專利名稱：一種核酸分離方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，具體涉及一種核酸的分離方法、裝置及其應用，進一步的，本發明涉及在疫苗制品中去除宿主細胞核酸殘留及檢測殘留的宿主核酸含量的方法、裝置及其應用。
背景技術：
預防接種傳統上是針對傳染病綜合性預防的重要措施之一，疫苗的免疫效果和安全性備受關注。目前包括重組(CH0細胞)乙肝疫苗和VeiO細胞狂犬病疫苗在內的很多疫苗都是細胞培養疫苗，在疫苗的生產過程中不可避免地混入了宿主細胞核酸的污染。如果用混有宿主細胞核酸的蛋白疫苗免疫人體，將有可能產生不可預料的后果，可能造成受體基因的插入突變，導致抑癌基因失活后癌基因被激活等嚴重后果。
考慮到這些潛在的風險，國際以及各國的醫療衛生機構都對疫苗制品中DNA的殘留制定了相關標準。1986年世界衛生組織規定，用細胞系生產的疫苗每支DNA的殘留不能超過lOOpg，而在1997年美國藥品食品衛生監督局規定在美國使用的細胞系疫苗DNA殘留不能超過10pg，目前我國按照世衛組織的標準，規定每支疫苗的DNA殘留不能超過lOOpg。這些嚴格的質量標準使得去除疫苗中的DNA成為生產過程中的一個關鍵的技術瓶頸。制備病毒疫苗的傳統工藝是采用超濾濃縮、分子篩層析純化等手段進行純化，缺陷是制備的疫苗中宿主DNA的殘留量較高。為了克服這個缺陷，有的研究人員通過改變超濾濃縮的倍數和層析柱的連接方式，降低宿主DNA的殘留量。去除宿主細胞DNA殘留的另一種方法是采用DNA酶處理。歐洲專利0870508和美國專利5948410披露了這種類型的常規方法。其涉及兩步處理，首先用DNA酶(例如,Benzonase)處理,然后用陽離子洗漆劑(例如，CTAB)處理。盡管這些措施在一定程度上改善了疫苗制品的品質，但純化效率不高、技術穩定性較差，未能從根本上解決疫苗中的宿主DNA殘留的問題。為了嚴格控制疫苗生產及終產品中DNA的殘留，在疫苗生產的整個過程中要對DNA含量的變化進行全程監控，以便了解每個環節在DNA去除方面的能力。這就需要建立敏感而穩定的檢測技術，目前鑒定疫苗中DNA殘留量的方法主要有三種分子雜交法、基于DNA結合蛋白的方法，和實時熒光定量PCR法。分子雜交法檢測疫苗中的DNA殘留，是基于不同標記的DNA探針與固定在硝酸纖維素膜上的宿主細胞DNA之間的雜交，通過標記分子檢測與宿主細胞形成雜交的探針的量，進而推測宿主細胞DNA的含量。通常可以用不同的標記物對DNA探針進行標記，包括標記酶、生物素、放射性同位素、地高辛等。由于地高辛標記核酸探針的高靈敏度和操作上的便利，目前被廣泛使用，其檢測靈敏度可達IOpg以下。基于DNA結合蛋白的檢測方法是利用兩種能與DNA非特異性結合的蛋白質，單鏈DNA結合蛋白和抗單鏈DNA抗體。檢測的基本過程是，使生物素-DNA單鏈結合蛋白或尿素酶-抗ssDNA的單抗與被檢測的宿主細胞DNA結合，利用親合素將此復合物連接到生物素-硝酸纖維素膜，尿素酶催化尿素分解成NH3和CO2導致pH值發生變化，根據pH值的變化推算被結合的DNA的含量。熒光定量PCR是另一種廣泛使用的DNA檢測技術，利用PCR擴增原理，在加入一對擴增引物的同時加入一個特異性的熒光探針，產物的增加可以通過熒光信號指示，通過實時監控PCR體系中的熒光信號的變化，推測樣本中初始模板的定量。定量PCR可實時檢測產物量，通過加入已知濃度的標準樣品繪制標準曲線，然后根據待測樣品在標準曲線中的位置推算初始模板的濃度。雖然這三種檢測方法在實際工作中均得到了合理的應用，但不難看出這三種檢測方法均是對疫苗樣本中核酸成分的間接檢測，在穩定性、靈敏性以及使用的方便程度上還存在可優化空間。盡管存在這種可能性，低濃度核酸的定量檢測在技術上仍然是一個巨大的挑戰，目前還沒有成熟的能夠通用的解決方案，尤其是對疫苗中的DNA殘留這種無明顯序列特征的樣本的檢測。
發明內容
本發明涉及以下按順序編號的段落定義的主題I. 一種核酸分離方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)獲得一種電泳槽，該電泳槽包括至少兩個固定分隔的或可操作性分隔的電泳區域，在不影響大分子正常電泳行為的情況下，這些分隔使不同電泳區域內的溶液能夠被單獨收集；2)將包含待分離核酸的溶液加入到電泳槽中，3)施加外加電場,使溶液中的核酸分子選擇性地分布于一個被分隔的或被可操作性分隔的電泳區域，從而得到分離。2.根據段落I所述的核酸分離方法，其特征在于用于固定分隔不同電泳區域的材料包括瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、帶孔或微孔的固相支持物。3.根據段落I所述的核酸分離方法，其特征在于用于可操作性分隔不同電泳區域的方式包括閥門、開關、可阻斷性流道。4.根據段落1-3任一項所述的核酸分離方法，其特征在于所述電泳槽還包括選擇性核酸分離部件。5.根據段落4所述的核酸分離方法，其特征在于所述選擇性擇性核酸分離部件包括DEAE纖維素膜、透析膜、半透膜或濾膜。6.根據段落I所述的核酸分離方法，其特征在于所述電泳槽包括兩個固定分隔的或可操作性分隔的電泳區域，在不影響大分子正常電泳行為的情況下，這些分隔使不同電泳區域內的溶液能夠被單獨收集。7.根據段落6所述的核酸分離方法，其特征在于所述電泳槽包括槽體、陽極、陰極和電泳區域；電泳區域由固定分隔或可操作性分隔隔開的兩個區域組成，陽極和陰極分別位于這兩個區域中。8.根據段落6所述的核酸分離方法，其特征在于所述電泳槽包括槽體、陽極、陰極和電泳區域；電泳區域包括兩個獨立的區域，所述獨立的區域經電泳通道連接，電泳通道中帶有固定分隔或可操作性分隔；陽極和陰極分別位于這兩個區域內。9.根據段落I所述的核酸分離方法，其特征在于所述電泳槽包括三個固定分隔的或可操作性分隔的電泳區域，在不影響大分子正常電泳行為的情況下，這些分隔使不同電泳區域內的溶液能夠被單獨收集；陽極和陰極分別位于兩端的區域內。
10.段落6或9所述的核酸分離方法，其特征在于所述電泳槽還包括選擇性核酸分離部件。11.根據段落10所述的核酸分離方法，其特征在于所述選擇性擇性核酸分離部件包括DEAE纖維素膜、透析膜、半透膜或濾膜。12.根據段落I所述的核酸分離方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)獲得一種電泳槽，該電泳槽包括兩個固定分·隔的或可操作性分隔的電泳區域，分別為陽極區域和中間區域，陽極和陰極分別位于陽極區域和中間區域中；2)將核酸/蛋白溶液加入到電泳槽的中間區域中；3)施加外加電場，使溶液中的核酸成分選擇性地分布于陽極區域中，從而使其與主要分布于中間區域中的蛋白成分分離；4)分別收集分布于陽極區域的核酸成分和分布于中間區域的蛋白成分。13.根據段落I所述的核酸分離方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)獲得一種電泳槽，該電泳槽包括兩個固定分隔的或可操作性分隔的電泳區域，分別為陽極區域和中間區域，陽極和陰極分別位于陽極區域和中間區域中，陽極區域和中間區域之間還包括選擇性核酸分離部件；2)將核酸/蛋白溶液加入到電泳槽的中間區域中；3)施加外加電場，使溶液中的核酸成分從中間區域向陽極區域泳動，在此過程中，被位于中間區域和陽極區域之間的能選擇性核酸分離部件所捕獲，從而使其與主要分布于中間區域中的蛋白成分分離；4)分別收集主要分布于中間區域的蛋白成分和被選擇性核酸分離部件所捕獲的核酸成分。14.段落I所述的核酸分離方法在分離樣本中核酸的應用。15.根據段落14所述的應用，其特征在于用于分離核酸/蛋白混合物中的核酸和蛋白成分。16.根據段落14所述的應用，其特征在于用于分離疫苗制品中的核酸和疫苗成分。17.根據段落14所述的應用，其特征在于用于檢測溶液中核酸成分的含量。18.根據段落16所述的應用，其特征在于用于檢測疫苗制品中核酸成分的含量。19. 一種蛋白制品，其特征在于用段落I所述的核酸分離方法去除蛋白制品中的核酸成分。20.根據段落19所述的蛋白制品，其特征在于進一步包括使核酸降解的步驟。21.根據段落19或20任一項所述的蛋白制品，其特征在于進一步包括將核酸/蛋白復合體解離的步驟。22.根據段落19所述的蛋白制品，其特征在于所述蛋白制品為疫苗制品。本發明要解決的技術問題是如何高效、簡便、低成本地分離疫苗或其他蛋白溶液中的核酸及蛋白組分，并精確測定其含量。本發明最重要的技術改進是，利用核酸與蛋白分子在設定溶液條件下電荷性質的不同，通過施加外加電場，使其分別分布于被分隔或被可操作性被分隔的不同電泳區域，通過單獨收集這些區域內的溶液，實現核酸與蛋白成分的分離。一方面，本發明提供了一種核酸分離方法。利用核酸分子在溶液中不同于其他成分的電荷性質，本方面通過對溶液施加外加電場，使其中的核酸分子選擇性地轉移到一個被分隔的或被可操作性分隔的區域中，實現核酸分子與其他溶液成分的分尚。
一方面，本發明提供了一種用于核酸分離的裝置。該裝置主要是一種電泳槽，包括至少兩個固定分隔的或可操作性分隔的電泳區域，在不影響大分子正常電泳行為的情況下，這些分隔使不同電泳區域內的溶液能夠被單獨收集。在核酸分離過程中，可以將核酸分子加入到電泳槽的一個被分隔或被可操作性分隔的區域內(定義為起始區域)；通過施加電場，使其向另一個被分隔或被可操作性分隔的區域(定義為收集區域)內轉移，從而實現核酸分子與其他溶液成分的分離。一方面，本發明提供了一種核酸濃縮方法。通過設置起始區域和收集區域之間不同的溶液體積比，實現核酸成分的濃縮。例如，將起始區域溶液的體積設置為IOOmL,將收集區域溶液的體積設置為10mL，在分離過程中，使IOOmL起始溶液中的核酸成分通過電泳，選擇性的轉移到IOmL收集溶液中，這樣收集區域中溶液的核酸濃度就是起始區域中溶液的核酸濃度的10倍，也就是說，實現了起始溶液中核酸的10被濃縮。應當理解，起始區域和收集區域溶液的體積比可以在很大的范圍內按需要任意調整，實現溶液中核酸不同濃縮的比例，調整范圍可以設置為例如1/2-1/1,000，000 ;同樣應當理解，起始區域和收集區域溶液的實際體積可以按照需要在很大的范圍內任意設置，實現不同體積溶液中核酸的濃縮，起始區域溶液的體積可以設置為例如50uL-l，000，000L。 另一方面，本發明進一步提供了一種核酸濃縮方法。通過在連接起始區域和收集區域的核酸轉移通道上設置能選擇性分離核酸的部件，使核酸在局部區域得到富集，達到分離、濃縮溶液中核酸成分的技術效果。應當理解，選擇性核酸分離部件包括所有能夠利用核酸成分的物理、化學、以及生物學性質，使核酸選擇性地富集(包括阻滯、吸附、粘附)在核酸分離部件上。具體包括但不限于利用核酸分離部件的分子篩效應、核酸的電荷性質、分子大小、長短、未和性實現核酸分尚的各種方式；優選的，核酸分尚部件包括DEAE纖維素膜、透析膜、半透膜或濾膜。一方面，本發明提供了一種低濃度核酸樣本中核酸成分含量的直接檢測方法。通過利用本發明提供的核酸濃縮方法和裝置，首先將較大體積的低濃度核酸樣本中的核酸成分進行濃縮，使濃縮后的核酸含量適合核酸含量的直接檢測技術，包括但不限于紫外分光光度法、核酸中糖或磷含量的檢測、核酸水解成單核苷酸后的檢測。相比與目前廣泛使用的低濃度核酸的間接檢測技術(分子雜交法、基于DNA結合蛋白的方法、實時熒光定量PCR法)，本發明提供的直接檢測方法具有更高的準確性和穩定性。一方面，本發明提供了一種所述核酸分離方法在分離樣本中核酸的應用。另一方面，本發明提供了一種分離核酸/蛋白混合物中的核酸或蛋白成分的方法。 另一方面，本發明提供了一種分離疫苗制品中的核酸或蛋白成分的方法。另一方面，本發明提供了一種檢測樣本中核酸成分的含量的方法。另一方面，本發明提供了一種檢測疫苗制品中核酸成分的含量的方法。—方面，本發明提供了一種利用本發明提供的方法或裝置制備的低核酸含量的蛋白制品。另一方面，本發明提供了一種利用本發明提供的方法或裝置制備的低核酸含量的疫苗。另一方面，本發明提供了一種利用本發明提供的方法或裝置制備的低核酸含量的疫苗，在疫苗制備過程中，還包含核酸降解步驟、以及使核酸與蛋白解離的步驟。根據本發明，所提供的核酸分離過程還包括使核酸降解的步驟。應該理解，能夠使核酸降解的任何方法均可應用于該過程中，包括但不限于用特異性或非特異性核酸降解酶處理核酸/蛋白樣本使核酸成分降解，用DNA烷基化劑例如β -丙內酯(BLP)處理核酸/蛋白樣本使殘留的核酸成分降解成小片段，根據本發明，所提供的核酸分離過程還包括使核酸/蛋白復合體解離的步驟。應該理解，能夠使核酸/蛋白復合體解離的任何方法均可應用于該過程中，包括但不限于有限加熱、SDS處理、超聲處理等。本發明的有益效果本發明提供了一種使核酸/蛋白溶液中的核酸及蛋白組分分離的方法、裝置及其應用。與現有技術相比，本發明提供的分離方法及裝置一方面，能夠更簡便、高效、低成本地 去除疫苗制品中宿主細胞DNA的殘留，使蛋白疫苗得到純化；另一方面，能夠更簡便、高效、低成本地分離疫苗中宿主細胞DNA的微量殘留，使直接檢測宿主細胞DNA的含量成為可能，提高了檢測的靈敏度和穩定性。
圖I. 一種分隔的兩腔電泳槽示意2. —種分隔的帶選擇性核酸分離部件的兩腔電泳槽示意3. —種分隔的三腔電泳槽示意4. 一種分隔的帶選擇性核酸分離部件的三腔電泳槽示意5. —種分離的兩腔電泳槽示意6. —種分離的帶選擇性核酸分離部件的兩腔電泳槽示意7. —種分離的三腔電泳槽示意8. —種分離的帶選擇性核酸分離部件的三腔電泳槽示意圖
具體實施例方式等電點與溶質的電荷性質兩性離子所帶電荷因溶液的pH值不同而改變，當兩性離子正負電荷數值相等時，溶液的PH值即其等電點。當外界溶液的pH大于兩性離子的pi值，兩性離子釋放質子帶負電。；反之，當外界溶液的pH小于兩性離子的pi值，兩性離子質子化帶正電。在某一 pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，所帶凈電荷為零，呈電中性，此時溶液的PH稱為該氨基酸的等電點。核酸的等電點比較低，DNA的等電點為4-4. 5,RNA的等電點為2-2. 5。中性氨基酸的羧基解離程度大于氨基，其Pi偏酸，Pi值略小于7. O ;酸性氨基酸的羧基解離程度更大，Pl明顯小于7. O ;堿性氨基酸的氨基解離程度明顯大于羧基等，故其Pl大于7. O本發明所提供的核酸分離技術的關鍵點在于，利用溶液中核酸分子與其他溶質不同的電荷性質，使其選擇性地分布于分隔的或可操作分隔的不同的區域內，實現核酸與其他溶質的分離。在本發明中，可以通過改變溶液的PH值，對不同溶質的電荷性質進行調整，從而實現最佳的分離效果。應當理解，為了適應核酸與不同溶質之間的分離，所述溶液的pH值可以在很大范圍內進行調整，例如pH 1-13，優選的溶液pH范圍為pH2-7，更優選的pH4-7。分離裝置本發明所提供的分離核酸用途的電泳槽包括槽體、陽極、陰極、陽極與陰極之間的電泳區域。其中，電泳區域被固定分隔或可操作性分隔分成至少兩個區域，這些固定或臨時性分隔在不影響大分子正常電泳行為的情況下，使各區域內的溶液及存在于其中的大分子樣本可被單獨收集，從而實現大分子物質的分離回收。根據本發明，本發明所提供的電泳槽還可以包括選擇性核酸分離部件。所述選擇性核酸分離部件包括所有能夠利用核酸成分的物理、化學、以及生物學性質，使核酸選擇性地阻滯、吸附、粘附在核酸分離部件上。具體包括但不限于利用核酸分離部件的分子篩效應、核酸的電荷性質、分子大小、長短、未和性實現核酸分尚的各種方式；優選的，核酸分尚部件包括DEAE纖維素膜、透析膜、半透膜或濾膜。 電泳槽槽體可由合適的材料制造，包括但不限于玻璃、有機玻璃、塑料、樹脂、聚丙烯、丙烯酸樹脂或類似材料。電泳槽槽體可以為合適的任何形狀，包括但不限于方形、長方形、三角形、圓形、圓筒形、球形、錐形或不同形狀的組合。被分隔的電泳區域按照與電極的關系，可以分為陽極區域、陰極區域和中間區域；各區域的體積可以在IOuL或以上體積自由設置，以適應電泳槽的不同用途。根據本發明，用于將電泳槽固定分隔成不同區域的材料可以選自瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、以及帶孔或微孔的固相支持物；固相支持物包括但不限于有機玻璃、塑料、樹脂、聚丙烯、丙烯酸樹脂或類似材料。根據本發明，用于將電泳槽可操作性分隔成不同區域的方式可以包括閥門、開關、可阻斷性流道、或將不同的電泳區域拆卸分離。可阻斷性流道是指連接不同電泳區域的流道可被物理方式阻斷，從而實現可操作性分隔，具體的阻斷方式包括但不限于用止血鉗夾住、折疊流道實現分隔、插入阻擋物實現分隔。免疫原性蛋白適用于本發明的蛋白可衍生自疫苗靶標的任何病毒，可將免疫原性蛋白質配制成滅活病毒、減毒病毒、裂解病毒制劑、純化的亞單位制劑、或從某種病毒分離純化或衍生的病毒蛋白或病毒顆粒。適用于本發明的蛋白可以是病毒抗原，這些抗原優選包括在病毒生命周期的至少一個階段暴露于其表面的表位；優選的，病毒抗原在多種血清型或分離物中是保守的。適用于本發明的蛋白包括衍生自一種或多種以下所列病毒的抗原。病毒可以是無包膜的，或者優選有包膜的。病毒優選RNA病毒，更優選ssRNA病毒。它們可具有正義基因組，或優選具有反義基因組。它們的基因組可以非節段的，或者優選節段的。正粘病毒病毒抗原可衍生自正粘病毒，例如甲型、乙型和丙型流感病毒。正粘病毒抗原可選自一種或多種病毒蛋白質，包括血凝素(HA)、神經氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基質蛋白質(Ml)、膜蛋白(M2)、一種或多種轉錄酶組分(PB1、PB2和PA);優選的，抗原包括HA和NA。流感抗原可衍生自流行病爆發間的年度流感毒株。或者，流感抗原可以衍生自可能導致流行病爆發的毒株(即與目前的流行毒株相比，具有新血凝素的流感毒株，或者在禽類對象中致病并可能平行轉移至人群的流感毒株，或對人致病的流感毒株)。取決于具體的季節和疫苗所包含的抗原性質，流感抗原可以衍生自以下一種或多種血凝素亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 或 H16。本發明的流感抗原可以衍生自禽流感毒株，特別是高致病性禽流感毒株HPAI(Alexander, Avian Dis. 2003 47 :976-81)。流感病毒抗原的進一步細節見下文。副粘病毒科病毒病毒抗原建議衍生自副乳病毒科病毒，例如肺病毒(RSV)、副乳病毒(PIV)和麻疹病毒。肺病毒屬病毒抗原可衍生自肺病毒屬，例如呼吸道合胞體病毒(RSV)、牛呼吸道合胞體病毒、小鼠的肺炎病毒和火雞鼻氣管炎病毒。肺病毒屬優選RSV。肺病毒抗原可以選自一種或多種以下蛋白質，包括表面融合蛋白(F)、糖蛋白(G)和小疏水性蛋白(SH)、基質蛋白M和M2、核衣殼蛋白N、P和L及非結構性蛋白NSl和NS2。優選的肺病毒抗原包括 、6和1參見，例如J Gen Viol. 2004年11月；85(部分11) :3229。肺病毒屬抗原還可·配制成或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合型RSV/PIV病毒可同時包含RSV和PIV的組分。副粘病毒屬病毒抗原可衍生自副乳病毒屬，例如1-4型副流感病毒(PIV)、腮腺炎(病毒)、仙臺病毒、猿猴病毒5、牛副流感病毒和新城疫病毒。副粘病毒優選PIV或腮腺炎病毒。副粘病毒屬抗原可以選自一種或多種以下蛋白質血凝素一神經氨酸酶(HN)、融合蛋白Fl和F2、核蛋白(NP),憐蛋白(P)、大蛋白(L)就基質蛋白(M)。優選的副粘病毒屬蛋白包括HN、F1和F2。副粘病毒屬抗原還可配制成或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合型RSV/PIV病毒可同時包含RSV和PIV的組分。可商業購得的腮腺炎疫苗包括單價形式或與麻疹和風疹疫苗聯用(MMR)的減毒活腮腺炎病毒。麻疹病毒屬病毒抗原可以衍生自麻疹病毒屬，例如麻疹(病毒)。麻疹病毒屬抗原可選自一種或多種以下蛋白質血凝素(H)、糖蛋白(G)、融合因子(F)、大蛋白(L)、核蛋白(NP)、聚合酶磷蛋白(P)和基質(M)。可商業購得的麻疹疫苗包括通常與腮腺炎和風疹聯用的減毒的活麻疹病毒(MMR)。微小RNA病毒病毒抗原可衍生自微小RNA病毒,例如腸病毒、鼻病毒、嗜肝RNA病毒(Heparnavirus)、心病毒和口蹄疫病毒。優選衍生自腸病毒,例如脊髓灰質炎病毒的抗原。腸病毒病毒抗原衍生自腸病毒，例如1，2或3型脊髓灰質炎病毒、1-22和24型柯薩奇A病毒、1-6型柯薩奇B病毒、1-9，11-27和29-34型艾柯病毒(ECHO病毒),68-71 (型)腸病毒。腸病毒優選脊髓灰質炎病毒。腸病毒抗原優選一種或多種以下衣殼蛋白VP1、VP2、VP3和VP4。可商業購得的脊髓灰質炎疫苗包括滅活的脊髓灰質炎疫苗(IPV)和口服脊髓灰質炎病毒疫苗(OPV)。嗜肝RNA病毒病毒抗原可衍生自嗜肝RNA病毒，例如甲肝病毒(HAV)。可商業購得的HAV疫苗包括滅活的HAV疫苗。披膜病毒病毒抗原可衍生自披膜病毒，例如風疹病毒屬、α病毒或動脈炎病毒。優選衍生自風疫病毒屬，例如風疫病毒的抗原。披膜病毒抗原可選自E1、E2、E3、C、NSP-1、NSP0-2、NSP-3或NSP-4。披膜病毒抗原優選自E1、E2或E3。可商業購得的風疹疫苗包括通常與腮腺炎和麻疹疫苗聯用的冷適應的活病毒(MMR)。
黃病毒屬病毒抗原可衍生自黃病毒屬，例如蜂傳腦炎(病毒)(TBE)、登革熱(病毒)(1，2，3或4型)、黃熱病(病毒)、日本腦炎(病毒)、西尼羅河腦炎(病毒)、圣路易斯腦炎(病毒)、俄羅斯春夏型腦炎(病毒)、波瓦桑腦炎(病毒)。黃病毒屬抗原可選自PrM、M、C、E、NS-l、NS-2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b 和 NSS。黃病毒屬抗原優選自PrM、M 和 E。可商業購得的TBE疫苗包括滅活的病毒疫苗。鼠疫病毒病毒抗原可衍生自鼠疫病毒，例如牛病毒性腹瀉(病毒)(BVDV)、經典豬瘟(病毒)(CSFV)或邊境病(病毒)(BDV)。嗜肝DNA病毒病毒抗原可衍生自嗜肝DNA病毒，例如乙肝病毒。嗜肝DNA病毒抗原可選自表面抗原(L，M和S)、核心抗原(HBc，HBe)。可商業購得的HBV疫苗包括含有表面抗原S蛋白的亞單位疫苗。丙肝病毒病毒抗原可衍生自丙肝病毒(HCV)。HCV抗原可選自以下一種或多種EU E2、E1/E2、NS345多蛋白、NS 345 一核心多蛋白、核心和/或非結構區的膚(Houghton 等，Hepatology, 1991,14 381)。桿狀病毒病毒抗原可衍生自桿狀病毒，如萊薩病毒(狂犬病病毒)和水泡病毒(VSV) O桿狀病毒抗原可選自糖蛋白(G)、核蛋白(N)、大蛋白(L)、非結構蛋白(NS)。可商業購得的狂犬病病毒疫苗包含用人雙倍體細胞或胎恒河猴肺細胞培養的殺傷病毒。杯狀病毒科病毒抗原可衍生自杯狀病毒科，如諾瓦克病毒和諾瓦克樣病毒，如夏威夷病毒和雪山病毒。冠狀病毒病毒抗原可衍生自冠狀病毒、SARS、人呼吸道冠狀病毒、禽傳染性支氣管炎(病毒)(IB V)、小鼠肝炎病毒(MHV)和豬傳染性腸胃炎病毒(TGEV)。冠狀病毒抗原可選自刺突(S)、包膜(E)、基質(M)、核衣殼(N)和/或血凝素-酯酶糖蛋白(HE)。冠狀病毒抗原優選衍生自SARS病毒。W004/92360描述了 SARS病毒抗原。逆轉錄病毒病毒抗原可衍生自逆轉錄病毒，如腫瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒。腫瘤病毒抗原可衍生自HTLV-1、HTLV-2或HTLV-5。慢病毒抗原可衍生自HIV_1或HIV-2。逆轉錄病毒抗原可選自 gag、pol、env、tax、tat、rex、rev、nef > vif > vpu 和 vpro HIV 抗原可選自 gag(p24gag 和 p55gag)、env (gpl60. gpl20 和 gp41)、pol、tat、nef、rev vpu、小蛋白(優選p55gag和gpl40v缺失)。HIV抗原可衍生自以下一種或多種毒株HIVIIIb、HIVsF2、HIVlav, HIVlai, HIVmn, HIV-1CM235> HIV-Ius40呼腸孤病毒病毒抗原可衍生自呼腸孤病毒，如正呼腸孤病毒、輪狀病毒、環狀病毒或科羅拉多蟀傳熱病毒(Coltivirus)。呼腸孤病毒抗原可選自結構蛋白λ I、λ 2、λ 3、μ I、μ 2、δ I、δ 2或δ 3，或者非結構蛋白δ NS、μ NS或δ Is。優選的呼腸孤病毒抗原可衍生自輪狀病毒。輪狀病毒抗原可選自￥ 1、￥ 2、￥ 3、￥ 4(或切割產物￥ 3和￥ 8)、吧卩1、VP6、NSP3、NSP2、VP7、NSP4或NSPS。優選的輪狀病毒抗原包括VP4 (或切割產物VPS和VP8)和 VP7。細小病毒病毒抗原可衍生自細小病毒,如細小病毒B19。細小病毒抗原可選自VP-l、VP-2、VP-3、NS-1和NS-2。細小病毒抗原優選衣殼蛋白VP-2。δ -肝炎病毒(HDV):病毒抗原可以是衍生的HDV，特別是HDV的δ -抗原(參見例如，美國專利5378814)。戍肝病毒(HEV):病毒抗原可衍生自HEV。
庚肝病毒(HGV):病毒抗原可衍生自HGV。人皰疫病毒病毒抗原可衍生自人癥疫病毒，如單純癥疫病毒(HSV),水痘-帶狀皰疹病毒(V ZV)、EB病毒(EBV)、巨細胞病毒(CMV)、人皰疹病毒6 (HHV6)、人皰疹病毒7 (HHV7)和人皰疹病毒8 (HHVB)。人皰疹病毒抗原可選自立即早期蛋白(α)、早期蛋白(β)和晚期蛋白(Y)。HSV抗原可衍生自HSV-I或HSV-2毒株。HSV抗原可選自糖蛋白gB、gC、gD和gH、融合蛋白(g B),或免疫逃避蛋白(gC、gE或gl)。VZV抗原可選自核心、核衣殼、外被膜或包膜蛋白。可商業購得減毒的活VZV疫苗。EBV抗原可選自早期抗原(EA)蛋白、病毒衣殼抗原(VCA)或膜抗原(MA)的糖蛋白。CMV抗原可選自衣殼蛋白、包膜糖蛋白(如gB和gH)或外被膜蛋白。乳多空病毒抗原可衍生自乳多空病毒，如乳頭瘤病毒和多瘤病毒。乳頭瘤病毒包括 HPV 血清型 1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63 和 65。HPV抗原優選衍生自血清型6、11、16或18。HPV抗原可選自衣殼蛋白(LI)和(L2)或E1-E7，或其融合物。優選將HPV抗原制成病毒樣顆粒(VLP)。多瘤病毒包括BK病毒和JK病毒。 多瘤病毒抗原可選自VP1、VP2或VP3。《疫苗》(Vaccines),第四版，(Plotkin和Orenstein編，2004);《醫學微生物》(Medical Microbiology),第四版,(Murray 等編，2002);《病毒學》(V irology),第三版,(W. K. Joklik 編，1988);《基礎病毒學》(Fundam entalV irology),第二版，(B. N. Fields 和D. M. Knipe編，1991)也描述了病毒抗原,本發明的蛋白制品涵蓋了這些抗原。本發明蛋白制品可包含適用于兒科對象的一種或多種免疫原性蛋白質。兒科對象一般年齡小于約3歲，或小于約2歲，或小于約I歲。兒科抗原可在6個月、I年、2年或3年的時間中多次給予。兒科抗原可衍生自靶向兒科群體的病毒和/或兒科群體易受感染的病毒。兒科病毒抗原包括衍生自以下一種或多種病毒的抗原正粘病毒(流感)、肺病毒(RSV)、副粘病毒(PIV和腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(風疹)、腸病毒(脊髓灰質炎)、HBV、冠狀病毒(SARS)和水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)。本發明蛋白制品可包含適用于老年人或免疫力受損個體的一種或多種免疫原性蛋白質。這些個體可能需要較頻繁地接種較高劑量的或用佐劑配制的制劑，從而能增強他們對靶抗原的免疫應答。靶向用于老年人或免疫力受損個體中的抗原包括衍生自一種或多種以下病毒的抗原正粘病毒(流感)、肺病毒(Rsv)、副粘病毒(PIV和腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(風疹)、腸病毒(脊髓灰質炎)、HBV、冠狀病毒(SARS)、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨細胞病毒(CMV)。病毒培養后，可對純化的病毒顆粒，例如澄清的細胞培養液中存在的病毒顆粒，或對從這種澄清的細胞培養液中純化的病毒顆粒使用烷基化劑。本發明方法可涉及通過澄清除去細胞材料，然后從澄清的細胞培養液中純化病毒顆粒，例如采用層析。可對以此方式純化的病毒顆粒使用烷基化劑，或在任選的超濾/滲濾步驟后使用烷基化劑。優選的方法不對感染的細胞培養液的澄清上清液使用烷基化劑，而對從這種澄清上清液純化的病毒顆粒使用燒基化劑(參見 Morgeaux 等，Vaccine, 1993,11 :82-90)。本發明蛋白制品包括通過工程菌株制備的重組蛋白。疫苗生產細胞可從用細胞培養物增殖的病毒制備本發明疫苗。此外，本發明包括在細胞培養物中表達的重組蛋白制劑。病毒復制和重組蛋白表達優選哺乳動物細胞培養物。本領域已知許多哺乳動物細胞系，包括源自以下的細胞系人或非人靈長類(例如，猴)細胞(例如，通過引用全文納入本文的W001/38362、W001/41814、W002/40665、W02004/056979 和 W02005/080556 中所述的 PER. C6 細胞，由 ECACC 以保藏號 96022940保藏)、MRC-5 (ATCC CCL-171)、WI-38 (ATCC CCL-75)、HEK 細胞、HeLa 細胞、胎恒河猴肺細胞(ATCC CL-160)、人胚胎腎細胞(293細胞，通常用剪切的腺病毒5型DNA轉化)、Vero細胞(來自猴腎)、馬、牛(例如，MDBK細胞)、綿羊、犬(例如，犬腎MDCK細胞，ATCCCCL34MDCK (NBL2)或 MDCK 33016，保藏號為 DSMACC 2219，如 WO 97/37000 和 WO 97/37001所述)、貓和嚙齒類動物(例如，倉鼠細胞，如BHK21-F，HKCC細胞或中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)，可以獲得各種發育階段的細胞系，包括例如成年、新生兒、胎兒和胚胎。合適的猴細胞是,例如非洲綠猴細胞,例如Vero細胞系中的腎細胞。合適的犬細胞是，例如MDCK細胞系中的腎細胞。因此，合適的細胞系包括但不限于MDCK ；CH0 ；293T ； BHK ；Vero ；MRC-5 ；PER. C6 ;WI_38 ;等等。利用哺乳動物細胞系表示疫苗可以不含諸如雞DNA，卵蛋白質(例如，卵白蛋白和卵類粘蛋白)等物質。在某些實施方式中，細胞是固定的(例如，PER. C6細胞；ECACC 96022940)。優選的實施方式利用哺乳動物細胞，這些細胞可選自和/或衍生自一種或多種以下的非限制性細胞類型成纖維細胞(例如，表皮、肺)、內皮細胞(例如，主動脈細胞、冠狀動脈細胞、肺細胞、血管細胞、表皮微血管細胞、臍帶細胞)、肝細胞、角質化細胞、免疫細胞(例如，T細胞、B細胞、巨噬細胞、NK、樹突細胞)、乳腺細胞(例如，上皮細胞)、平滑肌細胞(例如，血管細胞、主動脈細胞、冠狀動脈細胞、動脈細胞、子宮細胞、支氣管細胞、子宮頸細胞、視網膜周細胞)、黑素細胞、神經細胞(例如，星形細胞)、前列腺細胞，上皮細胞、平滑肌細胞)、腎細胞(例如，上皮細胞、腎小球系膜細胞、近端小管細胞)、骨骼細胞(例如，軟骨細胞、破骨細胞、成骨細胞)、肌肉細胞(例如，成肌細胞、骨骼肌細胞、平滑肌L細胞、支氣管細胞)、肝臟細胞、視網膜細胞或成視網膜細胞、肺細胞和基質細胞。W097137000和W097/37001描述了能在懸液和無血清的介質中生長，并可用于產生和復制病毒，特別是流感病毒的動物細胞和細胞系的制備。進一步的細節見W003/023021和 TO03/023025。用于培養流感病毒的優選哺乳動物細胞系包括源自馬-達二氏犬腎的MDCK細胞；源自非洲綠猴(Cercopithecus aethiops)腎臟的Vero細胞；或源自人胚胎成視網膜細胞的PER. C6細胞。這些細胞系可廣泛獲自，例如美國模式培養物保藏所(ATCC)、寇里爾細胞保藏中心(Coriell Cell Repositories)或歐洲細胞培養物保藏所(ECACC)。例如，ATCC提供目錄號為CCL-81、CCL-81. 2、CRL-1586和CRL-1587的各種不同Vero細胞，目錄號為CCL-34的MDCK細胞。PER. C6可以保藏號96022940獲自ECACC。培養流感病毒的最優選細胞系的MDCK細胞系。原始MDCK細胞系可以CCL-34獲自ATCC，但也可使用該細胞系的衍生物。例如，W097/37000披露了適用于在懸浮培養基中生長的 MDCK 細胞系("MDCK 33016"，以 DSM ACC 2219 保藏)。類似地，EP-A-1260581 (W001/64846)披露了生長在無血清培養懸液中的MDCK衍生細胞系("B-702 "，以FERMBP-7449 保藏)。W02006/071563 披露了非致瘤性 MDCK 細胞，包括 “MDCK-S " (ATCCPTA-6500)，“MDCK-SF101”(ATCC PTA-6501)，“MDCK-SF 102，，(ATCC PTA-6502)和“MDCK-SF103" (PTA-6503)。W02005/113758披露了對感染高度敏感的MDCK細胞系，包括“MDCK. SF1”細胞(ATCC CRL-12042)。可使用任何這些MDCK細胞系。W097/37000,W097/3700Uff003/023021 和 W003/023025 描述了對懸液和貼壁培養基中MDCK細胞培養物的操作。具體地說，WO 03/023021和WO 03/023025描述了 MDCK懸
浮細胞在無血清培養基、化學成分確定的培養基和無蛋白培養基中的實驗室和商業規模細胞培養體積。各參考文獻全文納入本文。作為替代哺乳動物來源，本發明所用的細胞系可源自禽來源，例如雞、鴨、鵝、鶴鶉或野雞。禽細胞系可源自各種發育階段，包括胚胎、雛禽和成年。這些細胞系優選源自胚胎細胞，例如胚胎成纖維細胞、生殖細胞或單個器官，包括神經元、大腦、視網膜、腎臟、肝臟、心臟、肌肉或胚外組織和保護該胚胎的膜。禽細胞系的例子包括禽胚胎干細胞(W001/85938和TO03/076601)和鴨視網膜細胞(W02005/042728)。合適的禽胚胎干細胞包括源自雞胚胎干細胞的EBx細胞系、EB45、EB 14和EB 14-074 (W02006/108846)。還可利用雞胚胎成纖維細胞(CEF)。這些禽細胞特別適合于培養流感病毒。·本領域技術人員知道昆蟲細胞表達系統，例如桿狀病毒重組表達系統，這些系統描述于，例如Summers和Smith《德克薩斯農業實驗站第1555號公告》(Texas AgriculturalExperiment Station Bulletin, 1987,No. 1555)。桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統的材料和方法可以試劑盒的形式商業購自加利福尼亞州圣迭戈市的英杰公司(Invitrogen)等。桿狀病毒表達載體所用的昆蟲細胞包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、首宿銀紋夜蛾(Autographscalifornica)、家香(Bombyx mori)、黑腹果妮(Drosophila melanogaster)、草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉紋夜蛾(Trichoplusia ni),等等。重組表達蛋白質還可在諸如大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽胞桿菌(Bacillus stcbtilis)和鏈球菌(Streptococcus spp.)等細菌宿主中進行。適合于重組表達蛋白質的酵母菌宿主包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)、多形漢森酵母(Hansenula poIymorpha)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis)、季也蒙畢赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和耶羅維亞酵母(Yarrowia Iipolytica)。各種出版物充分描述了上述細胞類型的培養條件，或者可以商業購得培養基、添加劑和條件，例如新澤西州東魯瑟福得市開姆布萊克斯生物產品公司(CambrexBioproducts, East Rutherford, NJ)的目錄和其它文獻。在某些實施方式中，將本文所述方法所用的宿主細胞培養在無血清和/或無蛋白質的培養基中。本發明將其中不含人或動物來源的血清添加劑的培養基稱為無血清培養基。無蛋白質應理解為表示發生細胞增殖的培養基中不含蛋白質、生長因子、其它蛋白質添加劑和非血清蛋白質，但可任選包含病毒生長所需的蛋白質，例如胰蛋白酶或其它蛋白酶。在這種培養基中生長的細胞自身可天然含有蛋白質。已知的無血清培養基包括Iscove培養基、Ultra-CHO培養基(拜維塔克公司(BioWhittaker))或EX-CELL (JRH生物科學公司(JRH Bioscience))。常規含血清培養基包括Eagle基本培養基(BME)或極限必需培養基(MEM) (Eagle, Science，130，432 (1959))或Dulbecco改進的Eagle培養基(DMEM或EDM)，一般使用最多10%的胎牛血清或類似的添加劑。極限必需培養基(MEM) (Eagle, Science, 1959,130 :432)或Dulbecco改進的Eagle培養基(DMEM或EDM)可任選不使用任何含血清的添加劑。現有技術也熟知無蛋白質的培養基，例如PF-CHO(JHR生物科學公司，JHR Bioscience)，化學成分確定的培養基，例如ProCHO 4CDM(拜維塔克公司)或SMIF 7(吉比克/BRL生命技術公司，Gibco/BRL LifeTechnologies)和促有絲分裂妝，例如Primactone, Pepticase或I-IyPepTM(均購自國際探索公司，Quest International)或乳清蛋白水解物(吉比克公司Gibco和其它生產商)。基于植物水解物的培養基添加劑的特別優點在于能排除病毒、支原體或未知感染因子的污染。由于本發明所用細胞系的適用性，細胞培養條件(溫度、細胞密度、pH值等)可在很大范圍內變動，可改進這些條件使之適應具體病毒生長條件或重組表達細節的要求。宿主DNA殘留量及檢測本領域普通技術人員能檢測殘留的宿主細胞DNA。本發明蛋白制品中殘留DNA的 總量優選低于 20ng/ml,例如< 10ng/ml、i^ 5ng/ml、< lng/ml>^ 100pg/ml>^ lOpg/ml,等
坐寸ο用于檢測DNA的試驗通常是確認試驗(“工業指南生物分析方法確認”(Guidancefor Industry Bioanalytical Method Validation),美國健康和人服務部食品藥品管理中心獸藥評估和研究(CDER)中心(C VM) (U. S. Department of Health and Human ServicesFood and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research(CDER)Center for Veterinary Medicine (CVM)). 2001 年 5 月；Lundblad(2001)Biotechnologyand Applied Biochemistry 34 :195-197)。可利用數學和可定量的術語描述確認試驗的性能特征，已鑒定了其可能的誤差來源。已總體上檢驗了該試驗的諸如準確度、精密度、特異性等特征。一旦校驗(例如，用宿主細胞DNA的已知標準量)及檢驗好某試驗，可常規進行定量DNA檢測。可采用三種主要的DNA定量技術雜交方法，例如Sourthern印跡或槽印跡(Ji 等，Biotechniques, 2002, 32 =1162-7);免疫測定方法，例如 ThresholdTM 系統(Briggs, J Parenter SciTechnol. 1991,45 :7_12)和定量PCR(Lahi jani,Hum Gene Ther. 1998，9 :1173-80)。技術人員熟知這些方法，雖然各方法的精確特征取決于所研究的宿主細胞，例如雜交探針的選擇，擴增用引物和/或探針的選擇，等等。下面將結合實施例進一步詳細描述本發明。應當理解，列舉這些實施例只是為了起說明作用，而并不是用來限制本發明的范圍。除非特別說明，本發明所用到的試劑、培養基均為市售商品。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規實驗條件進行，例如Sambrook等人在《分子克隆實驗室手冊》(NewYork Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實施例I.電泳槽結構I. 一種分隔的兩腔電泳槽參見圖1，該電泳槽包括槽體I、陽極2、陰極3、陽極區域4、中間區域5和瓊脂糖凝膠分隔7 ；電泳區域由被瓊脂糖凝膠分隔7分隔的兩個區域組成，分別為陽極區域4和中間區域5，陽極2和陰極3分別位于這兩個區域中。2. 一種分隔的帶選擇性核酸分離部件的兩腔電泳槽參見圖2，該電泳槽包括槽體I、陽極2、陰極3、陽極區域4、中間區域5、瓊脂糖凝膠分隔7和選擇性核酸分離部件10 ；電泳區域由被瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠分隔7分隔的兩個區域組成，分別為陽極區域4和中間區域5，陽極2和陰極3分別位于這兩個區域中；選擇性核酸分離部件10位于陽極區域和中間區域之間。3. 一種分隔的三腔電泳槽參見圖3，該電泳槽包括槽體I、陽極2、陰極3、陽極區域4、中間區域5、陰極區域6和瓊脂糖凝膠分隔7 ;電泳區域由被瓊脂糖凝膠分隔7分隔的三個區域組成，分別為陽極區域4、中間區域5和陰極區域6，陽極2和陰極3分別位于兩端的陽極區域4和陰極區域6中。4. 一種分隔的帶選擇性核酸分離部件的三腔電泳槽參見圖4，該電泳槽包括槽體I、陽極2、陰極3、陽極區域4、中間區域5、陰極區域6、瓊脂糖凝膠分隔7和選擇性核酸分離部件10 ；電泳區域由被瓊脂糖凝膠分隔7分隔的三 個區域組成，分別為陽極區域4、中間區域5和陰極區域6，陽極2和陰極3分別位于兩端的陽極區域4和陰極區域6中；選擇性核酸分離部件10位于陽極區域和中間區域之間。5. 一種分離的兩腔電泳槽示意圖參見圖5，該電泳槽包括槽體I、陽極2、陰極3、陽極區域4、中間區域5、閥門8和連接通道9 ;電泳區域包括兩個獨立的區域，分別為陽極區域4和中間區域5，它們由電泳通道9連接，陽極2和陰極3分別位于陽極區域4和中間區域5中；電泳通道9帶有閥門8。6. 一種分離的帶選擇性核酸分離部件的兩腔電泳槽參見圖6，該電泳槽包括槽體I、陽極2、陰極3、陽極區域4、中間區域5、閥門8、連接通道9和選擇性核酸分離部件10 ;電泳區域包括兩個獨立的區域，分別為陽極區域4和中間區域5，它們由電泳通道9連接，陽極2和陰極3分別位于陽極區域4和中間區域5中；電泳通道9帶有閥門8 ;選擇性核酸分離部件10位于陽極區域和中間區域之間。7. 一種分離的三腔電泳槽參見圖7，該電泳槽包括槽體I、陽極2、陰極3、陽極區域4、中間區域5、陰極區域
6、閥門8和連接通道9 ；電泳區域包括三個獨立的區域，分別為陽極區域4、中間區域5和陰極區域6，它們由電泳通道9連接，陽極2和陰極3分別位于陽極區域4和陰極區域6中；電泳通道9帶有閥門8。8. 一種分離的帶選擇性核酸分離部件的三腔電泳槽參見圖8，該電泳槽包括槽體I、陽極2、陰極3、陽極區域4、中間區域5、陰極區域
6、閥門8、連接通道9和選擇性核酸分離部件10 ;電泳區域包括三個獨立的區域，分別為陽極區域4、中間區域5和陰極區域6，它們由電泳通道9連接，陽極2和陰極3分別位于陽極區域4和陰極區域6中；電泳通道9帶有閥門8 ;選擇性核酸分離部件10位于陽極區域和中間區域之間。實施例2.核酸濃縮用圖I所示的由瓊脂糖凝膠分隔的兩腔式電泳槽濃縮溶液中的核酸成分。該電泳槽陽極區域容積為20mL，中間區域容積為200mL，瓊脂糖膠條的寬度為1cm，頂面超過電泳緩沖液的液面高度O. 5cm，在電泳槽的陽極區域和中間區域之間形成分隔。I、取20ug純化的pGL3 (Promega)質粒，溶解于200mL O. 5XTBE,質粒終濃度為100ng/mL ；
2、將200mL質粒溶液緩慢加入到電泳槽的中間區域中，在電泳槽的陽極區域中加入 20mL0. 5 X TBE ；3、如圖I所示連接電源電極，在40V恒壓條件下電泳20分鐘后，停止電泳；5、收集電泳槽陽極區域中的溶液，進行乙醇沉淀，用30uL去離子水溶解沉淀，檢測質粒的純度并進行定量，計算回收率；6、A260/280 為 I. 97，回收率為 95%。實驗結果表明，本發明提供的核酸分離方法能夠簡便、高效、高質量地濃縮樣本中的核酸分子。實施例3.基于選擇性核酸分離部件的核酸濃縮用圖2所示的由瓊脂糖凝膠分隔的帶選擇性核酸分離部件的兩腔式電泳槽濃縮·溶液中的核酸成分。該電泳槽陽極區域容積為20mL，中間區域容積為200mL，瓊脂糖膠條的寬度為1cm，頂面超過電泳緩沖液的液面高度O. 5cm，在電泳槽的陽極區域和中間區域之間形成分隔。選擇性核酸分離部件為活化的DEAE纖維素膜，位于陽極區域和中間區域之間核酸轉移通道中。I、DEAE纖維素膜活化切一塊與電泳區域截面大小合適的DEAE纖維素膜(Schleicher& Schuell, NA-45)，在 IOmmoI/LEDTA(pH 8. O)條件下，室溫浸泡 5 分鐘；隨后用O. 5mol/L NaOH取代EDTA浸泡以活化DEAE纖維素膜，室溫浸泡5分鐘，然后用無菌水沖洗6次；2、將活化的DEAE纖維素膜固定于電泳槽中，位于瓊脂糖凝膠的陽極一側；3、取20ug純化的pGL3 (Promega)質粒，溶解于200mL O. 5XTBE,質粒終濃度為100ng/mL ；4、將200mL質粒溶液緩慢加入到電泳槽的中間區域中，在電泳槽的陽極區域中加入 20mL0. 5 X TBE ；5、如圖2所示連接電源電極，在40V恒壓條件下電泳20分鐘后，停止電泳；6、取出DEAE纖維素膜，室溫下，用IOmL DEAE低鹽緩沖液(50mmol/L Tris-Cl，pH8. O ；lmol/LNaCl ；10mmol/L EDTA, pH 8. 0)漂洗一次；7、將膜轉移到合適的容器中，加足量的DEAE高鹽緩沖液(50mmol/L Tris-Cl, pH8. O ；0. 15mol/L NaCl ；10mmol/L EDTA，pH 8. 0)使膜完全被浸泡，于 65°C條件下溫育 30 分鐘；8、將步驟7中的DEAE高鹽緩沖液轉移到另一容器中，再加入足量的DEAE高鹽緩沖液(50mmol/L Tris-Cl, pH 8. O ；0. 15mol/L NaCl ；10mmol/L EDTA, pH 8.0)使膜完全被浸泡，于65 °C條件下溫育15分鐘；9、合并兩份DEAE高鹽緩沖液，用酚/氯仿抽提一次；將水相轉入一離心管中；力口入O. 2倍體積的lOmol/L乙酸銨，2倍體積4°C乙醇，室溫放置10分鐘；用微量離心機以最大轉速離心10分鐘；用70%乙醇小心洗滌沉淀后，室溫靜置，使乙醇揮發，將DNA重溶于30uL去離子水中，檢測回收的質粒的純度并進行定量，計算回收率；6、核酸的回收率為93%。實驗結果表明，本發明提供的方法能夠簡便、高效、高質量地濃縮樣本中的核酸分子。
實施例4.核酸與蛋白的分離用圖5所示的分離式的兩腔電泳槽從核酸蛋白混合液中分離核酸及蛋白分子。該電泳槽陽極區域容積為20mL，中間區域容積為200mL，連接陽極區域和中間區域的電泳通道中裝有一個閥門。I、核酸蛋白混合物取IOug純化的pGL3 (Promega)質粒和IOmg牛血清白蛋白(Sigma)，溶解于200mL O. 5XTBE，質粒終濃度為50ng/mL，蛋白的終濃度為50ug/mL ；2、關閉電泳通道中的閥門，將200mL核酸蛋白溶液加入到電泳槽的中間區域中，在電泳槽的陽極區域中加入20mL O. 5XTBE ；3、如圖5所示連接電源電極，打開閥門，在40V恒壓條件下電泳20分鐘后，停止電泳；5、收集電泳槽陽極區域中的溶液，用Bradford法分別測定陽極區域和中間區域 溶液中的蛋白含量；對收集的陽極區域溶液進行乙醇沉淀，用15uL去離子水溶解沉淀并進行定量，計算回收率；6、質粒DNA的回收率為97% ;陽極區域蛋白濃度為2ug/mL，中間區域蛋白濃度為47ug/mL。實驗結果表明，本發明提供的分離式電泳槽能夠簡便、高效、高質量地從核酸蛋白混合物中分離核酸與蛋白分子。實施例5.基于選擇性核酸分離部件的核酸分離用圖2所示的由瓊脂糖凝膠分隔的帶選擇性核酸分離部件的兩腔式電泳槽濃縮溶液中的核酸成分。該電泳槽陽極區域容積為20mL，中間區域容積為200mL，瓊脂糖膠條的寬度為1cm，頂面超過電泳緩沖液的液面高度O. 5cm，在電泳槽的陽極區域和中間區域之間形成分隔。選擇性核酸分離部件為美國聯合碳化物公司(Union Carbide)的透析膜，位于陽極區域和中間區域之間核酸轉移通道中。I、透析膜預處理裁剪與電泳區域截面大小合適的透析膜，浸在蒸餾水中15分鐘，使其軟化；浸入IOmM碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)中，加熱至80°C,攪拌30分鐘以上；換到IOmM Na2 · EDTA中浸泡30分鐘，以新鮮的EDTA同樣處理三次；再用80°C蒸餾水洗30分鐘，然后換到20%酒精中，置于4°C冰箱中保存；2、將經過預處理的透析膜固定于電泳槽中，位于瓊脂糖凝膠的陽極一側；3、核酸蛋白混合物取IOug純化的pGL3 (Promega)質粒和IOmg牛血清白蛋白(Sigma)，溶解于200mL O. 5XTBE，質粒終濃度為50ng/mL，蛋白的終濃度為50ug/mL ；4、將核酸/蛋白質粒溶液緩慢加入到電泳槽的中間區域中，在電泳槽的陽極區域中加入 20mL O. 5 X TBE ；5、如圖2所示連接電源電極，在40V恒壓條件下電泳20分鐘后，停止電泳；6、小心取出透析膜，放入2mLTE緩沖液中，用吸管反復吹打透析膜，使附著于膜上的DNA脫落；7、用Bradford法測定溶液中的蛋白含量；8、將收集的DNA溶液用酚/氯仿抽提一次；將水相轉入一離心管中；加入0. 2倍體積的lOmol/L乙酸銨，2倍體積4°C乙醇，室溫放置10分鐘；用微量離心機以最大轉速離心10分鐘；用70%乙醇小心洗滌沉淀后，室溫靜置，使乙醇揮發，將DNA重溶于30uL去離子水中，檢測回收核酸的純度并進行定量，計算回收率；8、核酸回收率為96%，在DEAE纖維素膜洗滌液中未檢測到蛋白。實驗結果表明，本發明提供的方法能夠簡便、高效、高質量地濃縮樣本中的核酸分子。實施例6.宿主細胞核酸殘留的去除用圖I所示的由瓊脂糖凝膠分隔的兩腔式電泳槽去除疫苗粗提物中的宿主核酸成分。該電泳槽陽極區域容積為20mL，中間區域容積為200mL，瓊脂糖膠條的寬度為1cm，頂面超過電泳緩沖液的液面高度O. 5cm，在電泳槽的陽極區域和中間區域之間形成分隔。I、疫苗粗提物制備按照W097/37000、W003/23025和W004/92360的指導，將流感病毒(A/New Caledonian/20/99 (HlNl)、A/Panama/2007/99 (H3N2)、B/Jiangsu/10/2003、A/ Wyoming/3/2003 (H3N2))培養在懸浮培養的MDCK細胞中。使最終的培養基澄清以提供病毒顆粒,然后進行層析和超濾/滲濾。利用丙內酯(終濃度O. 05% v/v ;2-8°C孵育16-20小時，然后在37°C孵育2-2. 5小時進行水解)滅活得到的物質中的病毒顆粒。隨后用CTAB裂解病毒顆粒及其它加工步驟，獲得含有純化的表面蛋白的單價病毒疫苗的粗提物；2、用羅氏應用科學部(Roche Applied Science)提供的“高效DNA地高辛標記和檢測試劑盒 II (DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II)，，檢測疫苗粗提物中宿主核酸的濃度；3、取180mL疫苗粗提物，加入20mL 5XTBE儲存液，混勻后緩慢加入到電泳槽的中間區域中，在電泳槽的陽極區域中加入20mL O. 5XTBE ；4、如圖I所示連接電源電極，在40V恒壓條件下電泳20分鐘后，停止電泳；5、用羅氏應用科學部(Roche Applied Science)提供的“高效DNA地高辛標記和檢測試劑盒 II (DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II)，，檢測中間區域疫苗溶液中宿主核酸的濃度，計算純化效率；6、疫苗粗提物中宿主核酸的濃度為10. 3ng/mL，去除后的宿主核酸殘留濃度為21. 2pg/mL,純化效率為485倍。實驗結果表明，本發明提供的方法能夠簡便、高效地去除疫苗制品中的宿主細胞核酸殘留。實施例7.宿主細胞殘留核酸去除用圖I所示的由瓊脂糖凝膠分隔的兩腔式電泳槽去除疫苗粗提物中的宿主核酸成分。該電泳槽陽極區域容積為20mL，中間區域容積為200mL，瓊脂糖膠條的寬度為1cm，頂面超過電泳緩沖液的液面高度O. 5cm，在電泳槽的陽極區域和中間區域之間形成分隔。I、疫苗粗提物制備按照W097/37000、W003/23025和W004/92360的指導，將流感病毒(A/New Caledonian/20/99 (HlNl)、A/Panama/2007/99 (H3N2)、B/Jiangsu/10/2003、A/Wyoming/3/2003 (H3N2))培養在懸浮培養的MDCK細胞中。使最終的培養基澄清以提供病毒顆粒,然后進行層析和超濾/滲濾。利用丙內酯(終濃度O. 05% v/v ;2-8°C孵育16-20小時，然后在37°C孵育2-2. 5小時進行水解)滅活得到的物質中的病毒顆粒。隨后用CTAB裂解病毒顆粒及其它加工步驟，獲得含有純化的表面蛋白的單價病毒疫苗的粗提物；2、用羅氏應用科學部(Roche Applied Science)提供的“高效DNA地高辛標記和檢測試劑盒 II (DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II)，，檢測疫苗粗提物中宿主核酸的濃度；3、取180mL疫苗粗提物，加入20mL 5 X TBE儲存液，混勻后室溫靜置40分鐘；4、用Φ變幅桿的Scientz-IID型超聲波細胞粉碎機對疫苗溶液進行超聲處理，在水浴保護下進行超聲，保證疫苗溶液溫度不超過26°C，設置功率為600W，工作時間2秒，間歇時間3秒，總工作時間20分鐘(240次)；5、將經過超聲處理的疫苗溶液緩慢加入到電泳槽的中間區域中，在電泳槽的陽極區域中加入20mL0. 5 X TBE ；6、如圖I所示連接電源電極，在40V恒壓條件下電泳20分鐘后，停止電泳；5、用羅氏應用科學部(Roche Applied Science)提供的“高效DNA地高辛標記和檢測試劑盒 II (DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II)，，檢測中間區域疫苗溶液中宿主核酸的濃度，計算去除后疫苗溶液中的核酸濃度；·6、疫苗粗提物中宿主核酸的濃度為10. 3ng/mL，去除后的宿主核酸殘留濃度為
10.7pg/mL,純化效率為962倍。實驗結果表明，本發明提供的方法能夠簡便、高效地去除疫苗制品中的宿主細胞核酸殘留。實施例8.基于選擇性核酸分離部件的宿主細胞殘留核酸定量用圖2所示的由瓊脂糖凝膠分隔的帶選擇性核酸分離部件的兩腔式電泳槽濃縮溶液中的核酸成分。該電泳槽陽極區域容積為20mL，中間區域容積為200mL，瓊脂糖膠條的寬度為1cm，頂面超過電泳緩沖液的液面高度O. 5cm，在電泳槽的陽極區域和中間區域之間形成分隔。選擇性核酸分離部件為活化的DEAE纖維素膜，位于陽極區域和中間區域之間核酸轉移通道中。I、DEAE纖維素膜活化切一塊與電泳區域截面大小合適的DEAE纖維素膜(Schleicher & Schuell, NA-45)，在 IOmmoI/L EDTA(pH 8. O)條件下，室溫浸泡 5 分鐘；隨后用O. 5mol/L NaOH取代EDTA浸泡以活化DEAE纖維素膜，室溫浸泡5分鐘，然后用無菌水沖洗6次；2、將活化的DEAE纖維素膜固定于電泳槽中，位于瓊脂糖凝膠的陽極一側；3、取180mL制備的疫苗粗提物，加入20mL 5 X TBE儲存液，混勻；4、將200mL疫苗溶液緩慢加入到電泳槽的中間區域中，在電泳槽的陽極區域中加入 20mL0. 5 X TBE ；5、如圖2所示連接電源電極，在40V恒壓條件下電泳20分鐘后，停止電泳；6、取出DEAE纖維素膜，室溫下，用IOmL DEAE低鹽緩沖液(50mmol/L Tris-Cl,pH8. O ；lmol/LNaCl ；10mmol/L EDTA, pH 8. 0)漂洗一次；7、將膜轉移到合適的容器中，加足量的DEAE高鹽緩沖液(50mmol/L Tris-Cl, pH
8.O ；0. 15mol/L NaCl ；10mmol/L EDTA，pH 8. 0)使膜完全被浸泡，于 65°C條件下溫育 30 分鐘；8、將步驟7中的DEAE高鹽緩沖液轉移到另一容器中，再加入足量的DEAE高鹽緩沖液(50mmol/L Tris-Cl, pH 8. O ；0. 15mol/L NaCl ；10mmol/L EDTA, pH 8.0)使膜完全被浸泡，于65°C條件下溫育15分鐘；合并兩份DEAE高鹽緩沖液；9、將收集的DEAE高鹽溶液用酚/氯仿抽提一次；將水相轉入一離心管中；加入O.2倍體積的lOmol/L乙酸銨，2倍體積4°C乙醇，室溫放置10分鐘；用微量離心機以最大轉速離心10分鐘；用70%乙醇小心洗滌沉淀后，室溫靜置，使乙醇揮發，將DNA重溶于30uL去離子水中進行分光光度計定量，計算粗提物中核酸的含量；
10、計算得到疫苗粗提物中宿主核酸的含量為lL 294ng/mL。
權利要求
1.一種核酸分離方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)獲得一種電泳槽，該電泳槽包括至少兩個固定分隔的或可操作性分隔的電泳區域，在不影響大分子正常電泳行為的情況下，這些分隔使不同電泳區域內的溶液能夠被單獨收集；2)將包含待分離核酸的溶液加入到電泳槽中，3)施加外加電場，使溶液中的核酸分子選擇性地分布于一個被分隔的或被可操作性分隔的電泳區域，從而得到分離。
2.根據權利要求I所述的核酸分離方法，其特征在于用于固定分隔不同電泳區域的材料包括瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、帶孔或微孔的固相支持物。
3.根據權利要求I所述的核酸分離方法，其特征在于用于可操作性分隔不同電泳區域的方式包括閥門、開關、可阻斷性流道。
4.根據權利要求1-3任一項所述的核酸分離方法，其特征在于所述電泳槽還包括選擇性核酸分離部件。
5.根據權利要求4所述的核酸分離方法，其特征在于所述選擇性擇性核酸分離部件包括DEAE纖維素膜、透析膜、半透膜或濾膜。
6.根據權利要求I所述的核酸分離方法，其特征在于所述電泳槽包括兩個固定分隔的或可操作性分隔的電泳區域，在不影響大分子正常電泳行為的情況下，這些分隔使不同電泳區域內的溶液能夠被單獨收集。
7.根據權利要求6所述的核酸分離方法，其特征在于所述電泳槽包括槽體、陽極、陰極和電泳區域；電泳區域由固定分隔或可操作性分隔隔開的兩個區域組成，陽極和陰極分別位于這兩個區域中。
8.根據權利要求6所述的核酸分離方法，其特征在于所述電泳槽包括槽體、陽極、陰極和電泳區域；電泳區域包括兩個獨立的區域，所述獨立的區域經電泳通道連接，電泳通道中帶有固定分隔或可操作性分隔；陽極和陰極分別位于這兩個區域內。
9.根據權利要求I所述的核酸分離方法，其特征在于所述電泳槽包括三個固定分隔的或可操作性分隔的電泳區域，在不影響大分子正常電泳行為的情況下，這些分隔使不同電泳區域內的溶液能夠被單獨收集；陽極和陰極分別位于兩端的區域內。
10.權利要求6或9所述的核酸分離方法，其特征在于所述電泳槽還包括選擇性核酸分離部件。
全文摘要
本發明提供了一種核酸的分離方法，具體來講是根據核酸分子在溶液中的電荷性質，使其在電場中得到選擇性分離的方法；進一步的，本發明提供了用于該方法的分離裝置、以及該方法及裝置在核酸分離中的應用。
文檔編號C07H21/00GK102836423SQ20111016514
公開日2012年12月26日 申請日期2011年6月20日 優先權日2011年6月20日
發明者杜權, 杜軍 申請人:杜權, 杜軍