專利名稱：一種大孔樹脂制備高純度冠菌酸的方法
技術領域：
本發明屬于生物化工領域，具體涉及一種利用大孔樹脂從發酵液中提取冠菌酸的方法，該方法適合從大量發酵液中提取冠菌酸。
背景技術：
冠菌酸(coronafacic acid, CFA)是植物生長調節物質冠菌素(coronatine，C0R) 合成的一個前體聚酮化合物，是茉莉酸(Jasmonic Acid JA)的結構類似物。冠菌酸在很多作物上能夠引起與JA和COR類似的效果，研究表明20nmol的COR能夠引起中等到重度的番茄葉片黃萎病，而冠菌酸和Me-JA沒有引起失綠病斑的產生。在誘導擬南芥、番茄花青素積累和抑制根伸長的實驗中表明，COR的效果更顯著于Me-JA，而冠菌酸的作用效果介于COR 與Me-JA之間。通過研究COR及其前體物質冠菌酸和CMA的作用反應基因來進一步確定各種物質的作用機理，Srinivasa等^00 利用cDNA芯片技術研究番茄葉片在各種化合物處理后各個時間段的基因表達情況進行了比較，實驗結果用Verm圖顯示C0R、冠菌酸與冠烷酸(coronamic acid, CMA)誘導了不同數量基因表達的上調與下降。從這些結果顯示出冠菌酸與COR有功能更大程度的重疊作用，但是COR較冠菌酸誘導更多基因的表達。同時研究表明冠菌酸在有些作用方面與COR有類似的效果，有些效果略低于COR的誘導效果，同時也有一些顯著低于COR誘導效果的作用。隨著研究的深入，特別是JA作用受體的發現，更多研究者開始重新關注冠菌酸的作用，包括冠菌酸的生理作用，以及它的作用形式和機理， 目前關于COR的作用研究已經取得了一定的進展，在研究其作用機理時又主要集中在冠菌酸與CMA的作用機理，到底COR的作用是由冠菌酸還是CMA起主導作用，研究的還不是很清楚，近來有研究報道冠菌酸起主導作用，但是冠菌酸具體的作用效果以及機理還缺乏研究， COR對35%的Me-JA誘導的基因有調控作用，而冠菌酸對39. 4%的COR調控基因有誘導效應，表明冠菌酸與COR重疊的誘導效果更顯著(Srinivasa等2005)。因此人們推測冠菌酸是COR主要起作用的基團，也有研究證明JA與冠菌酸有著相同的誘導效果，研究表明在誘導馬鈴薯塊莖形成，馬鈴薯塊莖細胞伸長以及大豆愈傷組織的生長和誘導燕麥葉片的衰老等作用中，冠菌酸和JA有相同的誘導效果，即相同濃度的冠菌酸與JA誘導效果相似。綜上所述，故大量研究需要進行進一步驗證冠菌酸的生理功能以及其作用形式， 其中涉及到冠菌酸在作物抵抗逆境脅迫中的大量生理作用，例如冠菌酸是否可以調控植物生長、抑制衰老、促進細胞分化、提高葉綠素含量和植物抗逆性等生理功能，這就需要大量冠菌酸樣品的獲得。如果冠菌酸可以代替COR來應用于植物逆境脅迫，則冠菌酸有望作為又一種新的植物生長調節物質被廣泛應用。因為發酵法獲得冠菌酸要比COR的獲得更容易，且發酵周期也明顯縮短，丁香假單胞菌發酵前期就有冠菌酸的合成，且產量遠大于C0R， 如果冠菌酸能夠代替COR應用于作物抗逆調控，不僅能夠節約能源，將低成本，同時，工業化生產冠菌酸將更能成為可能，因為冠菌酸的生物合成要比COR的合成更簡單，工業化生產的工程菌的獲得更為容易。近年來，集中研究冠菌酸作用機理的研究越來越多，但苦于缺乏冠菌酸樣品的獲得，不僅發酵合成冠菌酸產量較低，同時冠菌酸的分離純化工藝也較復雜，很難得到冠菌酸純品。大孔吸附樹脂是一類不含交換基團且有大孔結構的高分子吸附樹脂，具有良好的大孔網狀結構和較大的比表面積，可以通過物理吸附從水溶液中有選擇地吸附有機物，是 20世紀60年代發展起來的新型有機高聚物吸附劑，已在環保、食品、醫藥等領域得到了廣泛的應用。
發明內容
本發明的目的是提供一種分離純化冠菌酸的方法，該方法工藝簡單，收率高，可達 80%以上，純度90%以上，該方法生產成本低，對冠菌酸的結構和活性沒有任何影響，而且耗能低，污染小，完全適應工業化生產的要求。本發明所提供的提取冠菌酸的方法，包括如下步驟將含有冠菌酸的微生物發酵液的上清液過以大孔吸附樹脂為吸附劑的吸附柱進行吸附層析，洗脫得到冠菌酸；所述大孔吸附樹脂為非極性大孔樹脂，所述洗脫中采用的洗脫劑為能溶解冠菌酸的有機溶劑。所述大孔吸附樹脂具體可為HPD300、HZ818或YPRII。所述有機溶劑選自下述7種物質中的至少一種乙醇、乙醚、石油醚、正己烷、乙酸乙酯、95% (體積百分濃度)乙醇水溶液和丙酮。其中，所述含有冠菌酸的微生物發酵液的上清液的上柱吸附速度(就是吸附柱底部流出液的速度)為4升/小時-8升/小時。為了節省洗脫劑用量，所述洗脫的流速(吸附柱底部流出液的速度)可為3升/ 小時-5升/小時。所述含有冠菌酸的微生物發酵液的上清液的上柱量為具體可為3_200ml/g大孔吸附樹脂(如100ml/g)。所述含有冠菌酸的微生物發酵液的上清液可按照包括如下步驟的方法制備在液體培養基中發酵冠菌酸產生菌3-4天，收集發酵液中的上清液。所述方法在將含有冠菌酸的微生物發酵液的上清液過以大孔吸附樹脂為吸附劑的吸附柱前，還包括將所述上清液的PH值調至2-5. 5的步驟。所述吸附層析中包括收集第3個以上柱體積(如第3個柱體積、第3-4個柱體積、 第3-6個柱體積)的洗脫液，從所述洗脫液中得到冠菌酸的步驟。所述冠菌酸產生菌可包括以下幾種丁香假單胞菌絳紅致病變種(P. s. pv. atropurpruea)、丁香假單胞菌大豆致病變種(P. s. pv. glycinea)、丁香假單胞菌番茄致病變種(P. s. pv. tomato)、丁香假單胞菌李死致病變種(P. s. pv. morsprunorum)、丁香假單胞菌斑生致病變種(P. s.pv.maculicola)、丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(P. s. pv. actinidiae)、野油菜黃單胞菌棲新西蘭麻致病變種(X. c. pv. Phormiicola) (Palmer D A, Bender C L. Effects of environmental and nutritional factors on production of the polyketide phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv.glycinea. App1. Environ. Microbiol. 1993，59，1619—1626.)。其中的丁香假單胞菌大豆致病變種(P. s. pv. glycinea)具體可為保藏號為 CGMCC1412的丁香假單胞菌大豆致病變種，或為保藏號為CGMCC1276的丁香假單胞菌大豆致病變種，或為保藏編號為CGMCC No. 2533的丁香假單胞菌大豆致病變種(I^eudomonas syringae pv.glycinea)MW1230可用現有的培養丁香假單胞菌的液體培養基培養上述冠菌酸產生菌，如蔗糖15g， 氯化銨 1. Og, ΚΗ2Ρ044· lg, K2HP043. 6g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, KNO3O. 3g，2mMFeCl310ml，用蒸餾水定容至 1000ml, pH 7. 0o所述發酵中采用的溫度為適宜丁香假單胞菌生長的溫度，如18°C -23°C。所述含有冠菌酸的微生物發酵液的上清液，是將含有冠菌酸的微生物發酵液進行離心，得到的去除沉淀的液體。所述離心中，所采用的離心力可為3000_8000g，離心時間可為3_20分鐘。所述含有冠菌酸的微生物發酵液的上清液調節pH值為2-5. 5后進行上柱。本發明經過不斷優化小量制備冠菌酸標準樣品的技術，進而逐級放大，得到一種最優化的制備冠菌酸大量樣品的技術，從而為進一步大量研究冠菌酸生理功能提供基礎。 本發明方法采用的大孔吸附樹脂對冠菌酸的選擇性良好、吸附快、解析也快、吸附容量較大、生產周期短；且大孔樹脂物理化學穩定性高、機械強度好、再生容易；工藝簡單，操作十分簡便，一步即可達到分離目的，同時冠菌酸收率較高，純度較好，溶劑皆可回收利用，成本低廉，適用于工業化生產。
圖1為冠菌酸的HPLC法測定標準曲線圖2為實施例1的HPLC測定冠菌酸標樣(A)、冠菌酸粗提樣品(B)及純化后的冠菌酸樣品(C)
具體實施例方式本發明具體是利用大孔樹脂吸附層析的方法從發酵液中分離提取冠菌酸的方法， 其特征是將成熟發酵液離心棄沉淀，用上清液作流動相，經大孔樹脂柱分離，經優化的淋洗液洗脫，旋轉蒸發儀干燥，得到冠菌酸。具體工藝流程為⑴將發酵3-4天的含冠菌酸的成熟發酵液室溫條件下 3000-8000g,離心3-20分鐘，棄沉淀，收集上清液；(2)將上述所得上清液以4升/小時-8升/小時的速度流經大孔吸附樹脂；(3)用大量水沖洗至流出液無色后，改用有機溶劑洗脫冠菌酸，所用的洗脫劑為 3-6倍柱體積，洗脫液流量為3升/小時-5升/小時，所用的洗脫劑是乙醇、乙醚、石油醚、 正己烷、乙酸乙酯、丙酮、95% (體積百分濃度)乙醇水溶液，或者之中任意兩種或者三種的混合溶劑。(4)將洗脫液在真空度0. 07-0. 09MPA下減壓蒸發，收集冠菌酸，并回收溶劑。下述實施例中所用的非極性大孔吸附樹脂HPD300、HZ818或YPRII分別購自滄州寶恩吸附材料有限公司，上海華震科技有限公司，上海勁凱樹脂有限公司。實施例1、從微生物發酵液中提取冠菌酸1、發酵挑取冷凍保存的丁香假單胞菌大豆致病變種CGMCC MW1232533 (記載在中國專利200810119153. 2 中)于斜面培養基(配方為 2%蛋白胨，0. KH2PO4O. 05% NaCl 0. 1% MgSO4 · 7H20,1. 3%的瓊脂粉，溶劑為水；該培養基的pH 7. 0)上培養48_60h使其活化，然后挑取一環活化好的菌體，接入含有lOug/ml的卡那霉素和30ug/ml的鏈霉素的液體培養基(配方為2%蛋白胨，0. 1% KH2PO4O. 05% NaCl 0. 1 % MgSO4 ·7Η20 ；溶劑為水；該培養基的pH 7.0 ;121°C滅菌30min)中，28°C培養36-4 ,到對數期時，取培養菌液按5% (體積比)接種量接入發酵培養基(蔗糖15g，氯化銨1. Og, KH2P044. lg, K2HP043. 6g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，KNO3O. 3g, 2mM FeCl3IOml,用蒸餾水定容至1000ml。該培養基的pH 7.0)中，在溫度為18°C、轉速為260rpm的條件下發酵3天。2、純化取步驟1的發酵液5L在室溫條件下5000g離心5分鐘，收集上清液，調節pH值為 2。將50克HPD300大孔吸附樹脂用乙醇充分浸泡Mh，待樹脂充分溶脹后用蒸餾水洗滌至無乙醇，裝入吸附柱中，用3倍柱體積的3-5% (體積百分比)的鹽酸溶液以IOL/小時的速度通過柱子，并浸泡池，用水平衡至PH = 7.0;用3-5% (體積質量百分比)的NaOH溶液以IOL/小時的速度通過柱子，并浸泡池，用水平衡至pH = 7. O ；用蒸餾水浸泡樹脂備用。將上述所得上清液5L加入吸附柱中吸附速率(吸附柱底部流出液的速度)為4 升/小時；吸附完畢后用蒸餾水沖洗吸附柱直到流出液澄清，然后用4倍柱體積的丙酮洗脫，洗脫速率為3升/小時(吸附柱底部流出液的速度)，收集第3-4個柱體積的洗脫液。 在室溫下、真空度0. 07-0. 09MPA下減壓濃縮該丙酮洗脫液得浸膏，在45°C干燥得冠菌酸產品。將該冠菌酸產品用色譜級甲醇進行溶解。冠菌酸標準品的制備和檢測按照如下文獻中的方法進行 Jones WT, Harvey D, Mitchell RE, Ryan GB, Bender CL, ReynoldsPHS(1997) Competitive ELISA employing monoclonal antibodies specific for coronafacoyl amino acid conjugates. Food Agric Immunol 9:67—76。根據標樣濃度及峰面積建立冠菌酸檢測線性曲線。如圖1。冠菌酸的純度則由分析型高效液相色譜儀(流速每分鐘1毫升)給出。其中，分析型高效液相色譜儀的型號島津CBM-10A VP PULS，所采用的色譜柱的型號 Agela4. 6*250mm C18。色譜操作條件洗脫液是80%色譜甲醇溶液，時間10分鐘。根據純化后冠菌酸含量濃度與純化前樣品中冠菌酸濃度的比值計算冠菌酸收率。 其中，用于上樣檢測的純化前樣品中冠菌酸的上樣液按照如下方法制備取ImL步驟1的發酵液到離心管內，5000rpm離心3min，取0. 5mL上清液到新的離心管內，每支離心管內加 30yL 3M HC1，用等體積乙酸乙酯萃取3遍，收集有機相55°C水浴吹干所得物或自然風干。 甲醇溶解高效液相色譜檢測冠菌酸含量。根據純化后冠菌酸含量濃度與純化前樣品中冠菌酸濃度的比值計算冠菌酸收率為82%，根據冠菌酸峰面積所占全部樣品總峰面積的比例，計算冠菌酸純度為90% (見圖 2)。圖2為標準品(A)、冠菌酸粗提樣品(B)和本實施例提取得到的冠菌酸純度為 90%產品的HPLC圖譜。冠菌酸在該色譜條件下的保留時間是7分鐘。圖2的橫坐標為保留時間(分鐘)。實施例2、從微生物發酵液中提取冠菌酸1、發酵
挑取冷凍保存的丁香假單胞菌大豆致病變種CGMCC1276(記載在中國專利 ZL200510011466. 2 中)于斜面培養基(配方為 2%蛋白胨，0. 1 % KH2PO4O. 05% NaCl 0. 1% MgSO4 · 7H20,1. 3%的瓊脂粉，溶劑為水；該培養基的pH 7. 0)上培養48_60h使其活化，然后挑取一環活化好的菌體，接入含有lOug/ml的卡那霉素和30ug/ml的鏈霉素的液體培養基(配方是2%蛋白胨，0. 1% KH2PO4O. 05% NaCl 0. 1 % MgSO4 · 7H20 ；溶劑為水。該培養基的PH 7.0 ;121°C滅菌30min)中，28°C培養36-4 ,到對數期時，取培養菌液按5% (體積比)接種量接入發酵培養基(蔗糖15g，氯化銨1. 0g,KH2P044. lg,K2HP043. 6g,MgSO4 ·7Η20 0. 2g，KNO3O. 3g, 2mM FeCl3IOml,用蒸餾水定容至1000ml。該培養基的pH 7.0)中，在溫度為21°C、轉速為260rpm的條件下發酵4天。2、純化取步驟1的發酵液4. 8L在室溫條件下3000g離心20分鐘，收集上清液，調pH為 3 ；將50克HZ818大孔吸附樹脂用乙醇充分浸泡Mh，待樹脂充分溶脹后用蒸餾水洗滌至無乙醇，裝入吸附柱中，用3倍柱體積的3-5% (體積百分含量)的鹽酸溶液以IOL/小時的速度通過柱子，并浸泡池，用水平衡至PH =7.0;用3-5% (質量百分含量)的NaOH溶液以 IOL/小時的速度通過柱子，并浸泡池，用水平衡至ph = 7.0 ；用蒸餾水浸泡樹脂備用。將上述所得上清液(pH值3)4. 8L加入吸附柱中吸附速率(吸附柱底部流出液的速度)8升/小時；吸附完畢后用蒸餾水沖洗吸附柱直到流出液澄清，然后用3倍柱體積的乙醇洗脫，洗脫速率(吸附柱底部流出液的速度)為5升/小時，收集第3個柱體積的洗脫液；在室溫下、真空度0. 07-0. 09MPA下減壓濃縮乙醇洗脫液得浸膏，在40°C干燥得冠菌酸產品。將該冠菌酸產品用色譜甲醇進行溶解。用于定量的標準品及標準曲線同實施例1。將冠菌酸標準品和該冠菌酸產品用實施例1的分析型高效液相色譜儀按照上述色譜條件進行純度分析。根據純化后冠菌酸含量濃度與純化前樣品中冠菌酸濃度的比值計算冠菌酸收率為80%，根據冠菌酸峰面積所占全部樣品總峰面積的比例，計算冠菌酸純度為92%。實施例3、從微生物發酵液中提取冠菌酸1、發酵挑取冷凍保存的丁香假單胞菌大豆致病變種O^seudomonas syringae pv. glycinea)MW123(已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 2533，已在中國專利ZL 200810119153. 2得到授權)于斜面培養基(配方為 2%蛋白胨，0. 1% KH2PO4O. 05% NaCl 0. 1% MgSO4 ·7Η20，1. 3%的瓊脂粉，溶劑為水；該培養基的PH 7.0)上，28°C培養48-60h使其活化，然后挑取一環活化好的菌體，接入含有IOug/ ml的卡那霉素和30ug/ml的鏈霉素的液體培養基(配方是2%蛋白胨，0. 1% KH2PO4O. 05% NaCl 0. MgSO4 · 7H20 ；溶劑為水。該培養基的pH7. O ;121°C滅菌30min)中，28°C培養 36-4 ,到對數期時，取培養菌液按5% (體積比)接種量接入發酵培養基(蔗糖15g，氯化銨 1. Og, KH2PO4 4. lg, K2HPO4 3. 6g, MgSO4 · 7H20 0. 2g, KNO3 0. 3g,2mM FeCl3 10ml，用蒸溜水定容至1000ml。該培養基的pH 7.0)中，在溫度為23°C、轉速為^Orpm的條件下發酵3 天。2、純化
取步驟1的發酵液16L在室溫條件下SOOOg離心3分鐘，收集上清液，調pH為 5. 5 ；；將150克YPRII大孔吸附樹脂用乙醇充分浸泡Mh，待樹脂充分溶脹后用蒸餾水洗滌至無乙醇，裝入吸附柱中，用3倍柱體積的3-5% (體積百分含量)的鹽酸溶液以IOL/小時的速度通過柱子，并浸泡池，用水平衡至PH = 7;用3-5% (質量百分含量)的NaOH溶液以IOL/小時的速度通過柱子，并浸泡池，用水平衡至pH = 7. 0 ；用蒸餾水浸泡樹脂備用。將上述所得上清液(pH為5.5) 16L加入吸附柱中吸附速率(吸附柱底部流出液的速度)為5升/小時；吸附完畢后用蒸餾水沖洗吸附柱直到流出液澄清，然后用6倍柱體積的95%乙醇水溶液洗脫，洗脫速率(吸附柱底部流出液的速度)為4升/小時，收集第3-6 個柱體積的洗脫液；在室溫下、真空度0. 07-0. 09MPA下減壓濃縮該洗脫液得浸膏，在40°C 干燥得冠菌酸產品。將該冠菌酸產品用色譜甲醇進行溶解。用于定量的標準品及標準曲線同實施例1。將冠菌酸標準品和該冠菌酸產品用實施例1的分析型高效液相色譜儀按照上述色譜條件進行純度分析。根據純化后冠菌酸含量濃度與純化前樣品中冠菌酸濃度的比值計算冠菌酸收率為85%，根據冠菌酸峰面積所占全部樣品總峰面積的比例，計算冠菌酸純度為89%。
權利要求
1.一種提取冠菌酸的方法，包括如下步驟將含有冠菌酸的微生物發酵液的上清液過以大孔吸附樹脂為吸附劑的吸附柱進行吸附層析，洗脫得到冠菌酸；所述大孔吸附樹脂為非極性樹脂；所述洗脫中采用的洗脫劑為能溶解冠菌酸的有機溶劑。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述大孔吸附樹脂的型號為HPD300、 HZ818 或 YPRII。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述有機溶劑選自下述7種物質中的至少一種乙醇、乙醚、石油醚、正己烷、乙酸乙酯、95% (體積百分濃度)乙醇水溶液和丙酮。
4.根據權利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述含有冠菌酸的微生物發酵液的上清液的上柱吸附速率為4升/小時-8升/小時。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述含有冠菌酸的微生物發酵液的上清液的上柱量為3-200ml/g大孔吸附樹脂。
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于含有冠菌酸的微生物發酵液的上清液按照包括如下步驟的方法制備在液體培養基中發酵冠菌酸產生菌3-4天，收集發酵液中的上清液。
7.根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述方法在將含有冠菌酸的微生物發酵液的上清液過以大孔吸附樹脂為吸附劑的吸附柱前，包括將所述上清液的PH值調至2-5. 5的步驟。
8.根據權利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述含有冠菌酸的微生物發酵液的上清液，是將含有冠菌酸的微生物發酵液進行離心，得到的去除沉淀的液體。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述離心中，所采用的離心力 3000-8000g，離心時間是3-20分鐘。
全文摘要
本發明公開了一種大孔樹脂制備冠菌酸的方法。該方法，包括如下步驟將含有冠菌酸的微生物發酵液的上清液過以大孔吸附樹脂為吸附劑的吸附柱進行吸附層析，洗脫得到冠菌酸；所述大孔吸附樹脂為非極性大孔樹脂；所述洗脫中采用的洗脫劑為能溶解冠菌酸的有機溶劑。本發明的方法具有冠菌酸提取得率高、操作簡單、生產成本低和對環境污染低的特點，適合大量制備冠菌酸樣品。
文檔編號C07C51/47GK102304040SQ201110140219
公開日2012年1月4日 申請日期2011年5月27日 優先權日2011年5月27日
發明者吳慧玲, 周繁, 岳躍森, 張博, 李召虎, 李茂營, 段留生, 譚偉明 申請人:中國農業大學