專利名稱：提取海州香薷中抗腫瘤成份咖啡酸的方法
技術領域：
本發明屬于天然產物的生物資源化利用領域，涉及修復植物一海州香薷中抗菌抗腫瘤活性成分咖啡酸的分離純化方法。
背景技術：
海州香薷(Elsholtzia splendens)，又稱銅草，為唇形科香薷屬植物，在我國長期被定為藥材香薷的基原植物，但1995版藥典對此進行了修改。民間對海州香需的應用較為廣泛，功效似香薷。早在1953年，著名勘探地球化學家謝學錦院士和徐邦梁先生發現并報道了海州香薷是銅礦的指示植物，是我國尋找銅礦和銅礦開采的有效指示植物。近年來，我國學者對海州香薷忍耐和積累銅進行了大量的調查和研究。海州香薷被廣泛用于廢舊銅礦及銅污染土壤的生態恢復。創立和集成海州香薷對污染土壤植物修復及其產后資源化的技術體系，如何合理資源化利用修復植物海州香薷是一個亟待解決的瓶頸問題。咖啡酸(Caffeic acid)又名水解咖啡鞣酸、3，4_ 二羥基肉桂酸、3_(3，4_ 二羥基苯基)-2_丙烯酸，為桂皮酸類化合物，分子式C9H8O4,分子量180. 15 ；為黃色結晶，分解點 223 225°C (在194°C軟化)。微溶于冷水，易溶于熱水及冷乙醇。普遍存在于當歸、川芎等常用植物藥中，通常存在于菊科、薔薇科、無患子科、毛茛科、水龍骨科、蕓香科、蓼科、敗醬科、唇形科以及杜仲科植物的花、葉或果實當中。具有抗菌、抗病毒、抗蛇毒、抗腹瀉、抗生育及抗腫瘤等多種藥理活性，還具有涼血止血功能。有文獻報道咖啡酸可競爭性地抑制內皮素-KEndothdin-l，ET-1)與受體的結合，常用于治療高血壓、冠心病、心律失常等疾病。 作為羥基肉桂酸的代表化合物，咖啡酸具有很強的抗氧化活性。咖啡酸具有多種藥理活性，因而咖啡酸及其衍生物的制備已經得到越來越多的關注。采用傳統化學合成方法制備咖啡酸，存在反應時間長、純度不理想、產品中有害物質殘留高，造成咖啡酸產品不理想等。卞建剛等人的專利“一種咖啡酸原料藥的制備方法”(專利號ZL 200910015552. 9)中公開的方法在反應釜中加入DMF和無水吡啶的混合溶劑，再加入3，4- 二羥基苯甲醛和丙二酸，溶解制得反應溶液，加入催化劑三苯甲基鈉和三甲基哌啶，開啟攪拌升溫至70-100°C反應生成咖啡酸，然后經干燥得咖啡酸產品。然而此方法須在高溫高壓無水條件下進行，反應條件苛刻、危險性高、原料復雜、成本高，且有害性原料仍有少量殘余，難以保證藥品安全。海州香薷具有忍耐高銅環境的能力。修復高銅環境的海州香薷中咖啡酸含量高。 咖啡酸是海州香薷植物的主要活性成分之一。海州香薷植物中的咖啡酸與其體內的銅離子代謝緊密關聯。據報道，咖啡酸本身不與Cu(II)螯合，而是咖啡酸酚氧負離子(ArCT)作為雙齒配體與Cu(II)進行螯合，形成的酚氧負離子-Cu(II)絡合物(ArO--Cu)通過分子內電子轉移生成咖啡酸鄰醌結構和Cu(I)。海州香薷具有忍耐高銅的特性或許與其體內含有大量的咖啡酸有關，這不僅為深入研究海州香薷忍耐及積累銅的機理提供理論依據，而且為開發植物源咖啡酸提供技術基礎。目前國內尚無報道從植物中提取高得率(> 0. 09% )高純度(> 98% )咖啡酸的工藝技術專利，也沒有報道關于從修復植物海州香薷中分離純化活性成分咖啡酸的方法。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種提取海州香薷中抗腫瘤成份咖啡酸的方法， 采用本發明的方法能高得率的獲取高純度的咖啡酸。為了解決上述技術問題，本發明提供一種提取海州香薷中抗腫瘤成份咖啡酸的方法，依次包括以下步驟1)、粗提將盛花期收獲的海州香薷花枝和葉片風干后磨成干粉末，用體積濃度彡95%的乙醇浸泡至少2天，干粉末與乙醇的重量/體積為1kg干粉末/8 15L乙醇；再超聲波處理0. 5 1. 5h，過濾后得到提取液，提取液經真空濃縮，得稀浸膏；2)、萃取按照每kg稀浸膏配用5 8L超純水的用量比，將上述稀浸膏用超純水溶解，然后再用與超純水相同體積的石油醚反復萃取，直至所得的石油醚層無色；得石油醚層和水層；將上述水層用與超純水相同體積的乙酸乙酯反復萃取，直至所得的萃取液(即乙酸乙酯萃取層)在254nm和365nm紫外下均無熒光；合并所得的乙酸乙酯萃取層然后進行減壓濃縮，得棕黑色的乙酸乙酯層浸膏；3)、大孔樹脂粗分離將步驟2)所得的棕黑色的乙酸乙酯層浸膏制成水液，上樣于DlOl大孔樹脂并充分吸附，并分別以1 2BV(BV指樹脂床體積)的水、2 4BV的體積濃度為10% (V/V)乙醇、5 8BV的體積濃度為20% (V/V)乙醇進行梯度洗脫；收集含有咖啡酸成份的體積濃度為20%乙醇流出液，濃縮后得到黃棕色浸膏；在發明過程中，上述收集步驟具體如下收集流出液并分別對每管中的流出液進行TLC點板(薄層層析，展開劑CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 30 1 1)，通過與咖啡酸標準品對照，觀察到20%乙醇洗脫后的流出液中有咖啡酸成份的存在，在紫外燈(254nm)下顯藍色熒光，且遇FeCl3I灰黑色；繼續用20%乙醇洗脫至流出液通過TLC點板后無咖啡酸成份；合并上述含有咖啡酸成份的20%乙醇流出液；濃縮后得到黃棕色浸膏；4)、薄層硅膠純化精制將薄層層析硅膠H用二氯甲烷溶解后加壓裝柱，薄層層析硅膠H與二氯甲烷的質量體積比為lg/4 8ml ；此步驟中，薄層層析硅膠H與黃棕色浸膏的重量比為15 20 1 ；將步驟3)所得的黃棕色浸膏用甲醇溶解后加入薄層層析硅膠H進行拌樣，旋干后將所得的拌樣裝在柱頂端；此步驟中，薄層層析硅膠H與黃棕色浸膏的重量比為2 4:1;以CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 30 1 1的體積比為洗脫體系，收集各管流出液， 并隨時進行TLC點板跟蹤，以紫外燈下顯藍色熒光、FeCl3顯灰黑色和碘熏硅膠板無雜質三項指標為準(不能同時滿足這3項標準的流出液就作廢棄處理)，將Rf = 0. 5 (斑點在硅膠板上的比移值)且為單一斑點的各管合并，45 50°C旋蒸至干，得到淡黃色物質，該淡黃色物質為咖啡酸。作為本發明的提取海州香薷中抗腫瘤成份咖啡酸的方法的改進步驟3)的大孔樹脂粗分離中進行梯度洗脫時，洗脫液(即水、10% V/V乙醇和20% V/V乙醇)的流速控制在 0. 5-1. 2BV/h。作為本發明的提取海州香薷中抗腫瘤成份咖啡酸的方法的進一步改進步驟1) 的浸泡時間為2 4天，然后再在30 50KHz的超聲強度下處理0. 5 1. 5小時。本發明中，精制純化所采用的填充材料薄層層析硅膠H與原料(大孔樹脂粗分離得到的黃棕色浸膏)的比例為15 1 20 1(W/W)，將薄層層析硅膠H用二氯甲烷溶解后加壓裝柱，其中薄層硅膠H于二氯甲烷的比例為1 4 1 8(W/V)。同時將所得的黃棕色浸膏用甲醇溶解后加入薄層層析硅膠H進行拌樣，以薄層層析硅膠H與黃棕色浸膏的比例為2 1 4 1(W/W)，旋干后將其裝在柱頂端。本發明中，通過薄層硅膠柱精制純化的洗脫液中加入了適量的甲酸屏蔽掉雜質的干擾，所采用的洗脫體系是CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 30 1 1，對薄層硅膠柱上樣中的咖啡酸具有最好分離效果；以TLC點板跟蹤時紫外燈下顯藍色熒光且斑點在硅膠板上的比移值Rf = 0. 5為收集洗脫液的標準(沒有其他雜質的干擾)。本發明所得的淡黃色物質進行如下化學結構鑒定將薄層硅膠純化精制得到的淡黃色物質用超純水溶解，于-40°C -80°C冰凍2 4小時，真空冷凍干燥得到淡黃色結晶狀的產品，所述產品的純度高于98%。再用核磁共振氫譜、碳譜和質譜表征該產品的化學結構，確證為咖啡酸。該咖啡酸提取工藝效率高，提取到咖啡酸的得率高于0. 09%。液相色譜檢測純度高于98%。本發明的顯著優點和效果(1)本發明的海州香薷植物中提取到抗腫瘤成份咖啡酸的方法，為室溫提取，節省能源并可避免提取過程中有效成分的破壞。通過浸提與超聲提取相結合的方法得到高產量的乙醇提取物，再通過石油醚、乙酸乙酯深度萃取使提取過程中咖啡酸的損失降到最低，產率高。(2)通過大孔樹脂粗分離和薄層硅膠精制，并在薄層硅膠洗脫液中加入一定量的甲酸，采用洗脫體系CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 30 1 1，可以屏蔽掉大部分雜質的干擾，得到咖啡酸產物純度高達98. 0%以上，得率高于0. 09%。(3)采用本發明的從海州香薷植物中提取到的活性成份咖啡酸的方法，具有提取工藝簡單、安全、成本低、污染小的特點，適于工業化生產。綜上所述，本發明提供的海州香薷中抗腫瘤成份咖啡酸的提取方法，是一種生物修復植物海州香薷產后資源化利用的新途徑。采用本發明的方法從修復植物海州香薷中提取抗腫瘤成份咖啡酸，該提取工藝的提取效率高，提取工藝簡單安全。提取到的活性成份咖啡酸純度高達98. 0 %，本發明的得率約為0. 09 %。
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1為海州香薷中咖啡酸產品的提取分離純化流程圖；圖2為本發明的海州香薷中提取的咖啡酸產品的核磁共振氫譜圖；圖3為本發明的海州香薷中提取的咖啡酸產品的核磁共振碳譜圖；圖4為本發明的海州香薷中提取的咖啡酸產品的負離子質譜圖。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。海州香薷中咖啡酸產品的提取分離流程如圖1所示。實施例1 一種提取海州香薷中抗腫瘤成份咖啡酸的方法，依次進行以下步驟1)、粗提將盛花期收獲的海州香薷花枝和葉片風干后磨成干粉末(含水率低于0.5%，重量比)，過100目的篩，取上述500g干粉末，置于IOL的塑料桶中，加入95% (V/V)乙醇5L， 攪拌均勻浸泡3天至材料完全吸漲，40KHz的超聲頻率處理1小時，抽濾得濾液。將抽濾所得的殘渣重復上述過程共3次(即以殘渣替代干粉末，重復上述浸提)。合并4次浸提所得的濾液；再經45°C真空濃縮，得126. Ig的稀浸膏①。產率 25. 22%。2)、萃取將上述126. Ig的稀浸膏①用750ml超純水溶解，用石油醚萃取15次(每次石油醚的用量為750ml)，至石油醚層基本無色(主要為無綠色)，且在254nm和365nm紫外下均
無熒光。合并上述15次的石油醚層，35°C旋轉蒸發回收石油醚，得到20. 468g的石油醚層浸膏②，產率16. 23%。將水層繼續用乙酸乙酯萃取25次(每次乙酸乙酯的用量是750ml)，至乙酸乙酯層無顏色且在254nm和365nm紫外下均無熒光。40°C旋轉蒸發回收乙酸乙酯，得到19. 755g 的棕黑色浸膏③(即，棕黑色的乙酸乙酯層浸膏)，產率15. 67%。3)、大孔樹脂粗分離準備DlOl型大孔吸附樹脂，體積269ml，先用大量的蒸餾水沖洗，并除去漂浮的碎樹脂顆粒，再在層析柱中用乙醇浸泡過夜，然后用乙醇淋洗至流出液與水按1 5(體積比) 混合無渾濁。再將上述DlOl型大孔吸附樹脂中的乙醇用大量的蒸餾水沖干凈，至無醇味。將上述19. 755g的棕黑色浸膏③加超純水從而制成IOOml水溶液，加入在上述洗干凈的DlOl型大孔樹脂層析柱的上部；從而使上述水溶液被充分吸收。分別以IBV的水、2BV的10% (V/V)乙醇、5BV的20% (V/V)乙醇對DlOl型大孔樹脂進行梯度洗脫，流速控制在0.5BV/h。收集各管洗脫液，每管大約50ml。直至用20% (V/V)乙醇洗脫至流出液通過TLC跟蹤紫外燈下無咖啡酸成分存在(BV表示倍數于樹脂床的體積，5BV的用量能達到該要求)。分別對每管中的洗脫液進行TLC點板，以CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 30 1 1 為展開劑，通過與咖啡酸標準品比對；將斑點比移值Rf相同(Rf = 0. 5)，紫外燈(254nm)下顯藍色熒光且遇(質量比)FeCl3I灰黑色特征的20%乙醇洗脫液(含有咖啡酸成份) 合并，并濃縮得到2. 430g的黃棕色浸膏④，產率12. 30%。置冰箱備用。不符合上述標準的其他洗脫液作廢液處理。4)、薄層硅膠純化精制將45g的薄層層析硅膠H用300ml的二氯甲烷溶解后，攪拌去氣泡，加壓裝柱；將步驟3)所得的2. 430g的黃棕色浸膏④用IOml的甲醇溶解后加入5g的薄層層析硅膠H進行拌樣，旋干后將其裝在柱頂端。
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以體積比為CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 30 1 1的洗脫體系進行加壓過柱洗脫， 共需洗脫液約3500ml，TLC點板時紫外燈下觀察到淡熒光開始收集流出液，每管收集10ml， 并隨時進行TLC點板跟蹤，通過與咖啡酸標準品進行比對，以紫外燈下顯藍色熒光、(質量比)FeCl3顯灰黑色、且碘熏硅膠板無雜質三項指標為準。將符合上述標準，且斑點在硅膠板上的比移值Rf = 0. 5的且為單一斑點的各管合并，50°C旋蒸至干，得到淡黃色的產物，約513mg。不符合標準的洗脫液作廢液處理。5)、數據分析將上述513mg的淡黃色產物用20ml的超純水溶解，_40°C冰凍2小時，真空冷凍(-80°C )干燥得到產品458mg，產品呈黃色結晶。得率計算(458mg/500g) X 100% = 0. 0916%。純化的淡黃色結晶用氘代甲醇溶解送譜，核磁共振氫譜、碳譜鑒定結構。數據如下1H NMR (500MHz, CD3OD) δ 7. 55 (1Η, d, J = 16. OHz)，7. 05 (1H，d, J = 1. 5Hz)， 6. 95 (1H, dd, J = 2Hz,8Hz)，6. 79 (1H, d, J = 8Hz)，6. 23 (1H, d, J = 16Hz)。13C NMR (500MHz, CD3OD) δ 169. 86，148. 27，145. 85，145. 63，126. 68，121. 66， 115. 35，114. 43，113. 97。結果表明(如圖2-3)，與咖啡酸標準品的譜圖相比照，淡黃色結晶的核磁共振氫譜中，其化學位移、偶合常數、峰型以及氫的數量幾乎完全吻合；淡黃色結晶的核磁共振碳譜中，共含9個碳原子，且各碳原子的化學位移均基本保持一致。質譜數據(如圖4)經過負離子質譜(ESI-MS)，淡黃色結晶中，有兩個主峰 [Μ-1Γ = 179. 16，[2Μ-1Γ = 358. 77。[2Μ-1Γ = 358. 77是咖啡酸之間形成分子間氫鍵而成的雙分子聚合體的負離子峰。還原后可得分子量約為180. 16。與咖啡酸標準品相符合。液相色譜數據稱取海州香薷中提取的純化的咖啡酸產品(淡黃色結晶)，配成濃度為lmg/ml的甲醇溶液，進行高效液相色譜分析(儀器條件Agilent Exlipse XDB C18色譜柱；流動相為乙腈0. 5%磷酸=15 85 ；進樣量IOul ；流速lml/min ；波長323nm ；柱溫 21°C )。結果表明從海州香薷中提取的咖啡酸產品(淡黃色結晶)純度達到98. 266%。采用電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)分析表明，提取的咖啡酸產品中含有 0. 0015mg/kg Cu，低于國家衛生標準。實施例2 —種提取海州香薷中抗腫瘤成份咖啡酸的方法，依次進行以下步驟1)、粗提將盛花期收獲的海州香薷花枝和葉片風干后磨成干粉末，過100目的篩，取上述 5000g干粉末，置于100L的塑料桶中，加入95% (V/V)乙醇75L，攪拌均勻浸泡4天至材料完全吸漲，40KHz的超聲頻率處理1小時，抽濾得濾液。將抽濾所得的殘渣重復上述過程共3次(即以殘渣替代干粉末，重復上述浸提)。合并4次浸提所得的濾液；再經45°C真空濃縮，得1275. Ig的稀浸膏①。產率 25. 50%。2)、萃取將上述1275. Ig的稀浸膏①用8L超純水溶解，用石油醚萃取15次(每次石油醚的用量為8L)，至石油醚層基本無色，且在254nm和365nm紫外下均無熒光。
合并上述15次的石油醚層，35°C旋轉蒸發回收石油醚，得到202. Ig的石油醚層浸膏②，產率15. 85%。將水層繼續用乙酸乙酯萃取25次(每次乙酸乙酯的用量是8L)，至乙酸乙酯層無顏色且在254nm和365nm紫外下均無熒光。40°C旋轉蒸發回收乙酸乙酯，得到191. 6g的棕黑色浸膏③，產率15. 03%。3)、大孔樹脂粗分離準備DlOl型大孔吸附樹脂，體積2700ml，先用大量的蒸餾水沖洗，并除去漂浮的碎樹脂顆粒，再在層析柱中用乙醇浸泡過夜，然后用乙醇淋洗至流出液與水按1 5混合無渾濁。再將上述DlOl型大孔吸附樹脂中的乙醇用大量的蒸餾水沖干凈，至無醇味。將上述191. 6g的棕黑色浸膏③加超純水制成IOOOml水溶液，加入在上述洗干凈的DlOl型大孔樹脂層析柱的上部；從而使上述水溶液被充分吸收。分別以2BV的水、3BV的10% (V/V)乙醇、7BV的20% (V/V)乙醇對DlOl型大孔樹脂進行梯度洗脫，流速控制在0.8BV/h。收集各管洗脫液，每管大約200ml。直至用20% (V/V)乙醇洗脫至流出液通過TLC跟蹤紫外燈下無咖啡酸成分存在(7BV的用量能達到上述要求)。分別對每管中的洗脫液進行TLC點板，以CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 30 1 1 為展開劑，通過與標準品咖啡酸比對，將斑點比移值Rf相同(Rf = 0.5)，紫外燈(254nm) 下顯藍色熒光且遇FeCl3顯灰黑色特征的含有咖啡酸成份的20%乙醇洗脫的流出液合并，并濃縮得到23. 581g的黃棕色浸膏④，產率12. 31%。置冰箱備用。不符合上述標準的其他洗脫液作廢液處理。4)、薄層硅膠純化精制將460g的薄層層析硅膠H用3200ml的二氯甲烷溶解后，攪拌去氣泡，加壓裝柱；將步驟3)所得的23. 581g的黃棕色浸膏④用80ml的甲醇溶解后加入80. 5g的薄層層析硅膠H進行拌樣，旋干后將其裝在柱頂端。以CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 30 1 1的體積比為洗脫體系進行加壓過柱洗脫， 共需洗脫液約40L。TLC點板時紫外燈下觀察到淡熒光開始收集流出液，每管收集10ml，并隨時進行TLC點板跟蹤，通過與咖啡酸標準品進行比對，以紫外燈下顯藍色熒光、FeCl3 顯灰黑色且碘熏硅膠板無雜質三項指標為準。將符合上述標準，且斑點在硅膠板上的比移值Rf = 0. 5的且為單一斑點的各管合并，50°C旋蒸至干，得到淡黃色的產物，約5. 097g。不符合標準的洗脫液作廢液處理。5)、數據分析將上述5. 097g的淡黃色的產物用150ml的超純水溶解，_40°C冰凍2小時，真空冷凍(-80°C)干燥得到產品4.607g，產品呈黃色結晶。總產率0.0921%。高效液相檢測咖啡酸純度為98. 18%。純化的淡黃色結晶用氘代甲醇溶解送譜，核磁共振氫譜、碳譜鑒定結構。數據如下1H NMR (500MHz, CD3OD) δ 7. 55 (1Η, d, J = 15. 5Hz), 7. 06 (1H, d, J = 2Hz)， 6. 95 (1H, dd, J = 2Hz,8Hz)，6. 79 (1H, d, J = 8Hz)，6. 24 (1H, d, J = 16Hz) ·13C NMR (500MHz, CD3OD) δ 169. 90，148. 24，145. 90，145. 56，126. 55，121. 77，115. 26，114. 25，113. 84.結果表明，淡黃色結晶的核磁共振氫譜、碳譜均符合咖啡酸標準品的譜圖。經過負離子質譜(ESI-MS)，淡黃色結晶的質譜數據同實施例1，與咖啡酸標準品相符合。高效液相色譜方法如實施例1，結果表明從海州香薷中提取的咖啡酸產品(淡黃色結晶)純度達到98. 18%。電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)分析表明，咖啡酸產品中重金屬含量含有 0. 0019mg/kg Cu，低于國家衛生標準。實施例1的方法與文獻報道方法的先進性對比。如鄭旭東等(2006年)在香薷化學成分的研究中報道取香薷全草1. 5kg (干重)剪碎后，以EtOH室溫浸提(5L，7dX 3)，濾出液減壓濃縮得浸膏58g，再以熱水混懸，依次用石油醚、CHCl3和EtOAc萃取，并濃縮得到氯仿浸膏18g，乙酸乙酯浸膏25g。氯仿浸膏經硅膠柱層析，用石油醚氯仿(9 1-1 9) 進行梯度洗脫，經純化最終得到咖啡酸12mg，得率僅為0. 0008%。實施例1的海州香薷干樣中咖啡酸含量測定將海州香薷花枝和葉片干粉，根據實施例1中的方法采用95% (V/V)乙醇提取、40KHz的超聲頻率處理1小時，抽濾得濾液， 配制成Ig干粉/120ml甲醇的溶液，高效液相色譜(儀器條件同上)分析測定后，計算出海州香薷干粉中咖啡酸含量為1100. 16mg/kg,即0. 1100%。采用本實施例1的方法提取到的咖啡酸產品得率為0. 0916%，提取過程中咖啡酸的損失率約0. 018%，提取工藝的提取效率高，而且提取工藝簡單安全。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
權利要求
1.提取海州香薷中抗腫瘤成份咖啡酸的方法，其特征是依次包括以下步驟1)、粗提將盛花期收獲的海州香薷花枝和葉片風干后磨成干粉末，用體積濃度彡95%的乙醇浸泡至少2天，所述干粉末與乙醇的重量/體積為1kg干粉末/8 15L乙醇；再超聲波處理0. 5 1. 5h，過濾后得到提取液，提取液經真空濃縮，得稀浸膏；2)、萃取按照每kg稀浸膏配用5 8L超純水的用量比，將上述稀浸膏用超純水溶解， 然后再用與超純水相同體積的石油醚反復萃取，直至所得的石油醚層無色；得石油醚層和水層；將上述水層用與超純水相同體積的乙酸乙酯反復萃取，直至所得的萃取液在254nm和 365nm紫外下均無熒光；合并所得的乙酸乙酯萃取層然后進行減壓濃縮，得棕黑色的乙酸乙酯層浸膏；3)、大孔樹脂粗分離將步驟2)所得的棕黑色的乙酸乙酯層浸膏制成水液，上樣于DlOl大孔樹脂并充分吸附，并分別以1 2BV的水、2 4BV的體積濃度為10%乙醇、5 8BV的體積濃度為20% 乙醇進行梯度洗脫；收集含有咖啡酸成份的體積濃度為20%乙醇流出液，濃縮后得到黃棕色浸膏；4)、薄層硅膠純化精制將薄層層析硅膠H用二氯甲烷溶解后加壓裝柱，薄層層析硅膠H與二氯甲烷的質量體積比為lg/4 8ml ；此步驟中，薄層層析硅膠H與黃棕色浸膏的重量比為15 20 1 ；將步驟3)所得的黃棕色浸膏用甲醇溶解后加入薄層層析硅膠H進行拌樣，旋干后將所得的拌樣裝在柱頂端；此步驟中，薄層層析硅膠H與黃棕色浸膏的重量比為2 4 1 ；以CH2Cl2 CH3OH HCOOH = 30 1 1的體積比為洗脫體系，收集各管流出液，并隨時進行TLC點板跟蹤，以紫外燈下顯藍色熒光、FeCl3顯灰黑色和碘熏硅膠板無雜質三項指標為準，將Rf = 0. 5且為單一斑點的各管合并，45 50°C旋蒸至干，得到淡黃色物質， 所述淡黃色物質為咖啡酸。
2.根據權利要求1所述的提取海州香薷中抗腫瘤成份咖啡酸的方法，其特征是所述步驟3)的大孔樹脂粗分離中進行梯度洗脫時，洗脫液的流速控制在0. 5-1. 2BV/h。
3.根據權利要求1或2所述的提取海州香薷中抗腫瘤成份咖啡酸的方法，其特征是 所述步驟1)的浸泡時間為2 4天，然后再在30 50KHz的超聲強度下處理0. 5 1. 5 小時。
全文摘要
本發明公開了一種提取海州香薷中抗腫瘤成份咖啡酸的方法，依次包括以下步驟1)粗提將海州香薷花枝和葉片用乙醇浸泡等處理后，得稀浸膏；2)萃取將稀浸膏水溶后，先石油醚萃取，所得水層用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯層浸膏；3)將乙酸乙酯層浸膏采用大孔樹脂粗分離，得黃棕色浸膏；4)將黃棕色浸膏采用薄層硅膠純化精制，以CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝30∶1∶1的體積比為洗脫體系，得咖啡酸。采用本發明的方法能高得率的獲取高純度的咖啡酸。
文檔編號C07C51/42GK102249898SQ20111013627
公開日2011年11月23日 申請日期2011年5月25日 優先權日2011年5月25日
發明者張夢希, 張良, 彭紅云, 邢嚴 申請人:浙江大學