見圖2)，可見組分I + III沉淀中蛋白質成分至少有十種之多，用Gel-Pro analyzer軟件對各類條帶進行面積積分分析，結果IgG含量20 30%，同時進行高效液相色譜法(HPLC)分析(見圖3)，IgG含量22. 39%，其他各類雜蛋白含量有75%以上。從雜質含量占75%以上的組分I +III中提取適合臨床使用的人免疫球蛋白，相對于從IgG含量超過 70%的組分II +III或I + II +III中純化人免疫球蛋白則難度大很多。2、國內有通過低溫乙醇法從組分I +III或組分III中提取人免疫球蛋白，從而提高收率的方法。例如呂勇等(CN 101648998A)利用低溫乙醇法，將組分I +III沉淀溶解后，用纊9%乙醇沉淀壓濾組分I后，再用13-15%乙醇沉淀壓濾組分III，最后用17 19%乙醇沉淀分離組分II，最后將組分II溶解、超濾、純化、配制獲得免疫球蛋白制品，其產品符合《中國藥典》(三部)的要求。但是此工藝采用三次低溫乙醇沉淀法從組分I +III中提純人免疫球蛋白，步驟繁多，同時在組分I +III中仍采取低溫乙醇法分離免疫球蛋白，收率低，生產環境要求低溫，能耗較高。乙醇類的化學物質容易破壞IgG的生物學功能，用該方法制備的IgG容易形成聚集體。該工藝需將組分II通過加溫至51-53°c 3小時進行提純，由于免疫球蛋白的耐熱性與其純度有關，一般純度越高，其耐熱性就越差，因此該方法也不能最大程度的保留人免疫球蛋白天然的理化性質和生物學活性。同時，由于組分III為血漿分離中病毒較為集中的組分，因此病毒滅活顯得尤為重要，而該工藝只采用一種病毒滅活方式，尚不能完全滅活/去除病毒。3、層析法近年來越來越廣泛的應用于血漿蛋白的分離純化，在人免疫球蛋白的制備中，應用較多的是離子交換層析法，但多采用陽離子與陰離子結合或兩步陰離子交換柱層析，否則純化效果難于達到要求。4、用辛酸或辛酸鹽沉淀非IgG類雜蛋白來達到分離IgG的技術尚不成熟，目前處于研究階段，國內外還未見用辛酸沉淀組分I +III進行純化免疫球蛋白的報道。因此，研究開發辛酸沉淀法提高人免疫球蛋白分離制備過程中的收率，特別是從血漿分離組分廢棄物 F I +III中回收IgG，對于增加市場供應、緩解國內血漿供應緊張的局面具有極大的現實意義。
發明內容
本發明的目的在于提供一種從血漿生產廢棄組分I +III中高效率的回收高純度的人免疫球蛋白的方法，該方法用辛酸沉淀組分I +III中的非IgG雜蛋白、結合一步陰離子交換層析技術，分離純化人免疫球蛋白IgG。本發明所述的從血漿組分I +III中純化人免疫球蛋白的方法，其分離純化步驟包括將組分I +III沉淀用醋酸醋酸鈉緩沖液充分溶解；用正辛酸沉淀非IgG的雜蛋白，制備 IgG ；采用陰離子交換柱層析獲得高純IgG ；納米膜過濾，超濾脫鹽濃縮，配制，除菌，分裝。上述用于溶解組分I + III沉淀的醋酸醋酸鈉緩沖液的優選含量為0. 02mol/L, pH為4. 5，離子強度為1. 4mS/cm。上述醋酸醋酸鈉緩沖液用量一般為組分I +III沉淀重量的3倍。上述用正辛酸沉淀非IgG的雜蛋白過程中，采用噴淋方式加入正辛酸，同時快速攪拌，使溶解液中的正辛酸能均勻分布。上述用正辛酸沉淀非IgG的雜蛋白過程中，加入至溶液中的正辛酸終濃度的范圍為 8(Tl20mmol/L，優選 9(Tll0mmol/L。上述正辛酸加入速度為20ml/min。上述正辛酸沉淀非IgG的雜蛋白過程在常溫條件下完成。上述所用正辛酸，為分析純正辛酸，辛酸含量超過99%。上述用正辛酸沉淀沉淀非IgG的雜蛋白過程同時完成滅活脂包膜病毒功能。上述陰離子交換柱層析中，所選用的陰離子交換層析凝膠特點為強陰離子交換 Q (季銨乙基)基團，基質為交聯瓊脂糖凝膠，凝膠優選大孔徑(粒徑為12(Tl65um)。本發明是選用的陰離子交換層析凝膠，其主要離子交換集團交聯度較小、空隙大， 在ρΗ5. 4飛.0的環境下，優化上柱條件，根據雜質蛋白質的等電點不同，調整pH值和電導率的變化，使各種蛋白質所帶電荷不同，與離子交換樹脂的結合力大小不同，達到多種蛋白質分離純化的效果，同時IgM等大分子雜質容易進入離子交換劑的內部，提高大分子的實際吸附載量，因此本發明僅采用一步陰離子交換柱層析完成純化，該一步陰離子交換層析法，能代替文獻報道中兩步離子交換層析才能達到的提高產品純度的效果。裝柱方法如下先把凝膠攪拌懸浮后轉入到層析柱內，攪拌均勻，靜置過夜， 移除上清。柱頭沖洗干凈后，把上柱頭移動到層析柱正上方，旋轉柱頭高度調節把手，使上柱頭接近凝膠平衡液上液面，緩緩下降，使上柱頭內的空氣排盡。打開上柱頭閥門，并用管道連接至空氣陷阱的出液端，用力旋轉柱頭高度調節把手，把凝膠壓實。其最后體積為自然沉降體積的85%，向層析柱內加入1%柱體積濃度為1%的丙酮溶液，以2L/min的流速用注射用水沖洗層析柱來測量理論塔板數及不對稱因子，從而確保裝柱有最好的柱效。陰離子交換層析柱上柱條件的優化使用3飛倍柱體積的pH5. 6的0. 02mol/L 醋酸醋酸鈉緩沖液進行柱子的平衡，流速控制在廣2cm/min。因為目標蛋白IgG等電點為 PH5. (Γ9. 5，如果平衡液的pH過高，則造成目標蛋白吸附到層析柱上，從而降低層析柱收率；而平衡液的PH過低，則造成雜質蛋白不能有效吸附到層析柱上，從而降低產品純度。用 0.02mol/L的醋酸醋酸鈉緩沖液平衡層析柱，能保證在F I + III充分溶解的前提下，不影響層析柱對蛋白質的吸附效果。如果醋酸醋酸鈉緩沖液濃度過高，則會影響層析柱對雜蛋白的吸附能力，而醋酸醋酸鈉緩沖液濃度過低，則使F I +III沉淀溶解不充分。陰離子交換柱層析中最佳流穿流速為廣2cm/min。本發明所述的從血漿組分I +III中純化人免疫球蛋白的方法，包括以下具體操作步驟
a.組分I+ III沉淀的溶解將沉淀用pH為4. 3^5. 0的0. 02mol/L的醋酸醋酸鈉緩沖液充分溶解；
b.正辛酸沉淀制備IgG上述溶解液中加入0. 3mol/L NaOH溶液，調pH至4. 5 士0. 05， 攪拌1小時混勻后，以20ml/min的速度、噴淋方式緩慢加入正辛酸，同時快速攪拌，使溶解液中的正辛酸能均勻分布，至溶液中正辛酸終濃度為8(Tl20mmOl/L時停止加入辛酸，快速攪拌2小時，沉淀非IgG的雜蛋白，同時滅活脂包膜病毒；
c.上陰離子交換柱層析獲得高純IgG將上述步驟溶液離心或壓濾，去除沉淀，留取上清液；上清溶液用0. 3mol/L NaOH調整溶液pH至5. 4 6. 0，經0. 2um濾器過濾后，上預先平衡的陰離子交換層析柱，進一步純化分離；
d.收集流穿液，納米膜過濾，超濾濃縮，配制，除菌，分裝上述流穿液用0.3mol/LHCl 調整pH至4. (Γ4. 5，經預過濾后，進行納米膜過濾，除去包括細小病毒在內的潛在病毒；過濾后制品用0. 01mol/L醋酸溶液進行超濾脫鹽，使制品pH維持在4. (Γ4. 5，電導率小于 lmS/cm后，進行濃縮，達到蛋白含量50g/L以上，加入0. 2mol/L甘氨酸作為保護劑，除菌、分裝。本發明中層析純化蛋白的優化操作過程如下首先將陰離子交換層析柱用PH5. 6 的0. 02mol/L醋酸鈉緩沖液平衡3個柱體積，然后將樣品上柱，流速為廣2cm/min，使大分子的雜質結合到柱子上，收集流穿液，將結合在層析介質上的雜質蛋白用2mol/L NaCl洗脫處理5個柱體積，使交換介質再生，用注射用水處理2個柱體積，用0. lmol/L NaOH沖洗2 個柱體積，再次用注射用水處理2個柱體積，最后用20%乙醇保存。本發明的有益效果如下
1、本發明用辛酸沉淀、結合一步陰離子交換層析技術從血漿生產廢棄組分I +III中分離純化人免疫球蛋白，能夠在室溫操作，步驟簡短，收率高，低能耗，高產出，適合大規模生
7產，充分實現了血漿的綜合利用，不僅縮短整個生產工藝時間，而且降低成本，產生非常可觀的經濟效益，又防止了對環境的污染，具有良好的經濟和社會價值。2、本發明人經充分研究確認，辛酸沉淀雜蛋白的效果依賴于加入辛酸的速度，辛酸的加入量(即終濃度)、PH值、緩沖液離子強度、蛋白含量等因素的相互結合，才能達到完全沉淀雜蛋白，而IgG不會共沉的最佳狀態，從而篩選確定了最佳工藝條件。本發明中采用噴淋方式并緩慢加入正辛酸，可防止發生副反應。3、按照IL血漿產出80g組分I + III沉淀，該沉淀溶解后至少含有蛋白質5. 5g，其中IgG含量約占20%左右。本發明工藝能回收組分I +III中80%以上的IgG，計算出該發明工藝能提高IgG收率約1. 06g/L血漿，而國內IgG產率4飛g/L血漿，因此該工藝能提高現有收率17. 7^26. 5%，有效地降低血液制品生產中原料血漿的成本，提高血漿的綜合利用。4、本工藝使用一種Q (季銨乙基)大孔徑瓊脂糖與丙烯酰胺基質的陰離子交換凝膠，其主要離子交換集團交聯度較小、空隙大，在PH5. 4^6. 0的環境下，IgM等大分子雜質容易進入離子交換劑的內部，在適宜的平衡條件下，提高大分子的實際吸附載量，因此該陰離子交換層析法有效的提高了產品的純度，只采用一步陰離子交換層析，就能獲得純度98% 以上的終產品。5、本發明工藝步驟中采用辛酸沉淀法粗制IgG，辛酸不僅能夠沉淀雜蛋白和脂類， 而且在20°C，pH < 6. 0，蛋白含量> 3. 7g/L的條件下，1小時就能夠滅活脂包膜病毒。同時工藝中采用35nm納米膜加上15nm納米膜雙步過濾去除細小病毒在內的脂包膜和非脂包膜病毒，兩種不同機制的病毒滅活/去除步驟，能最大程度滅活/去除病毒污染，最大程度的保證制品的安全性。本發明工藝生產的靜注人免疫球蛋白質量檢測項目均符合《中國藥典》(三部) 2010版規定的質量標準。其中SDS-PAGE檢測純度達到99%，見圖4 從左向右依次為溶解，溶解，辛酸后，辛酸后，M (SM1811)，成品，成品；HPLC檢測單體加二聚體含量達99% (見圖5)以上，均高于《中國藥典》(三部)2010版的質量標準，并符合歐洲藥典標準(見表1)。表1本發明靜注人免疫球蛋白質量檢測指標對比
權利要求
1.一種從血漿分離組分I +III中純化人免疫球蛋白的方法，其特征在于用辛酸沉淀組分I +III中的非IgG雜蛋白，結合一步陰離子交換層析技術，分離純化人免疫球蛋白IgG。
2.根據權利要求1所述的一種從血漿分離組分I+III中純化人免疫球蛋白的方法，其特征在于分離純化步驟包括將組分I +III沉淀用醋酸醋酸鈉緩沖液充分溶解；用正辛酸沉淀，去除脂質及部分雜蛋白，制備IgG ；采用陰離子交換柱層析獲得高純IgG ；過濾濃縮， 配制，除菌，分裝。
3.根據權利要求2所述的一種從血漿分離組分I+III中純化人免疫球蛋白的方法，其特征在于溶解組分I + III沉淀的醋酸醋酸鈉緩沖液含量為0. 02mol/L,離子強度為1. 4mS/ cm, pH至4. 5 ；醋酸醋酸鈉緩沖液的用量為組分I + III沉淀重量的3倍。
4.根據權利要求2所述的一種從血漿分離組分I+III中純化人免疫球蛋白的方法，其特征在于用正辛酸沉淀非IgG的雜蛋白過程中，采用噴淋方式加入正辛酸，同時快速攪拌， 使溶解液中的正辛酸均勻分布；加入正辛酸的速度為20ml/min ；溶液中正辛酸的終濃度為 90-1IOmmol/L。
5.根據權利要求2所述的一種從血漿分離組分I+III中純化人免疫球蛋白的方法， 其特征在于所說的陰離子交換柱層析所選用的陰離子凝膠特點為強陰離子交換Q季銨乙基基團，基質為交聯瓊脂糖凝膠，粒徑為12(Tl65um ；僅采用一步陰離子交換柱層析完成純化；層析過程中，最佳流穿流速為廣2cm/min。
6.根據權利要求2所述的一種從血漿分離組分I+III中純化人免疫球蛋白的方法， 其特征在于所說的層析純化蛋白的操作過程如下首先將陰離子交換層析柱用PH5.6的 0. 02mol/L醋酸鈉緩沖液平衡3個柱體積，然后將樣品上柱，流速為廣2cm/min，使大分子的雜質結合到柱子上，收集流穿液，將結合在層析介質上的雜質蛋白用2mol/L NaCl洗脫處理5個柱體積，使交換介質再生，用注射用水處理2個柱體積，用0. lmol/L NaOH沖洗2個柱體積，再次用注射用水處理2個柱體積，最后用20%乙醇保存。
7.根據權利要求1或2所述的一種從血漿分離組分I+III中純化人免疫球蛋白的方法，其特征在于包括以下具體操作步驟a.組分I+ III沉淀的溶解將沉淀用pH為4. 3^5. 0的0. 02mol/L的醋酸醋酸鈉緩沖液攪拌充分溶解；緩沖液用量為組分I + III沉淀重量的3倍；b.正辛酸沉淀制備IgG:上述溶解液中加入0.3mol/L NaOH溶液，調pH至4. 5 士0. 05， 攪拌1小時混勻后，以20ml/min的速度、噴淋方式緩慢加入正辛酸，同時快速攪拌，使溶解液中的正辛酸能均勻分布，至溶液中正辛酸的終濃度為9(Tll0mmOl/L時停止加入辛酸，快速攪拌2小時，沉淀非IgG的雜蛋白，同時滅活脂包膜病毒；c.上陰離子交換柱層析獲得高純IgG將上述步驟溶液離心或壓濾，去除沉淀，留取上清液；上清液用0. 3mol/L NaOH調整pH至5. 4 6. 0，經0. 2um濾器過濾后，上預先平衡的陰離子交換層析柱，進一步純化分離；d.收集流穿液，納米膜過濾，超濾濃縮，配制，除菌，分裝上述流穿液用0.3mol/LHCl 調整pH至4. (Γ4. 5，經預過濾后，進行納米膜過濾，除去包括細小病毒在內的潛在病毒；過濾后制品用0. 01mol/L醋酸溶液進行超濾脫鹽，使制品pH維持在4. (Γ4. 5，電導率小于 lmS/cm后，進行濃縮，達到蛋白含量50g/L以上，加入0. 2mol/L甘氨酸作為保護劑，除菌、分裝。
8.根據權利要求1或2所述的一種從血漿分離組分I+III中純化人免疫球蛋白的方法，其特征在于具體操作步驟如下a.將組分I+ III沉淀用3倍重量的7°C pH4. 5的0. 02mol/L的醋酸醋酸鈉緩沖液充分溶解；b.樣品充分溶解后，升溫至20°C，以0.6L/min的流速加入0. 3mol/L NaOH溶液，調pH 至4. 5士0. 05，攪拌1小時混勻后，以20ml/min的速度噴淋方式加入正辛酸，使溶解液中的正辛酸能均勻分布，至溶液中辛酸終濃度為lOOmmol/L，停止加入辛酸，劇烈攪拌以利于辛酸充分混勻，攪拌2小時，沉淀非IgG的雜蛋白，同時滅活脂包膜病毒；c.將上述步驟溶液以4000rpm轉速，18°C離心30分鐘，棄沉淀，將上清液用0. 3mol/ L NaOH調pH至5. 6，用0. 45um濾器過濾，調整溶液電導廣2mS/cm，準備上陰離子交換層析柱進行純化；用pH5. 6的0. 02mol/L醋酸醋酸鈉緩沖液將陰離子交換層析柱平衡3飛個柱體積，然后將樣品上柱，流速為2cm/min，使大分子的雜質結合到柱子上，收集流穿液；d.上述流穿液用0. 3mol/L HCl調整ρΗ4. 0 4· 5，經0. 1 μ m濾膜預過濾后，用Millipore viresolve Pro 30nm納米膜和15nm納米膜兩步過濾，除去包括細小病毒在內的潛在病毒， 過濾后制品用10倍體積0. 01mol/L醋酸溶液進行超濾脫鹽，使制品pH維持在4. (Γ4. 5，電導率小于lmS/cm后，進行濃縮，達到蛋白含量50g/L以上，配制時加入0. 2mol/L甘氨酸作保護劑，進行除菌分裝。
9.根據權利要求1或2所述的一種從血漿分離組分I+III中純化人免疫球蛋白的方法，其特征在于具體操作步驟如下a.組分I+ III沉淀溶解于7。C 3倍沉淀量的0. 02mol/L的醋酸醋酸鈉緩沖液中，室溫下充分溶解；b.將樣品充分溶解后，不調pH，升溫至20°C，充分攪拌混勻后，緩慢加入正辛酸使溶液中辛酸終濃度為llOmmol/L，并進行劇烈攪拌，以利于辛酸充分混勻，攪拌2小時；C、用20°C注射用水600 kg,以20 kg /min的流速對壓濾機濾板沖洗，然后用常溫壓縮空氣吹干濾板，平衡后壓濾，獲得澄清濾液，其中IgG純度在65%以上；將上述濾液用0. 3M NaOH調pH至5. 8，用0. 45um濾芯過濾，調整溶液電導廣anS/cm，準備上陰離子交換層析柱進行純化；將陰離子交換層析柱用PH5. 8的0. 02mol/L醋酸醋酸鈉緩沖液平衡3飛個柱體積，然后將樣品上柱，流速為1. 5cm/min，使大分子的雜質結合到柱子上，收集流穿液；d.上述流穿液用0. 3mol/L HCl調整ρΗ4. 0 4· 5，經0· 1 μ m濾膜預過濾后，用Mi 11 ipore viresolve Pro 20nm納米膜過濾，除去包括細小病毒在內的潛在病毒，過濾后制品用10倍體積含40mmol/L HAc的注射用水進行超濾脫鹽，超濾膜包截留相對分子質量為10kD，使制品PH維持在4. (Γ4. 5，電導率小于lmS/cm后，進行濃縮，達到蛋白含量50g/L以上，配制時加入0. 2mol/L甘氨酸做保護劑，進行除菌分裝。
10.根據權利要求2所述的一種從血漿分離組分I+III中純化人免疫球蛋白的方法，其特征在于所說的層析純化蛋白的操作過程如下步驟a組分I + III沉淀溶解于3倍沉淀量、pH為4. 5,0. 02mol/L的醋酸醋酸鈉緩沖液中，室溫下充分溶解；步驟b緩慢加入正辛酸使溶液中辛酸終濃度為90mmol/L，通過該步驟使溶液中IgG純度達到65%，并去除脂包膜病毒；步驟c用20°C注射用水600 kg，以20 kg /min的流速對壓濾機濾板沖洗，然后用常溫壓縮空氣吹干濾板，平衡后壓濾，獲得澄清濾液；將濾液用0. 3mol/L NaOH調整pH至5. 4 ；用 0. 45um濾器過濾，調整溶液電導1. 5mS/cm,以流穿流速為1. 5cm/min上陰離子交換層析柱進行純化；d.上述流穿液用0. 3mol/L HCl調整pH4. 5，經0. 1 μ m濾膜預過濾后，用Millipore viresolve Pro (商品名)30nm納米膜和15nm納米膜兩步過濾，除去包括細小病毒在內的潛在病毒，過濾后制品用10倍體積0. 01mol/L醋酸溶液進行超濾脫鹽，使制品pH維持在 4. (Γ4. 5，電導率小于lmS/cm后，進行濃縮，達到蛋白含量50g/L以上，配制時加入0. 2mol/ L甘氨酸作保護劑，進行除菌分裝。
全文摘要
本發明涉及一種從血漿組分Ⅰ+Ⅲ中分離純化人免疫球蛋白的方法，其目的在于提供一種高效率的回收高純度的人免疫球蛋白的方法。本發明的技術方案包括以下步驟a.組分Ⅰ+Ⅲ沉淀的充分溶解；b.辛酸沉淀，去除脂質及部分雜蛋白，制備IgG；c.上陰離子交換柱層析純化；d.收集流穿液，納米膜過濾，超濾濃縮，配制，除菌，分裝。本發明的有益效果是能夠在室溫操作，步驟簡短，收率高，低能耗，高產出，適合大規模生產，充分實現了血漿的綜合利用，不僅縮短整個生產工藝時間，而且降低成本，能產生非常可觀的經濟效益，兩種不同機制病毒滅活/去除方法保證產品的安全性，又防止了對環境的污染，具有良好的經濟和社會價值。
文檔編號C07K1/36GK102250240SQ20111017485
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月27日 優先權日2011年6月27日
發明者鞏艷艷, 師秀梅, 朱孟沼, 李斌, 菅長永, 邵玉娟, 馬山, 高亞朋, 高建鋒, 高超 申請人:山東泰邦生物制品有限公司