專利名稱：植物耐逆性相關蛋白MtMYB1及其編碼基因和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因工程領域，尤其涉及一種植物耐逆性相關蛋白MtMYBl及其 編碼基因和應用。
背景技術：
在非生物脅迫條件下，高等植物細胞會積極地調動體內的防衛系統，從感知到信 號傳導，到信號傳遞到細胞核的轉錄因子，轉錄因子再作用于功能基因，啟動逆境應答基因 的表達，合成新的蛋白、代謝發生轉變，抗逆性滲透調節物質積累等變化，最終達到提高植 物抗逆性的目的。環境中生物因素和非生物因素嚴重制約著植物的生長發育，其中高鹽、 干旱、低溫、臭氧、輻射及重金屬等非生物脅迫已成為主要的影響因素，這些非生物脅迫造 成糧食作物減產量高達50%。植物通過長期的進化，形成了一系列完善的逆境脅迫應答機 制，包括細胞水平的耐受和植株整體水平的協同應答。刺激信號由細胞膜上的受體感知，激 活PLC，水解PIP2產生IP3和DAG。細胞質中Ca+濃度上調，將信號被Ca+受體感知。Ca+受 體激活下游蛋白激酶、蛋白磷酸酶，通過磷酸化和去磷酸化調節轉錄因子的表達，或直接激 活轉錄因子表達。一個轉錄因子能調控下游多個同源響應基因，進一步調節效應蛋白的功 能。通過逆境信號傳遞通路的一系列級聯反應，把刺激信號不斷傳遞和放大，最終做出應答 反應。由于具有基因組小、染色體數為2X8(2n = 16)、生長期短、自花授粉、根瘤固氮、 遺傳轉化效率高、與豆科主要作物親緣關系較近等特點，截型苜蓿被選作豆科模式植物，成 為研究豆科植物的熱點。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種植物耐逆性相關蛋白及其編碼基因。本發明提供的蛋白質，命名為MtMYBl，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且與植物耐逆性相關的由序列2衍生的蛋白質。上述序列2由272個氨基酸殘基組成。所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。編碼所述蛋白的基因也是本發明保護的范圍。所述基因為如下1)或2)或3)所示的基因
1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼植物耐逆性相關蛋白的DNA分 子；3)與1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼植物耐逆性相關蛋白的DNA 分子。
所述嚴格條件為在6 X SSC，0.5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。序列表中序列1由819個核苷酸組成，其中1-819位核苷酸為編碼區，第817-819 位是終止密碼子。含有所述基因的重組表達載體、重組菌、轉基因細胞系或表達盒也是本發明保護 的范圍。所述重組表達載體為將所述的基因插入載體PCAMBIA1302的Nco I和Spe I酶切 位點之間得到的載體。擴增所述的基因全長或任一片段的引物對也是本發明保護的范圍，所述引物對中 的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列3，所述引物對中的另一條引物的核苷酸序列 為序列表中的序列4。本發明的另一個目的是提供一種培育耐逆的轉基因植物的方法。本發明提供的方法是將所述的基因導入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植 物的轉基因植物。 所述編碼基因是通過所述重組表達載體導入所述目的植物中。所述耐逆性為耐旱性和/或耐鹽性。所述植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物優選為擬南芥，如 Columbia生態型擬南芥。本發明的實驗證明，本發明篩選到的一個鹽誘導后表達量顯著上調的轉錄因子 MtMYBl，將該基因導入擬南芥，經過潮霉素初篩、分子檢測、鹽脅迫和干旱脅迫等手段，篩選 到抗鹽和抗干旱能力提高的轉基因擬南芥株系，將該基因導入經濟作物苜蓿等豆科作物將 對培育耐鹽耐干旱的轉基因豆科作物有重要價值。
圖1為MtMYBl在酵母中的轉錄活性分析圖2為MtMYBl在洋蔥表皮中的亞細胞定位分析圖3為載體pCAMBIA1302_MtMYBl構建流程4為T1代轉基因擬南芥的分子水平檢測圖5為T3代轉基因擬南芥的分子水平檢測圖6為T3代轉基因擬南芥NaCl脅迫下的萌發率統計7為T3代轉基因擬南芥生長后期干旱脅迫下的存活率統計圖
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。以下實施例中的定量試 驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。截型苜蓿(Medicagotruncatula) A17 購自法國 INRA BRC-MTR =Biological Resource Centre for the model species Medicago truncatula L. 0
擬南芥(Arabidopsis thaliana，columbia-o生態型，以下稱為野生型擬南芥。) 購自salk公司。農桿菌EHA105記載在抗生素抑制農桿菌的效果及對條斑紫菜生長發育的影響， 王萍等，水產科學，200928 (7)，中，公眾可從中國農業大學獲得。實施例1、MtMYB 1基因的克隆1、MtMYBl基因的獲得在鹽脅迫截型苜蓿A17后的芯片篩選中發現這一表達量顯著上調的基因，為了研 究這一基因在非生物脅迫中的功能，截型苜蓿A17的4周齡苗澆250mMNaCL水溶液一小時， 提取RNA，反轉錄得到cDNA，以截型苜蓿A17的cDNA為模板，以MtMTOl_5，和MtMTOl_3，為 引物，進行PCR擴增，得到PCR產物，將PCR產物插入pMD18T-simple載體(購自TaKaRa生 物工程公司)，得到重組載體，測序結果表明，該PCR產物具有序列表中序列1的核苷酸，該 PCR產物的基因命名為MtMYBl，該基因的編碼區為序列表中序列1自5’端第1-819位所示 的核苷酸，該基因編碼的蛋白命名為MtMYBl，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2，將 含有該基因的重組載體命名為pMD 18T-s imp 1 e-MtMYB 1。由hvitrogen公司合成特異性引物對MtMYB 1_5，5，-ATGGCAAGAACTCCTTCTTGTGACAAAAAA-3，(序列 3)；MtMYB 1_3，5，-TCAACTCCAAATATCCTTGTCATATACTAT-3，(序列 4)。也可人工合成序列1，采用相同的方法構建得到pMD18T-simple-MtMYBl。2、酵母系統中MtMTOl的轉錄活性分析以pMD18T-simple-MtMYBl為模板，用分別含有EcoR I和Ml I酶切位點的引物 5，-GAATTCATGGCAAGAACTCCTTCTTG 與 3，-GTCGACTCAACTCCAAATATCCTTGT 進行 PCR 擴增， 得到PCR產物。將該PCR產物經EcoR I和Ml I酶切，回收片段，與經過同樣酶切的載 體pBDGAL4(Liao Y, Zou HF, Wang HW, Zhang WK, Ma B, Zhang JS, Chen SY (2008)Soybean GmMYB76, GmMYB92, and GmMYB177 genes confer stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants. Cell Res 18 :1047_1060，公眾可從中國農業大學獲得)連接，將 連接產物轉化酵母菌株 YRG2 (Liao Y, Zou HF, Wang HW, Zhang WK, Ma B, Zhang JS, Chen SY (2008)Soybean GmMYB76, GmMYB92, and GmMYB177 genes confer stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants. Cell Res 18 :1047-1060,公眾可從中國農業大學獲 得)，將轉化產物涂布在缺色氨酸的SD培養基中，生長的即為陽性克隆。同時轉化pGAL4(作 為 CK+，載體來源與 pBDGAL4 相同，記載在 Liao Y, Zou HF，Wang HW, Zhang WK, Ma B, Zhang JS,Chen SY(2008)Soybean GmMYB76,GmMYB92,and GmMYB177 genes confer stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants. Cell Res 18 :1047-1060,公眾可從中國 農業大學獲得)、PBDGAL4空載體(作為CK-)到酵母菌株YRG2。將陽性克隆涂在同時缺色氨酸、組氨酸的培養基平板上生長。同時利用X-Gal對 β -半乳糖苷酶酶活性檢測。結果如圖1所示，其中SD/-Trp-His為同時缺色氨酸、組氨酸 的SD培養基、SD/-Trp培養基為缺色氨酸的SD培養基，CK+為轉有pGAL4的酵母，CK-為轉 有pBDGAL4的酵母，陽性克隆能在SD/-Trp-His培養基平板上生長，X-Gal對β -半乳糖苷 酶酶活性檢測呈陽性。說明，MtMYBl具有轉錄激活活性。3、在洋蔥表皮中MtMTOl的亞細胞定位分析
擴增MtMYBl基因全長開放閱讀框(ORF)，引物分別含有Β ο I和Kpn I酶切位點， 即 5，-CTCGAGGATGGCAAGAACTCCTTCTTG 與 3，-GGTACCCACTCCAAATATCCTTGTCAT ；擴增片段插 入到載體E3025(靳靜晨，煙草中依賴于NAD〈’ +>的山梨醇脫氫酶基因的克隆及功能的初 步，河南農業大學2008屆碩士學位論文，2008，28-32,公眾可從中國農業大學獲得)的相應 位點上，得到融合質粒。利用基因槍的方法將融合質粒轟擊洋蔥表皮，以空載體E3025 (含有GFP基因)作 為對照，在共聚焦顯微鏡下觀察，結果如圖2所示，說明MtMYBl定位于細胞核。實施例2、轉MtMYBl擬南芥的獲得及其功能研究l、pCAMBIA1302_MtMYBl組成型高效表達載體的構建hvitrogen公司合成分別含有Nco I和SPe I酶切位點的特異性引物對5，-CCATGGCAAGAACTCCTTCTTGTGACAAAAAA-3，(序列 5)5，-ACTAGTTCAACTCCAAATATCCTTGTCATATA-3，(序列 6)以pMD18T-simpIe-MtMYBl為模板，以序列5所示的DNA分子和序列6所示的DNA 分子為引物，擴增得到含有Nco I和Spe I酶切位點的片段，該片段與經同樣酶切過的載體 pCAMBIA1302(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriclture,www. cambia. org)連接，連接產物轉化大腸桿菌，得到轉化子，提取轉化子的質 粒，測序，結果為該質粒為將序列表中的序列1插入PCAMBIA1302的NcoI和Spe I酶切位 點間得到的載體，將該質粒命名為pCAMBIA1302-MtMYBl，該質粒的詳細構建見圖3。2、農桿菌 EHA105/pCAMBIA1302-MtMYBl 的獲得1)EHA105感受態細胞的制備挑取農桿菌EHA105單菌落接種于100ml Y^液體培養基中，220rpm 振蕩培 養至OD600 = 0 . 5 ；轉入無菌離心管，5000rpm離心5min，去上清，加入IOml預冷的0. 15M的 CaCl2溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置20min ；4°C，5000rpm離心5min，去上清，加入4ml預冷 的含10%甘油的0. 15M的CaCl2溶液，輕輕懸浮；農桿菌懸浮液分裝于無菌印pendorf管 中，每管200 μ 1于液氮中速凍lmin，凍存于-70°C，得到ΕΗΑ105感受態細胞。2)表達載體轉化農桿菌EHA105取1μ g上述獲得的表達載體pCAMBIA1302-MtMYBl加入到200 μ 1EHA105感受 態細胞中，混勻，靜止5min ；液氮中速凍lmin，37°C水浴5min，加入Iml YEB液體培養基， 280C 150rpm振蕩培養4h ；5000rpm離心3min，棄上清，加入0. Iml YEB液體培養基，重新懸 浮細胞；涂布于含50 μ g/ml Kan和50 μ g/ml利福平的YEB固體平板上，培養約48h， 得到轉化子。將轉化子進行菌液PCR鑒定，引物為序列5所示的DNA分子和序列6所示的DNA 分子，得到827bp的片段為陽性克隆。將陽性克隆提取質粒測序，測序結果進一步證明為 陽性克隆，載體pCAMBIA1302-MtMTOl已經成功轉入農桿菌中，將陽性克隆命名為EHA105/ pCAMBIA1302-MtMYBl。3、轉MtMYBl擬南芥的獲得將EHA105/pCAMBIA1302-MtMYBl 接種于 IOml 含 50 μ g/mlKan 和 50 μ g/ml 利福平 的YEP液體培養基中J8°C，220rpm振蕩培養過夜；轉化前一天以1 50比例濃度接種于 200ml含相同抗生素的YEP培養基中擴大培養至0D_為1. 6,5000rpm, IOmin離心集菌，重懸于滲入緩沖液(新制的5%蔗糖溶液)，使OD6tltl為0. 8 ；可采用dip法將農桿菌轉 化花蕾期的野生型擬南芥。可以在擬南芥抽苔5cm時剪去頂端花序，促使腋生花序生長，以 得到更多的花序，剪時傷口應位于最高的莖生葉上方，約5天后進行轉化，轉化前要使土壤 充分濕透且將已經開放的花朵去掉，只保留未開放的小花蕾；轉化時將擬南芥整株與花盆 一起倒扣在盛有菌液及0. 05% Silwet L-77的容器中浸泡1. 5-aiiin，浸泡完畢后，取出花 盆，側放于托盤中，黑暗培養16小時，再直立花盆恢復正常的光照培養，得到Ttl代轉MtMYBl 擬南芥，從Ttl代轉MtMYBl擬南芥收獲種子，即為T1代轉MtMYBl擬南芥的種子。4、轉MtMYBl擬南芥的篩選1)潮霉素篩選收獲T1代轉MtMYBl擬南芥的種子后，播種于含80mg/L Hyg+的MS固體平板上， 4°C春化72小時，置22°C全日照光照培養箱中正置培養5天，觀察表型，轉化體表現為真葉 呈深綠色，且明顯高于非轉化體，獲得了 5個T1代轉基因株系。將篩選到的轉化體移至不 含抗生素的MS培養基中復壯，4天后將綠色的幼苗轉到土壤中繁種，收獲T2代轉MtMYBl擬 南芥種子。同樣的方法篩選T2代，得到T3代轉MtMYBl擬南芥種子，播種，得到5個株系T3 代轉MtMYBl擬南芥。2)分子檢測提取T1代轉擬南芥的基因組DNA，并以其作為模板，用序列5所示的DNA分子和序 列6所示的DNA分子為引物，得到827bp的目的片段，說明獲得了 MtMYBl轉基因擬南芥。采用同樣的方法將空載體pCAMBIA1302轉入野生型擬南芥中，得到T1代轉空載體 擬南芥種子，播種T1代轉空載體擬南芥，提取基因組DNA，用序列5所示的DNA分子和序列 6所示的DNA分子為引物，沒有目的片段，說明得到的為T1代轉空載體擬南芥，從T1代收獲 T2代種子，從T2代植株收獲T3代種子，從T3代種子播種，得到T3代轉空載體擬南芥。反應體系
權利要求
1.一種蛋白質，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加 且與植物耐逆性相關的由序列2衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼植物耐逆性相關蛋白的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼植物耐逆性相關蛋白的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.如權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體是將權利要求2 或3所述基因插入PCAMBIA1302的多克隆位點得到的載體。
6.擴增權利要求2或3所述基因的全長或其任意片段的引物對，所述引物對中的一條 引物的核苷酸序列為序列表中的序列3，所述引物對中的另一條引物的核苷酸序列為序列 表中的序列4。
7.一種培育耐逆的轉基因植物方法，是將權利要求2或3所述基因導入目的植物中，得 到耐逆性高于所述目的植物的轉基因植物。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于權利要求2或3所述基因通過權利要求4或 5所述重組表達載體導入所述目的植物中。
9.如權利要求7或8所述的方法，其特征在于所述耐逆性為耐旱性和/或耐鹽性。
10.如權利要求7至9中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物單子葉植物或雙 子葉植物。
全文摘要
本發明公開了一種植物耐逆性相關蛋白MtMYB1及其編碼基因和應用。本發明提供的蛋白質，命名為MtMYB1，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列2衍生的蛋白質。本發明的實驗證明，本發明篩選到的一個鹽誘導后表達量顯著上調的轉錄因子MtMYB1，將該基因導入經濟作物苜蓿等豆科作物將對培育耐鹽耐干旱的轉基因豆科作物有重要價值。
文檔編號C07K14/415GK102146128SQ20111009099
公開日2011年8月10日 申請日期2011年4月12日 優先權日2011年4月12日
發明者張運芹, 王濤, 胡曉娜, 董江麗 申請人:中國農業大學