專利名稱：從珍珠貝肉中提取抗菌肽的方法
技術領域：
本發明涉及一種提取抗菌肽的方法，具體是涉及一種從珍珠貝肉中提取抗菌肽的方法，屬于水產品深加工技術領域。
背景技術：
抗菌肽(Antimicrobial peptides, AMPs)是有基因編碼的具有抗菌活性的一類小分子多肽的總稱。抗菌肽對細菌、部分真菌、病毒、原蟲、腫瘤細胞都具有殺傷作用，它的殺菌和安全無毒害作用的優勢使得它具有做天然食品防腐劑的潛在應用價值。世界上可產珍珠的貝類有三十多種，一般分布于熱帶、亞熱帶，于潮下帶至水深數十米的海底。目前用于生產海水養殖珍珠最主要的貝類是大珠母貝(又稱白碟貝)、合浦珠母貝(又稱馬氏珍珠貝)、企鵝珍珠貝等。其中以合浦珠母貝最普通，是世界上生產養殖珍珠的主要貝種。珍珠貝類開珠后產生大量的貝肉，這些珍珠貝肉除少量用于鮮食，大部分用于加工成飼料或廢棄，附加值較低。如何合理高值化利用珍珠貝肉資源，是珍珠貝類養殖產業急需解決的問題。由于珍珠貝類本身缺乏類似于高等脊椎動物那樣的特異免疫系統，其免疫主要依賴于豐富的體液防御系統中的各類免疫因子，其非特異性免疫系統很發達，而抗菌肽是其非特異性免疫系統的重要組成部分，且其生長過程生產珍珠的特異性，因此蘊藏著豐富的抗菌肽。由于海洋環境的復雜性和多樣性，海洋無脊椎動物抗菌肽具有比陸生生物抗菌肽抗菌活性更強、更耐熱、更耐鹽等特性，因而其在食品保鮮、貯藏及加工上的應用具有更廣闊的潛在價值。
發明內容
本發明的目的在于提供一種從珍珠貝肉中提取抗菌肽的方法，能提高珍珠貝肉的水解度和高抑菌活性，從而將廢棄的珍珠貝肉資源高值化利用。本發明的上述技術目的是通過如下技術手段來實現的一種從珍珠貝肉中提取抗菌肽的方法，包括如下步驟取經預處理的珍珠貝肉，加入冰水進行冷勻漿后得勻漿液；在勻漿液中加入風味蛋白酶混勻后調節超聲波的工作頻率為35kHz、超聲波強度為 280-360W、溫度為50-65°C進行超聲處理90_110min ；超聲處理后的勻漿液繼續在50_65°C 恒溫水浴中酶解l_2h，然后進行滅酶和冷卻處理得酶解液；將酶解液進行離心處理，取上清液調節膜分離的操作壓力為2-;3bar、溫度為3-10°C，利用膜分離技術進行超濾處理，收集截留分子量為5000-10000Da的分離液，冷凍干燥后即獲得珍珠貝肉抗菌肽產品。在上述方法中
本發明所述珍珠貝肉預處理過程取冷凍珍珠貝肉或鮮珍珠貝肉，除去其內臟，用清水清洗2-3次，浙水I-IOmin0本發明冰水的用量為珍珠貝肉的0. 4-0. 8重量倍。本發明所述的風味蛋白酶的酶活為2. OX IO5 U，以珍珠貝肉重量添加酶計，其添加量為 1500- 2500 U/g。本發明在超聲波處理后，繼續在50-65°C酶解1-ai，然后在100 °C下滅酶5 -10 min，滅酶后迅速冷卻。本發明酶解液進行離心處理的具體過程為將酶解液置于冷凍離心機中，調節離心機的轉速為 10000-15000r/min，在 0-4°C下離心 10-15 min。本發明利用膜分離技術進行超濾處理的具體過程為先將上清液用IOOOODa超濾膜進行分離，收集濾液，再用5000Da超濾膜進行分離，收集5000-10000Da的分離液，即得到珍珠貝肉抗菌肽液。本發明具有以下的優點
(1)本發明通過酶解、超聲波技術及膜分離技術相結合的集成技術，將珍珠貝肉通過風味蛋白酶進行酶解，利用超聲波技術具有波動和能量的雙重屬性，一是空化現象，即在液體介質中表現為泡的形成和破裂及伴隨的能量釋放，二是介質和容器也可以通過聲的吸收產生共振性質的二級效應，所以在超聲波的輔助作用下促進風味蛋白酶對珍珠貝肉進行水解，通過控制酶解的時間、溫度、加酶量、料水比例，獲取具有高抑菌性的抗菌肽。(2)本發明對珍珠貝肉通過采用風味蛋白酶并控制酶解的各項工藝條件進行酶解，水解度為48 55%，得到的珍珠貝肉抗菌肽液體為淡黃色，固體為淺黃色粉末；產品具有較強的抑菌活性，特別是對沙門氏菌、志賀氏菌、單增李斯特菌的抑制能力較強，抑菌能力達到85%以上。(3)本發明制備方法操作簡單，超聲波輔助酶解可以大大提高水解率，縮短水解時間，生產成本低，產品安全，可提高生產企業的經濟效益。(4)本發明對南海主要養殖珍珠貝開珠后大量的貝肉進行高值化利用，開發出具有抑菌、保鮮防腐作用的抗菌肽，可廣泛應用于食品、化妝品等輕工行業作為天然防腐保鮮劑，對促進海水養殖珍珠產業的可持續發展具有重要的經濟意義和社會意義。
具體實施例方式以下結合具體的實施例對本發明作進一步的說明，其中以下采用的原料或者試劑，如無特殊指明均為市售可得。實施例1
本實施例提供的珍珠貝肉抗菌肽的制備方法，包括以下步驟
(1)貝肉預處理將冷凍合浦珠母貝肉解凍，除去內臟，用清水清洗2-3次，放在不銹鋼框中浙水5分鐘；
(2)冷勻漿稱取預處理后貝肉，加入0.4倍貝肉重量的冰水，置于組織搗碎機中勻漿 2 -5 min，得到貝肉勻漿液；
(3)加酶、超聲波處理將貝肉勻漿液置于不銹鋼容器中，添加風味蛋白酶(丹麥NOVO 公司產品，酶活為2.0X105 U)，按貝肉重量添加酶，風味蛋白酶的添加量為1600 U/g，攪勻后，放在超聲波儀器中，調節超聲波工作頻率為35kHz、超聲波的強度為360W、控制處理溫度為60°C，時間為90min ；
(4)進一步酶解經超聲波處理后，將步驟(3)中的貝肉勻漿液繼續在65°C恒溫水浴酶解2.0 h，在100 °C下滅酶5min，滅酶后迅速冷卻；
4(5)離心將步驟(4)中的酶解液在冷凍離心機中離心，離心機的轉速為lOOOOr/min， 0°C下離心10 min，取上清液；
(6)超濾利用膜分離技術對步驟(5)中獲得的上清液進行膜分離，膜分離的操作壓力為2 bar，溫度為10°C，先用IOOOODa超濾膜進行分離，收集濾液，再用5000Da超濾膜進行分離，收集5000-10000Da的分離液，即得到合浦珠母貝肉抗菌肽液，呈淡黃色液體；
(7)凍干將步驟(6)中得到的合浦珠母貝肉抗菌肽液用凍干機，凍干得到淺黃色抗菌肽粉。實施例2
本實施例提供的珍珠貝肉抗菌肽的制備方法，包括以下步驟
(1)貝肉預處理將冷凍大珠母貝貝肉解凍，除去內臟，用清水清洗2-3次，放在塑料框中浙水5分鐘；
(2)冷勻漿稱取預處理后貝肉，加入0.8倍貝肉重量的冰水，置于組織搗碎機中勻漿 2 -5 min，得到貝肉勻漿液；
(3)加酶、超聲波處理將貝肉勻漿液置于玻璃容器中，添加風味蛋白酶(丹麥NOVO公司產品，酶活為2. 0 X IO5 U)，按貝肉重量添加酶，風味蛋白酶的添加量為2500 U/g，攪勻后， 放在超聲波儀器中，調節超聲波工作頻率為35kHz、超聲波的強度為320W、控制處理溫度為 50°C，時間為 IOOmin ；
(4)進一步酶解經超聲波處理后，將步驟(3)中的貝肉勻漿液繼續在50°C恒溫水浴酶解1. 5h，在100 °C下滅酶lOmin，滅酶后迅速冷卻；
(5)離心將步驟(4)中的酶解液在冷凍離心機中離心，離心機的轉速為15000r/min， 4°C下離心15 min，取上清液；
(6)超濾利用膜分離技術對步驟(5)中獲得的上清液進行膜分離，膜分離的操作壓力為3 bar，溫度為3°C，先用IOOOODa超濾膜進行分離，收集濾液，再用5000Da超濾膜進行分離，收集5000-10000Da的分離液，即得到大珠母貝貝肉抗菌肽液，呈淡黃色液體；
(7)凍干將步驟(6)中得到的大珠母貝貝肉抗菌肽液用凍干機，凍干得到淺黃色抗菌肽粉。實施例3
本實施例提供的企鵝珍珠貝貝肉抗菌肽的制備方法，包括以下步驟
(1)貝肉預處理將新鮮企鵝珍珠貝貝肉解凍，除去內臟，用清水清洗2-3次，放在不銹鋼框中浙水5分鐘；
(2)冷勻漿稱取預處理后貝肉，加入0.6倍貝肉重量的冰水，置于組織搗碎機中勻漿 2 -5 min，得到貝肉勻漿液；
(3)加酶、超聲波處理將貝肉勻漿液置于不銹鋼杯中，添加風味蛋白酶(丹麥NOVO公司產品，酶活為2. OX IO5 U)，按貝肉重量添加酶，風味蛋白酶的添加量為2000 U/g，攪勻后，放在超聲波儀器中，調節超聲波工作頻率為35kHz、超聲波的強度為^0W、控制處理溫度為65°C，時間為IlOmin ；
(4)進一步酶解經超聲波處理后，將步驟(3)中的貝肉勻漿液繼續在60°C恒溫水浴酶解l.Oh，在100 °C下滅酶8min，滅酶后迅速冷卻；
(5)離心將步驟(4)中的酶解液在冷凍離心機中離心，離心機的轉速為12000r/min，
52°C下離心12 min，取上清液；
(6)超濾利用膜分離技術對步驟(5)中獲得的上清液進行膜分離，膜分離的操作壓力為2.5 bar，溫度為6°C，先用IOOOODa超濾膜進行分離，收集濾液，再用5000Da超濾膜進行分離，收集5000-10000Da的分離液，即得到企鵝珍珠貝貝肉抗菌肽液，呈淡黃色液體；
(7)凍干將步驟(6)中得到的企鵝珍珠貝貝肉抗菌肽液用凍干機，凍干得到淺黃色抗菌肽粉。 以上實施實例對本發明不同的實施過程進行了詳細的闡述，但是本發明的實施方式并不僅限于此。所述技術領域的普通技術人員依據本發明中公開的內容，均可實現本發明的目的。
權利要求
1.一種從珍珠貝肉中提取抗菌肽的方法，其特征是包括如下步驟取經預處理珍珠貝肉，加入冰水進行冷勻漿后得勻漿液；在勻漿液中加入風味蛋白酶混勻后調節超聲波的工作頻率為35kHz、超聲波強度為280-360W、溫度為50_65°C進行超聲處理90_1 IOmin ；超聲處理后的勻漿液繼續在50-65°C恒溫水浴中酶解l_2h，然后進行滅酶和冷卻處理得酶解液； 將酶解液進行離心處理，取上清液調節膜分離的操作壓力為2-;3bar、溫度為3-10°C，利用膜分離技術進行超濾處理，收集截留分子量為5000-10000Da的分離液，冷凍干燥后即獲得珍珠貝肉抗菌肽產品。
2.根據權利要求1所述的從珍珠貝肉中提取抗菌肽的方法，其特征是所述珍珠貝肉預處理為取冷凍珍珠貝肉或鮮珍珠貝肉，除去其內臟，用清水清洗2-3次，浙水1-lOmin。
3.根據權利要求1或2所述的從珍珠貝肉中提取抗菌肽的方法，其特征是冰水的用量為貝肉的0. 4-0. 8重量倍。
4.根據權利要求3所述的從珍珠貝肉中提取抗菌肽的方法，其特征是所述的風味蛋白酶的酶活為2. OX IO5 U，以珍珠貝肉重量添加酶計，其添加量為1500- 2500 U/g。
5.根據權利要求1所述的從珍珠貝肉中提取抗菌肽的方法，其特征是在超聲-酶解處理后，在100 °C下滅酶5 -10 min，滅酶后迅速冷卻。
6.根據權利要求1所述的從珍珠貝肉中提取抗菌肽的方法，其特征是酶解液進行離心處理的具體過程為將酶解液置于冷凍離心機中，調節離心機的轉速為10000-15000r/ min，在 0-4°C下離心 10-15 min。
7.根據權利要求1所述的從珍珠貝肉中提取抗菌肽的方法，其特征是利用膜分離技術進行超濾處理的具體過程為先將上清液用IOOOODa超濾膜進行分離，收集濾液，再用 5000Da超濾膜進行分離，收集5000-10000Da的分離液，即得到珍珠貝肉抗菌肽液。
全文摘要
本發明公開了一種從珍珠貝肉中提取抗菌肽的方法，含如下步驟取經預處理珍珠貝肉，加入冰水進行冷勻漿后得勻漿液；在勻漿液中加入風味蛋白酶混勻后調節超聲波的工作頻率為35kHz、超聲波強度為280-360W、溫度為50-65℃進行超聲處理90-110min；超聲處理后的勻漿液繼續在50-65℃恒溫水浴中酶解1-2h，然后進行滅酶和冷卻處理得酶解液；將酶解液進行離心處理，取上清液調節膜分離的操作壓力為2-3bar、溫度為3-10℃，利用膜分離技術進行超濾處理，收集截留分子量為5000-10000Da的分離液，冷凍干燥后即獲得珍珠貝肉抗菌肽產品。該方法以超聲波技術輔助風味蛋白酶水解提取珍珠貝肉中的抗菌肽，操作簡單，可以提高水解率和抑菌活性，縮短水解時間，生產成本低，產品安全，能將開珍珠后廢棄的珍珠貝肉資源高值化利用，提高生產企業的經濟效益。
文檔編號C07K1/34GK102220402SQ20111013993
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月27日 優先權日2011年5月27日
發明者刁石強, 吳燕燕, 宮曉靜, 李來好, 楊賢慶, 鄧建朝, 陳勝軍, 馬海霞, 黃卉 申請人:中國水產科學研究院南海水產研究所