專利名稱：一種環四肽化合物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于藥物化學領域，涉及一種環四肽化合物及其制備方法與用途。 癌癥是當前危害人類健康的主要疾病之一，我國已上市(或仍在研制階段)的一系列抗腫瘤藥(含人體免疫劑)大多數為天然草藥中提取的成分。陸地資源的不斷開發，發現新的代謝物的可能性日趨減少，資源豐富的海洋成為研究熱點。海洋覆蓋著地球表面積的71%，是生命的發源地，其生物多樣性遠遠超過陸地生物的多樣性。海洋環境條件惡劣， 具有高鹽、高壓、低溫、低照、寡營養等特點，由于其生態環境的特殊性，決定了深海微生物具有一些特異的代謝途徑和遺傳背景，導致深海微生物次生代謝產物具有化學結構奇特、 新穎，生物活性多樣等特點(UKosta S, Jain R, and Tiwari A. Marine Fungi =Potential
Source of Pharmacological Compounds[J]. Pharmacologyonline, 2008,1(1) :1_3·)。特
殊結構化合物對發現藥物先導化合物、研究藥物作用新靶點、新機理等具有重要科學意義。然而，環境中采用現有培養技術能夠培養的微生物不到1%，宏基因組文庫既包含了可培養的又包含了未可培養的微生物基因，避開了微生物分離培養的問題，極大地擴展了微生物資源的利用空間，增加了獲得新的生物活性物質的機會(2、Venter JC, Remington
K, Heidelberg JF et al. (2004)Environmental genome shotgun sequencing of the
Sargasso Sea [J] Science 304:66-74.)。隨著宏基因組學技術和色譜技術的發展和完善， 在不久的將來第一個宏基因組藥物必將推向市場。
發明內容
本發明的第一目的在于提供一種環四肽化合物。本發明的第二目的在于提供一種環四肽化合物的制備方法。本發明的第三目的在于提供一種環四肽化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。所述一種環四肽化合物命名為CFP，分子式為C29H36N4O6，相對分子質量為536，結構式為所述一種環四肽化合物的制備方法包括以下步驟1)大腸桿菌25E4接種至培養基中進行發酵，收集發酵后的發酵液；所述大腸桿菌25E4Escherichia coli 25E4)于2010年11月30日保藏于中國典型培養物保藏中心
背景技術：
(CCTCC)，保藏中心保藏編號為CCTCC NO =M 2010325，保藏地址為中國.武漢.武漢大學；2)將發酵液加入大孔吸附樹脂，水洗除去雜質，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫部分，回收乙醇即得浸膏；3)將步驟2)所得浸膏進行硅膠柱層析，以氯仿洗脫，在氯仿中添加甲醇，進行硅膠薄層層析檢測流分，收集得到15個組分；將第8組分進行ODS柱層析，以甲醇和水作為流動相，10%甲醇至100%甲醇梯度洗脫，獲得13個組分并收集第4組分；4)將第4組分加至ODS制備柱，進行液相色譜制備，收集10. 2min主峰，濃縮，干燥，即得CFP。在步驟1)中，所述培養基可為LB培養基，所述發酵的條件為溫度37°C，培養時間10 36h。在步驟3)中，所述氯仿與甲醇的體積比可為5 1。在步驟4)中，所述液相色譜制備可采用Varian型液相色譜儀，二極管陣列檢測器的檢測波長可為2^nm，色譜柱島津C18 20 X 250mm，流動相40%甲醇，流速可為IOml/
mirio本發明利用從深海中提取的微生物進行發酵，分離純化獲得了一種環四肽化合物，并命名為CFP。CFP結構獨特，具有很強的抗腫瘤活性，可顯著地抑制鼻咽癌CNE2細胞、 人纖維肉瘤HT1080細胞和人肺癌A549細胞的生長，具有開發為抗腫瘤藥物的潛能，在制備抗腫瘤藥物上具有廣泛的應用。
具體實施例方式實施例1克隆子的篩選1)深海沉積物樣品DNA提取取出4°C保存的采集于東太平洋527 !深海的沉積物樣品I0g，于人工海水放線菌富集培養基進行富集培養；2)深海沉積物富集樣品DNA提取往深海沉積物富集樣品中加入DNA提取緩沖液，使細胞裂解，提取DNA并純化；3)深海沉積物宏基因組文庫的構建所用質粒載體為pTOB cosmid，插入片段 30 401Λ，宿主是大腸桿菌(Escherichia coli)，獲得約3500個克隆子，其中編號為25E4 的克隆子LB發酵液的乙酸乙酯粗提物在100ug/ml濃度下對HT1080、CNE2、A549腫瘤細胞具有良好細胞毒活性，分別為82. 35%,89. 12%,86. 51%04)將包含克隆子 25E4 的大腸桿菌 25E4(Escherichia coli 25E4)于 2010 年 11月30日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏中心保藏編號為CCTCC NO =M 2010325。實施例2CFP的制備1、包含克隆子25E4的大腸桿菌25E4發酵大腸桿菌25E4接種至3ml培養基，37°C、200rpm培養10h。將初級培養物取Iml 接種至500ml培養基，37°C、200rpm培養20h后，接種至100L發酵罐，37°C、60L/min通入空氣，200rpm，200rpm，pH7. 0發酵36h，利用連續流離心機分別收集菌體和菌液。2、發酵液提取70L發酵液上大孔樹脂(AB-8，10L)吸附，30L水洗至流出液體澄清，用30L 30%乙醇洗脫，收集30%乙醇洗脫部分，回收30%乙醇得浸膏18g ；3、CFP的分離與純化1)將步驟2所得浸膏進行硅膠柱層析，采用干法上樣，以氯仿洗脫，逐步在氯仿中添加甲醇直至氯仿與甲醇體積比為5 1，硅膠薄層層析檢測流分，收集得到15個組分；2)根據薄層分析，收集氯仿-甲醇10 1洗脫物第8組分進行ODS柱層析，樣重 0. 522g，采用干法上樣，以甲醇和水做為流動相，10%甲醇至100%甲醇梯度洗脫，反向薄層層析監測，收集13個組分。分析反向薄層板，第4組分分離效果良好且量較多，故選定其進行純化；3)第4組分上ODS制備柱進行高效液相色譜(HPLC)制備，儀器為Varian型液相色譜儀，二極管陣列檢測器的檢測波長228nm，色譜柱島津C1820 X 250mm，流動相40%甲醇，流速10ml/min,收集10. 2min主峰，濃縮，干燥，即得CFP。4、CFP 的鑒定通過波譜和理化性質鑒定化合物，確定所得化合物為新的環四肽化合物，命名為 CFP。其結構式如下
權利要求
1. 一種環四肽化合物，其特征在于其命名為CFP，分子式為C29H36N4O6，相對分子質量為 536，結構式為
2.如權利要求1所述的一種環四肽化合物的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)大腸桿菌25E4接種至培養基中進行發酵，收集發酵后的發酵液；所述大腸桿菌25E4 于2010年11月30日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏中心保藏編號為CCTCC NO =M 2010325 2)將發酵液加入大孔吸附樹脂，水洗除去雜質，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫部分，回收乙醇即得浸膏；3)將步驟幻所得浸膏進行硅膠柱層析，以氯仿洗脫，在氯仿中添加甲醇，進行硅膠薄層層析檢測流分，收集得到15個組分；將第8組分進行ODS柱層析，以甲醇和水作為流動相，10%甲醇至100%甲醇梯度洗脫，獲得13個組分并收集第4組分；4)將第4組分加至ODS制備柱，進行液相色譜制備，收集10.2min主峰，濃縮，干燥，即得環四肽化合物。
3.如權利要求2所述的一種環四肽化合物的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述培養基為LB培養基。
4.如權利要求2所述的一種環四肽化合物的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述發酵的條件為溫度37°C，培養時間10 36h。
5.如權利要求2所述的一種環四肽化合物的制備方法，其特征在于在步驟；3)中，所述氯仿與甲醇的體積比為5 1。
6.如權利要求2所述的一種環四肽化合物的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述液相色譜制備采用Varian型液相色譜儀，二極管陣列檢測器的檢測波長為228nm，色譜柱 島津C18 20 X 250mm，流動相:40%甲醇，流速為10ml/min。
7.如權利要求1所述的一種環四肽化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
一種環四肽化合物及其制備方法和用途。屬于藥物化學領域，提供一種環四肽化合物及其制備方法和用途。環四肽化合物命名為CFP，分子式為C29H36N4O6，相對分子質量為536。制備方法包括大腸桿菌25E4接種至培養基中進行發酵，收集發酵后的發酵液，分離純化發酵液即得CFP。CFP結構獨特，具有很強的抗腫瘤活性，可顯著地抑制鼻咽癌CNE2細胞、人纖維肉瘤HT1080細胞和人肝癌Bel-7402細胞的生長，具有開發為抗腫瘤藥物的潛能，在制備抗腫瘤藥物上具有廣泛的應用。
文檔編號C07K5/12GK102286071SQ201110157069
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月13日 優先權日2011年6月13日
發明者丘鷹昆, 吳振, 易志偉, 湯熙翔, 肖湘, 蔡振世, 陳春曉 申請人:廈門大學, 國家海洋局第三海洋研究所