專利名稱：一種增強小分子有機物的免疫原性的方法
技術領域：
本發明涉及免疫學領域，特別涉及一種能夠增強小分子有機物的免疫原性的方法。
背景技術：
抗原是一類能刺激機體免疫系統使之產生特異性免疫應答，并能與相應的免疫應答產物在體內或體外發生特異性結合的物質。抗原具有兩種特性①免疫原性 (immunogenicity)即抗原能刺激特定的免疫細胞，使免疫細胞活化、增殖、分化，最終產生免疫效應物質(抗體和致敏淋巴細胞)的特性。②免疫反應性(immunoreactivity)即抗原與相應的免疫效應物質(抗體和致敏淋巴細胞)相遇時，可發生特異性結合而產生免疫反應的特性(又稱反應原性)。具有這兩種特性的物質稱為完全抗原(complete antigen), 又稱免疫原(imimmogen)，大多數蛋白質類抗原屬完全抗原。有些簡單的有機分子(分子量小于5. OkD的小分子有機物)，單獨存在時無免疫原性，當與蛋白質載體(carrier)結合后才有免疫原性，但單獨時能與相應的抗體結合而具有免疫反應性，這些小分子物質稱半抗原(hapten)或不完全抗原(ineomplete antigen)，如多糖、類脂、某些藥物均屬半抗原。應一些實際應用的需要，需要增強小分子有機物的免疫原性，例如2，3Dinor血栓烷B2Q，3-Dinor TxB2)是存在于尿液中的化學物質，其濃度變化具有顯著的臨床意義。 傳統的測定方法如HPLC法操作繁瑣且干擾因素多。相形之下，基于ELISA的免疫測定方法就簡單快捷的多，但是該方法必須實用高效價的單克隆或多克隆抗體，這就要求增強2， 3Dinor血栓烷B2的免疫原性。傳統的增強小分子有機物的免疫原性的方法是通過交叉連接器將其與蛋白載體 (如白蛋白)連接。現有技術中，所采用的交叉連接器有EDC、SSMCC等。然而，實踐中在很多情況下，采用EDC、SSMCC作為交叉連接器，并不能有效增強目的小分子有機物的免疫原性，這可能是由于在修飾過程中小分子有機物的抗原決定簇被破壞或掩蓋。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種能有效增強小分子有機物的免疫原性的方法。為解決以上技術問題，本發明所采用如下技術方案—種增強小分子有機物的免疫原性的方法，其采用交叉連接器將所述小分子有機物與蛋白載體連接，特別是，所述的連接器由線性聚合物在兩端修飾活性基團構成，所述線性聚合物的摩爾質量為500 10000kDa。根據本發明，所述線性聚合物優選為聚乙二醇、聚丙二醇或者環氧乙烷-環氧丙烷共聚物。優選地，所述線性聚合物的摩爾質量為500 5000kDa，更優選3000 5000kDa。活性基團可以是對于本領域所屬技術人員來說已知的各種活性基團。活性基團包括但不限于琥珀酰亞胺琥珀酸酯(NHS Ester)、亞氨酸酯(imidoesters)、馬來酰亞胺(maleimides)、芳基疊氮(ary azides)以及酰胼(Hydazides)等。線性聚合物兩端的活性基團可相同或者不同。在一個具體的實施方式中，本發明方法被用于增強2，3Din0r血栓烷B2的免疫原性，其中，所采用的線性聚合物為摩爾質量500 5000KDa的聚乙二醇，所述連接器即由該聚乙二醇在兩端修飾琥珀酰亞胺琥珀酸酯構成。可以理解，用于增強2，3Din0r血栓烷B2 的免疫原性的交叉連接器同樣也可以用于增強IldH血栓烷B2的免疫原性。在聚乙二醇，聚丙三醇或環氧乙烷-環氧丙烷共聚物的基礎上修飾活性基團是本領域所屬技術人員根據常規手段可以實現的。在此不進行詳細說明。本發明所述的小分子有機物通常為分子量小于等于5000的有機物。由于采用以上技術方案，本發明與現有技術相比具有如下優點本發明采用具有特定結構的交叉連接器，采取該連接器將小分子有機物和蛋白載體連接后，小分子有機物的抗原決定簇不容易被掩蓋，從而其免疫原性顯著增強。此外，本發明的連接器的制備也非常容易，方法簡單，成本低。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明的技術方案作進一步的描述，但本發明不應僅限于這些實施例。一種增強2，3Dinor TxB2免疫原性的方法，具體步驟如下(1)將 5mg 的 2,3Dinor TxB2 (Iml)和 IOmg(Iml)白蛋白加入一 15ml 試管中。(2)加入20mg交叉連接器(Iml)，該連接器由摩爾質量4000kDa的PEG兩端修飾了琥珀酰亞胺琥珀酸酯構成。(3)在室溫下作用2小時，使交叉連接器與2，3Dinor TxB2結合；(4)用PBS緩沖液透析2小時；(5)調節2，3Dinor TxB2與交叉連接器的結合物的濃度至大約500微克/ml。200 微升分裝于小塑料瓶中。(6)用偶聯的抗原加入適當的佐劑免疫動物制備得到特異性多克隆抗體。經檢測，所得特異性多克隆抗體的效價達到1 1000 ；作為比較，采用EDC作為交叉連接器所制備的多克隆抗體不具備特異性(效價為0)。上述實施例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人士能夠了解本發明的內容并據以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍，凡根據本發明精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種增強小分子有機物的免疫原性的方法，其采用交叉連接器將所述小分子有機物與蛋白載體連接，其特征在于所述的交叉連接器由線性聚合物在兩端修飾活性基團構成， 所述線性聚合物的摩爾質量為500 lOOOOkDa。
2.根據權利要求1所述的增強小分子有機物的免疫原性的方法，其特征在于所述線性聚合物為聚乙二醇、聚丙二醇或者環氧乙烷-環氧丙烷共聚物。
3.根據權利要求2所述的增強小分子有機物的免疫原性的方法，其特征在于所述線性聚合物的摩爾質量為500 5000kDa。
4.根據權利要求1所述的增強小分子有機物的免疫原性的方法，其特征在于所述活性基團為選擇下列基團中的一種或二種琥珀酰亞胺琥珀酸酯、亞氨酸酯、馬來酰亞胺、芳基疊氮、酰胼。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的增強小分子有機物的免疫原性的方法，其特征在于所述線性聚合物兩端的活性基團相同或者不同。
6.根據權利要求1所述的增強小分子有機物的免疫原性的方法，其特征在于所述小分子有機物為IldH血栓烷B2或2，3Dinor血栓烷B2。
7.根據權利要求6所述的增強小分子有機物的免疫原性的方法，其特征在于所述線性聚合物為摩爾質量500 5000KDa的聚乙二醇，所述交叉連接器由所述聚乙二醇在兩端修飾琥珀酰亞胺琥珀酸酯構成。
8.根據權利要求1所述的增強小分子有機物的免疫原性的方法，其特征在于所述小分子有機物的分子量范圍為小于等于5000。
全文摘要
本發明涉及一種增強小分子有機物的免疫原性的方法，其采用交叉連接器將所述小分子有機物與蛋白載體連接，特別是，所述的交叉連接器由線性聚合物在兩端修飾活性基團構成，所述線性聚合物的摩爾質量為500～10000kDa。本發明采用具有特定結構的連接器，采取該連接器將小分子有機物和蛋白載體連接后，小分子有機物的抗原決定簇不容易被掩蓋，從而其免疫原性顯著增強。此外，本發明的連接器的制備也非常容易，方法簡單，成本低。
文檔編號C07K17/08GK102295704SQ20111013268
公開日2011年12月28日 申請日期2011年5月23日 優先權日2011年5月23日
發明者王小良 申請人:蘇州良辰生物醫藥科技有限公司