專利名稱：一種從山核桃外果皮中提取核桃酮及制備核桃酮標準品的方法
一種從山核桃外果皮中提取核桃酮及制備核桃酮標準品的
方法
背景技術：
本發明屬于天然產物分離純化領域，具體涉及一種從山核桃外果皮中提取核桃酮及制備核桃酮標準品的方法。
背景技術：
山核桃(Carya cathayensis Sarg.)為山核桃屬植物，共有17個種2個變種。我國山核桃主產于浙、皖交界的天目山區，分布于浙江省臨安的昌化、于潛，淳安的臨岐、唐村，安吉的孝豐，桐廬的分水；安徽省的寧國，歙縣，旌德，績溪等縣。此外，20世紀90年代， 在安徽省大別山區的金寨縣發現連片數千畝的野生山核桃。長期以來，我國的山核桃綜合開發力度不夠，技術落后，資源利用率較低，基本以山核桃仁產品為主。其實，山核桃全身是寶，木材、樹皮、枝葉、雄花序、種蒲(外果皮)、核殼等含豐富生物活性物質，有著非常廣闊的開發利用前景。現代研究結果表明，胡桃科植物含豐富生物活性物質，有抗腫瘤、抑菌、化感、殺蟲、消炎、抗輻射、抗脂質過氧化、降血糖的作用，另外，其色素也具很好的穩定性。長期以來，山核桃外果皮一直作為廢棄物被堆放在路邊、溪旁，不僅資源浪費，而且嚴重污染環境。就環境被污染情況一直對山核桃生產產區造成負面影響。外果皮被雨水或河水浸出的汁液，對魚蝦有毒殺作用，同時，堿化了土壤，對周圍環境及生態產生嚴重破壞。近年來研究發現核桃酮(Regiolone)對癌細胞HL-60，Hela, HepG2體外毒性作用明顯，又能抑制脂多糖(LPS)和γ -干擾(IFN- γ )誘導的RAW264. 7大鼠巨噬細胞NO的生成，是一種極有開發價值的具有抗癌活性的天然產物。專利CN 101328114A公開了一種從核桃青皮中提取核桃酮的方法，該方法取原料干粉5kg，通過水或95 %乙醇提取，經石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等有機溶劑萃取，以石油醚-乙酸乙酯或石油醚-丙酮為洗脫劑，進行普通硅膠柱層析分離，再以石油醚_乙酸乙酯或石油醚_丙酮進行結晶和重結晶得到200mg核桃酮粗品。可以看出，該方法得率相當于 40 μ g粗品/g干粉，純度欠缺、產率較低，結晶和重結晶操作時間長，受溫度濕度影響較大， 而核桃酮有一定吸濕性，所以，實際應用時，該法不可取。再者，核桃皮與山核桃外果皮在原料、組成上存在差異。
發明內容
本發明提供一種從山核桃外果皮中提取核桃酮及制備核桃酮標準品的方法。本發明方法工藝簡單，方法可靠，核桃酮的收率高，穩定性好，純度高，可以達到98%以上。為實現上述目的本發明采用的技術方案如下一種從山核桃外果皮中提取核桃酮的方法，其特征在于，具體包括以下步驟(1)山核桃采收后，剝離山核桃外果皮，并將其陰干，45-55°C真空干燥，粉碎，過 55-65目篩，備用；(2)原料粉中加10-20%氨水，拌勻至濕潤；
(3)將相當于原料粉重量8-12倍的95%乙醇加入到濕潤狀原料粉中，50°C -80°C 熱回流提取2-4次，每次1-1. 5h，提取液離心分離，合并上清液，減壓濃縮至浸膏狀；(4)浸膏用1-3%鹽酸溶解，調節酸水液的pH = 2-4 ；酸水液用等體積氯仿萃取， 取氯仿層，用2-4% NaOH溶液靜置提取，取上層堿液，用10-20%鹽酸調pH = 7_9，靜置，下層氯仿層即核桃酮樣品液。利用權利要求1提取的核桃酮制備核桃酮標準品的方法，其特征在于具體步驟如下(1)制備型薄層層析將權利要求1所述的核桃酮樣品液濃縮后，制備薄層層析，刮下核桃酮所在部位的硅膠，然后索氏抽提，真空干燥得核桃酮粗品，制備薄層層析所用的展開劑氯仿、甲醇、氨水的混合液，其各組分的體積比為氯仿甲醇氨水= (62-68) (0.8-1.2) 1，索氏抽提溫度 80°C _100°C ；(2) C18反相柱層析將C18硅膠用甲醇充分浸泡脫氣后，重力沉降法裝柱，用甲醇充分洗出雜質后，再用20-40%乙腈水溶液平衡，將步驟(1)所述的核桃酮粗品溶解于甲醇后上柱，并用20-40%乙腈洗脫，層析過程在常溫常壓下進行，其中，核桃酮粗品與甲醇的質量體積(g/ml)比為 1 (20-40)；(3)洗脫液精制處理分段收集核桃酮粗品洗脫液，將HPLC檢測純度大于95%的流份合并，氮吹去凈溶劑，即得核桃酮標準品。所述的制備核桃酮標準品的方法，其特征在于所述步驟(3)中HPLC檢測純度的流動相為乙腈水溶液，其中乙腈與水的體積比=15 85，檢測波長258-261nm，柱溫 24-26 "C。所述的制備核桃酮標準品的方法，其特征在于步驟(1)制備薄層層析所用的硅膠板為制備型GF254硅膠板。與現有技術相比，本發明的優點在于(1)利用山核桃外果皮為原料提取核桃酮，資源豐富，可以起到廢物利用的效果；(2)提取分離工藝簡單，萃取溶劑為氯仿，易于回收；方法可靠，利用制備薄層層析和C18反相柱層析，采用適宜展開劑和洗脫劑，最大限度選擇性的將核桃酮析出。(3)核桃酮的收率高，穩定性好，得率為350μ g/g。(4)核桃酮的純度高，純度可以達到98%以上。終產品穩定性好。本發明以山核桃外果皮為原料，為綜合利用山核桃資源提供理論和實際應用依據，本發明在工業化實施后，將對促進山核桃產業發展、對山核桃資源深度開發等方面具有積極意義。
具體實施例方式現以實驗室實施為例，非限定實施例敘述如下將陰干的山核桃外果皮，50°C真空干燥，粉碎，過60目篩(孔徑0.25mm)。取600g 原料粉中加入濃度為10-20%的氨水，拌勻至濕潤，再加入6kg95%的乙醇，50°C _80°C下熱回流提取4次，每次1. 5h，提取液離心(3500r/min，15min)，合并上清液，減壓濃縮至浸膏狀。浸膏用300mL 1-3%鹽酸溶解，得酸水液(調pH = 2-4)；酸水液用300mL氯仿萃取，取下層氯仿層，用300mL 2-4% NaOH提取靜置，取上層堿水液，用10-20%鹽酸調pH = 7-9,靜置，下層氯仿層即樣品液。樣品液濃縮至2mL，采用制備型GF254硅膠板，微量移液器移取2μ L樣品液點于薄板近底端處，電吹風吹干。將點好樣的薄板放在密閉展缸中，上行展開，電吹風吹干。以氯仿甲醇氨水的體積比為65 1 1的混合液為展開劑展開，用碘蒸氣顯色，刮下核桃酮所在部位的硅膠，80°C-100°C索氏抽提，真空干燥為紅色核桃酮粗品。將Cw硅膠用甲醇(色譜級)充分浸泡脫氣后，重力沉降法裝成500X25mm的柱。用甲醇充分洗出雜質后，再用20%乙腈水溶液平衡。將經制備薄層層析初步純化的粗品，溶解于aiil甲醇后上柱，并用20-40%乙腈洗脫，層析過程在常溫常壓下進行。收集核桃酮粗品洗脫液，20ml/份，收集30份，待HPLC測定各段流份純度。分段收集核桃酮粗品洗脫液，將 HPLC檢測(流動相條件為乙腈水=15 85(V V)為流動相；檢測波長260nm ；柱溫 250C )，純度大于95%的19 25號流份合并，氮吹去凈溶劑，即得核桃酮標準品，測得純度為 98. 1%，產率為 350μ g/g。
權利要求
1.一種從山核桃外果皮中提取核桃酮的方法，其特征在于，具體包括以下步驟(1)山核桃采收后，剝離山核桃外果皮，并將其陰干，45-55°C真空干燥，粉碎，過55-65 目篩，備用；(2)原料粉中加10-20%氨水，拌勻至濕潤；(3)將相當于原料粉重量8-12倍的95%乙醇加入到濕潤狀原料粉中，50°C-80°C熱回流提取2-4次，每次1-1. 5h，提取液離心分離，合并上清液，減壓濃縮至浸膏狀；(4)浸膏用1-3%鹽酸溶解，調節酸水液的pH= 2-4 ；酸水液用等體積氯仿萃取，取氯仿層，用2-4% NaOH溶液靜置提取，取上層堿液，用10-20%鹽酸調pH = 7_9，靜置，下層氯仿層即核桃酮樣品液。
2.利用權利要求1提取的核桃酮制備核桃酮標準品的方法，其特征在于該純化方法包括制備薄層層析、C18反相柱層析、洗脫液處理等步驟(1)制備型薄層層析將權利要求1所述的核桃酮樣品液濃縮后，制備薄層層析， 刮下核桃酮所在部位的硅膠，然后索氏抽提，真空干燥得核桃酮粗品，制備薄層層析所用的展開劑氯仿、甲醇、氨水的混合液，其各組分的體積比為氯仿甲醇氨水= (62-68) (0.8-1.2) 1，索氏抽提溫度 80°C _100°C ；(2)C18反相柱層析將C18硅膠用甲醇充分浸泡脫氣后，重力沉降法裝柱，用甲醇充分洗出雜質后，再用20-40%乙腈水溶液平衡，將步驟(1)所述的核桃酮粗品溶解于甲醇后上柱，并用20-40%乙腈洗脫，層析過程在常溫常壓下進行；(3)洗脫液處理精制分段收集核桃酮粗品洗脫液，將HPLC檢測純度大于95%的流份合并，氮吹去凈溶劑，即得核桃酮標準品。
3.根據權利要求2所述的制備核桃酮標準品的方法，其特征在于所述步驟(3) 中HPLC檢測純度的流動相為乙腈水溶液，其中乙腈與水的體積比=15 85，檢測波長 258-26 lnm，柱溫 24-26 °C。
4.根據權利要求2所述的制備核桃酮標準品的方法，其特征在于步驟(1)制備薄層層析所用的硅膠板為制備型GF254硅膠板。
全文摘要
本發明提供了一種從山核桃外果皮中提取核桃酮及制備核桃酮標準品的方法。首先將山核桃外果皮粉碎，用氨水濕潤，再加入95％乙醇溶液，熱回流提取，提取物再用氯仿萃取，得核桃酮樣品液，再對樣品液濃縮后，采用制備薄層層析純化得到核桃酮粗品，用C18反相柱層析進一步純化粗品，分段收集核桃酮粗品洗脫液，將HPLC檢測純度大于95％的流份合并，氮吹去凈溶劑，即得核桃酮標準品。本發明方法，提取工藝簡單，核桃酮的收率高，純度高，以山核桃外果皮為原料，為綜合利用山核桃資源提供理論和實際應用依據，具有變廢為寶的效果。
文檔編號C07C45/78GK102219664SQ20111010475
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月26日 優先權日2011年4月26日
發明者丁之恩, 屈曉清, 王敏麗, 王曉燕 申請人:安徽農業大學