專利名稱：恩夫韋肽的制備方法
技術領域：
本發明屬于多肽藥物制備方法技術領域，特別涉及恩夫韋肽的制備方法。
背景技術：
恩夫韋肽，英文名為Enfuvirtide，也稱為T-20，恩夫韋肽由羅氏與Trimeris公司共同研制，結構式為Ac-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-G Iu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-P he-NH2，或表示為NH2-FWNWLSAWKDLELLEQENKEQQNQSEEILSHILSTY-Ac (SEQ ID NO 1)；分子量:4492. 01，分子式=C204H301N51O640恩夫韋肽是2003年3月首次在美國注冊并上市的第一個HIV融合抑制劑，用于治療成人及6歲以上兒童慢性人類免疫缺陷病毒(HIV)感染。恩夫韋肽是合成多肽，由gp41 的HR2域中一段自然存在的氨基酸序列衍生而成，通過模擬HR2域的活性并且競爭結合 gp41的HRl域，阻止HRl和HR2的相互作用及gp41構型發生改變，進而阻止病毒與宿主細胞融合。與大多數多肽類藥物相似，恩夫韋肽發生代謝性藥物間相互作用的可能性很小。專利CN99806431報道的恩夫韋肽制備工藝的為固相和液相結合的片段縮合工藝，先使用羧基型2-Cl-Trt樹脂制備每個片段肽樹脂，經弱酸酸解、純化后獲得保護肽片段，再通過液相片段縮合、酸解、高效液相色譜純化得到純度為93-95%的產品。該方法生產周期長，每個片段中間體都須要經過純化，使用的溶劑品種多，整個生產過程無法實現連續的自動化生產。該方法中使用的酸解溶劑為三氟醋酸混合溶劑，其具體物料配比為TFA 水二硫蘇糖醇(DTT)，其中二硫蘇糖醇價格昂貴，每Kg需要2萬多元，不適合規模化生產需要，因此沒有國產化上市產品。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供恩夫韋肽的制備方法，該制備方法步驟簡單、
產品質量高。本發明恩夫韋肽(NH2-FffNWLSAffKDLELLEQENKEQQNQSEEILSHILSTY-Ac,SEQ ID NO 1)的制備方法包括如下步驟(1) Fmoc-Phe和去Fmoc保護的氨基樹脂偶聯反應得到Fmoc-Phe-氨基樹脂；(2) Fmoc-Phe-氨基樹脂依次與恩夫韋肽第2至第36個氨基酸對應的Fmoc-氨基酸偶聯反應，最后接入乙酰基，得到恩夫韋肽-氨基樹脂；(3)恩夫韋肽-氨基樹脂酸解反應得到恩夫韋肽。得到的恩夫韋肽為粗品，可以采用高效液相色譜法純化后得到恩夫韋肽純品。所述氨基樹脂選自Rink Amide AM樹脂、Rink Amide樹脂、Rink MBHA樹脂和 Sieber樹脂中的一種，優選為Rink Amide AM樹脂。
權利要求
1.恩夫韋肽的制備方法,所述恩夫韋肽為nh2-fwnwlsawkdlelleqenkeqqnqseeilshils ty-Ac seq id no :1，其特征在于包括如下步驟(1)Fmoc-Phe和去Fmoc保護的氨基樹脂偶聯反應得到Fmoc-Phe-氨基樹脂；(2)Fmoc-Phe-氨基樹脂依次與恩夫韋肽第2至第36個氨基酸對應的Fmoc-氨基酸偶聯反應，最后接入乙酰基，得到恩夫韋肽-氨基樹脂；(3)恩夫韋肽-氨基樹脂酸解反應得到恩夫韋肽。
2.根據權利要求1所述的恩夫韋肽的制備方法，其特征在于步驟(1)、(2)的偶聯反應需添加縮合試劑和活化試劑；縮合試劑選自n，n-二異丙基碳二亞胺、n，n-二環己基碳二亞胺，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2- (7-氮雜-IH-苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-n，n，n' ,n'-四甲基脲六氟磷酸鹽或o-苯并三氮唑-n，n，n'， n'-四甲基脲四氟硼酸酯；活化試劑選自1-羥基苯并三唑、N-羥基-7-氮雜苯并三氮唑。
3.根據權利要求1所述的恩夫韋肽的制備方法，其特征在于步驟⑴的Fmoc-Phe和步驟的Fmoc-氨基酸的摩爾用量為氨基樹脂中氨基總摩爾數的1. 2 6倍。
4.根據權利要求1所述的恩夫韋肽的制備方法，其特征在于步驟(2)第2至第36個氨基酸對應的Fmoc-氨基酸帶有側鏈保護基時，側鏈保護基為叔丁基、三苯基甲烷、叔丁氧基、叔丁氧羰酰基的至少一種。
5.根據權利要求1所述的恩夫韋肽的制備方法，其特征在于Fmoc-氨基酸為 Fmoc-Ala、Fmoc-Asn (Trt)、Fmoc-Asp (OtBu)、Fmoc-Gln (Trt)、Fmoc-Glu (OtBu)、 Fmoc-His (Trt)、Fmoc-Ile、Fmoc-LeuΛ Fmoc-Lys (Boc)、Fmoc-Ser (tBu)、Fmoc-Thr (tBu)、 Fmoc-Trp(Boc)或 Fmoc-Tyr(tBu)。
6.根據權利要求1所述的恩夫韋肽的制備方法，其特征在于步驟(1)和步驟(2)偶聯反應前去fmoc保護的試劑為哌啶/n，n- 二甲基甲酰胺混合溶液，混合溶液按體積比計含哌啶10 30%。
7.根據權利要求1所述的恩夫韋肽的制備方法，其特征在于步驟(3)酸解反應使用的酸解劑為三氟醋酸、1，2_乙二硫醇和水的混合溶劑，混合溶劑按體積比計配比為三氟醋酸80-95%，1，2-乙二硫醇1 10%，余量為水。
8.根據權利要求7所述的恩夫韋肽的制備方法，其特征在于酸解劑的用量為每克恩夫韋肽-氨基樹脂采用4 15ml酸解劑。
9.根據權利要求1 8任一項所述的恩夫韋肽的制備方法，其特征在于所述氨基樹脂選自Rink Amide樹脂、Rink Amide AM樹脂、Rink MBHA樹脂和Sieber樹脂中的一種。
10.根據權利要求9所述的恩夫韋肽的制備方法，其特征在于氨基樹脂取代值為 0. 2 1. 2_l/g 樹脂。
全文摘要
本發明屬于多肽藥物制備方法技術領域，特別涉及恩夫韋肽的制備方法。本發明所要解決的技術問題是提供恩夫韋肽的制備方法，所述恩夫韋肽為NH2-FWNWLSAWKDLELLEQENKEQQNQSEEILSHILSTY-Ac SEQ ID NO1。本發明恩夫韋肽的制備方法包括如下步驟(1)Fmoc-Phe和去Fmoc保護的氨基樹脂偶聯反應得到Fmoc-Phe-氨基樹脂；(2)Fmoc-Phe-氨基樹脂依次與恩夫韋肽第2至第36個氨基酸對應的Fmoc-氨基酸偶聯反應，最后接入乙酰基，得到恩夫韋肽-氨基樹脂；(3)恩夫韋肽-氨基樹脂酸解反應得到恩夫韋肽粗品；(4)恩夫韋肽粗品用高效液相色譜法純化后得到恩夫韋肽純品。本發明方法步驟簡單、產品質量高，能夠自動化生產。
文檔編號C07K1/20GK102241746SQ20111014017
公開日2011年11月16日 申請日期2011年5月27日 優先權日2011年5月27日
發明者文永均, 曾得志, 郭德文, 韓玉 申請人:成都圣諾科技發展有限公司