一類新的納米金復合底物T-Au的制備和用途的制作方法

專利名稱：一類新的納米金復合底物T-Au的制備和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一類納米金復合底物T-Au的制備及其在分子檢測等領域的用途。
背景技術：
納米金原指直徑在I-IOOnm尺寸的微小金顆粒，一般以分散在水中溶膠形式存在，因此通常稱為膠體金。膠體金具有表面積效應，小尺寸效應，微觀量子隧道效應等獨特的物理化學性質以及良好的生物相容性，非常適合于生物大分子的標記和檢測。膠體金用于生物檢測已有近一個世紀的歷史，上世紀八十年代初免疫金銀染色(immuno-gold-siver staining, IGSS)技術的出現是膠體金應用于生物技術的里程碑。該技術首先用膠體金標記待測抗體或抗原，然后在體系中引入銀離子。小尺寸效應使膠體金顆粒具有很強的催化還原作用，可以將周圍的銀離子還原成銀顆粒；而銀顆粒又可以催化還原周圍的銀離子。這種級聯瀑布催化作用使得銀顆粒越聚越多，緊緊包裹膠體金顆粒積聚成團狀銀殼，形成幾乎肉眼可見的黑色顆粒，用普通的電鏡甚至肉眼即可觀測。IGSS的檢測成本遠低于熒光檢測和化學發光檢測，與色原檢測相比又顯著提高了靈敏度，因此很快得到廣泛應用。膠體金存在一些固有的缺點顆粒大小不一、易凝集、與生物分子以靜電吸附結合，標記不穩定并且假陽性率高等。為了克服這些缺點，近年來美國Nanoprobes公司開發了一種新型的納米金顆粒并命名為“Nanogold”，該顆粒是以一個包含大約67個金原子簇化合物為核心的復合體，通過位于其表面的金原子與三芳基磷配基或鹵化物離子結合而形成穩定的納米金分子，其中心粒徑僅1.4·，表面不帶電荷，在溶液中程離散狀態。這種新型的納米金與膠體金相比有諸多優點(1)顆粒小而且均勻一致、標記密度高、穿透性好; (2)經過特定基團修飾后可以與生物大分子以共價鍵結合，使得標記分子高度穩定；(3)顆粒表面不帶電荷，因此不易凝集，適用于很寬的PH值范圍和離子強度等等。由于Nanogold 有如此多的優點，因此迅速應用于原位雜交、免疫組化、Western等生物檢測眾多領域。生物芯片包括基因芯片、蛋白芯片和組織芯片等，是一項集合了生命科學、微電子學、物理學、化學和材料科學等眾多學科的生物高新技術，是高效大規模獲取核酸蛋白質等生物信息的重要手段，在基因表達譜研究、疾病分子檢測和大規模藥物篩選等眾多領域具有廣闊的應用前景。熒光檢測法是生物芯片的常規檢測方法，即熒光色素化合物(Cy3、Cy5 等)直接或間接標記在核酸或蛋白質分子上，產生的熒光信號采用激光共聚焦掃描檢測。 該方法的最大缺點是檢測儀器價格昂貴，從而限制了生物芯片的推廣和應用，尤其是在中小型醫療機構的推廣和應用。為了解決這個問題，近幾年已經有研究小組將IGSS技術應用于基因芯片和蛋白芯片的可視化檢測，從而避免使用熒光掃描儀，大幅降低了檢測成本。其中基因芯片金標銀染檢測方法已經獲得國家專利(一種基因芯片的納米金標記銀染檢測方法，ZL專利號02113147.幻。該方法的缺點是檢測靈敏度不高，不能完全滿足疾病分子檢測領域的要求，進一步提高可視化檢測靈敏度是生物芯片推廣應用中面臨的重要課題。為了提高可視化檢測靈敏度，本實驗室將免疫組化中廣泛應用的TSA技術與IGSS 相結合應用于生物芯片的檢測。TSA(tyramine signal amplification，酪胺信號放大)由Bobrow等人于1989年首次提出的。信號放大分子酪胺是一個酚基化合物，可以作為HRP的作用底物。TSA的原理是在辣根過氧化物酶的催化下，大量連接半抗原的酪胺分子沉積。以基因芯片為例，TSA-IGSS的檢測過程如下首先將點制了探針陣列的基因芯片與待檢核酸樣本雜交，然后依次加入鏈酶親和素標記的HRP、生物素標記的酪胺、鏈酶親和素標記的納米金。最后加入銀增強試劑顯色。TSA-IGSS比IGSS的檢測靈敏度提高10-100倍，目前已經申請專利(一種基因芯片的TSA-納米金標記銀染檢測法，專利號200610135832. χ)。該方法的缺點是檢測過程相對比較繁瑣，能夠找導致納米金直接沉積的新的HRP底物是目前所需要解決的問題。

發明內容
本發明的目的利用化學方法，提供一類能使HRP直接催化納米金顆粒沉積，從而顯著提高金標記銀染色可視化檢測靈敏度的納米金復合底物T-Au。本發明的另一目的在于提供所述的納米金復合底物T-Au的制備方法。本發明的另一目的在于提供所述的納米金復合底物T-Au在生物芯片等分子檢測領域的用途。本發明的目的是通過如下技術方案實現的。本發明提供的能使HRP直接催化納米金顆粒沉積的納米金復合底物T-Au，該復合底物是Nanogold-NHS的NHS基團與化合物T形成酰胺鍵而得到的復合物。本發明提供所述的納米金復合底物T-Au的制備方法，包括如下步驟1)制備取定量的Nanogold-NHS以DMF溶解，配制成lnmol/ μ L溶液；取化合物 T以DMF溶解，配制成0. lnmol/μ L溶液、；將上述兩種溶液混合，室溫避光反應濁。即可得到納米金復合底物T-Au。2)保存產物溶液以1 50稀釋(稀釋液lXPBS+0. 5%BSA+0. 05%吐溫+0. 5%
硅膠)，稀釋液4°C保存。本發明提供所述納米金復合底物T-Au的用途。將T-Au應用于基因芯片和蛋白芯片的可視化檢測并比較與IGSS、TSA-IGSS的檢測靈敏度。本發明提供的納米金復合底物T-Au的優勢納米金復合底物T-Au制取方法簡單， 產物稀釋后即可使用，HRP可直接催化納米金復合底物T-Au從而導致大量納米金顆粒沉積，與IGSS以及TSA-IGSS檢測方法比較，該復合底物既可以實現生物芯片的高靈敏度可視化檢測，又簡化了操作步驟并且有利于實際操作。


圖1 為納米金復合底物T-Au的結構示意圖。圖2 化合物T的結構示意圖。圖3 :Tyr-Cy3熒光檢測，T_Au、TSA_IGSS、IGSS可視化檢測靈敏度比較結果及點陣布局。① IgGdOy g/mL)；② IgGQy g/mL)；③ IgG(0· 4 μ g/mL)；④ IgG (0· 08 μ g/mL)；圖4 =T-Au用于蛋白芯片可視化檢測結果及點陣布局。
IgG陽性對照；①BSA ； ②百日咳FHA ；③腮腺炎病毒NP蛋白。圖5 =T-Au用于基因芯片可視化檢測結果及點陣布局。 和①為標志列；②鼠疫桿菌特異性探針片斷。圖6 =Tyr-Cy3熒光檢測與T-Au可視化檢測比較結果及點陣布局。 和①為標志列；②和③炭疽桿菌特異性探針片斷。圖7:化合物T(酪胺，C12，C18，C24)與納米金偶聯所形成的幾種納米金復合底物可視化檢測靈敏度比較結果及點陣布局。①IgG(10yg/mL)；②IgGQy g/mL)； ③ IgG(0. 4μ g/mL)；④ IgG (0. 08 μ g/mL)；⑤ IgG (0. 016μ g/mL)。圖8 =IGSS, T-Au, TSA-IGSS蛋白芯片可視化檢測流程圖。 圖9 :9a,9b,9c和9d為化合物T的結構式。
具體實施例方式實施實例1.納米金復合底物T-Au的制備和保存1)制備取定量的Nanogold-NHS以DMF溶解，配制成lnmol/ μ L溶液；取化合物 T以DMF溶解，配制成0. lnmol/μ L溶液；將上述兩種溶液混合，室溫避光反應濁。即可得到納米金復合底物T-Au。2)保存產物溶液以1 50稀釋(稀釋液lXPBS+0. 5%BSA+0. 05%吐溫+0. 5%
硅膠)，稀釋液4°C保存。2.納米金復合底物T-Au用于可視化檢測靈敏度評價1) Tyr-Cy3熒光檢測，IGSS、TSA-IGSS、T-Au可視化檢測靈敏度比較芯片制備在醛基修飾的玻璃片上點制不同濃度的IgG(10yg/mL，2yg/mL， 0.4yg/ml,0. 08 μ g/mL)，在4°C下放置12h后用封閉液(1 XPBS+25%小牛血清)封閉2h， 然后用PBST(lXPBS+0. 5%吐溫)洗三次晾干，4°C保存備用。Tyr-Cy3熒光檢測流程取已制備好的芯片依次加入HRP標記的抗人IgG抗體(二抗，1 5000)和Tyr-Cy3 (1 500)，每步反應條件為37°C溫育30min并用PBST洗滌三次， 熒光掃描顯色觀察結果。IGSS的檢測流程取已制備好的芯片加入Nanogold標記的抗人IgG抗體(二抗， 1 500)37°C溫育30min并用PBST洗滌三次，然后加入銀增強試劑(A液+B液)顯色。TSA-IGSS的檢測流程取已制備好的芯片依次加入HRP標記的抗人IgG抗體(二抗，1 5000)、生物素標記的酪胺(1 500)、鏈酶親和素標記的Nanogold(1 50)，每步反應條件為37°C溫育30min并用PBST洗滌三次，然后加入銀增強試劑(A液+B液)顯色。T-Au的檢測流程取已制備好的芯片依次加入HRP標記的抗人IgG抗體(二抗， 1 5000)和T-Au (1 400)，每步反應條件為37°C溫育30min并用PBST洗滌三次，然后加入銀增強試劑(A液+B液)顯色。結果顯示納米金復合底物T-Au可視化檢測靈敏度與Tyr_Cy3熒光檢測、TSA-IGSS 可視化檢測靈敏度相當，比IGSS可視化檢測靈敏度高(10-20)倍3.納米金復合底物T-Au蛋白芯片檢測中的應用芯片制備在醛基修飾的玻璃片上點制I gG (10 μ g/mL)陽性對照；白喉毒素 (50 μ g/mL)；百日咳 FHA(125 μ g/mL)；風疹病毒 El 蛋白(0. 5mg/mL) ；HBsAg(0. 5mg/mL)； 乙腦病毒E蛋白(lmg/mL)；腮腺炎病毒NP蛋白(lmg/mL) ；BSA(lmg/mL)陰性對照。在4°C下放置12h后用封閉液(1 X PBS+25 %小牛血清)封閉2h，然后用PBST (1 X PBS+0. 5 %吐溫)
洗三次晾干4°C保存備用。蛋白芯片檢測流程取已制備好的芯片依次加入樣本血清(1 5稀釋)、HRP標記的抗人IgG抗體(二抗，1 5000) ,T-Au (1 400)，每步反應條件為37°C溫育30min并用 PBST洗滌三次，然后加入銀增強試劑(A液+B液)顯色。結果顯示納米金復合底物T-Au可應用于蛋白芯片可視化檢測，并且可以同時檢測血清中的不同抗體。5.納米金復合底物T-Au基因芯片檢測中的應用在醛基修飾的玻璃片上點制相應探針微陣列，在4°C干燥環境下放置24h后備用。 取已制備好的基因芯片與鼠疫桿菌核酸樣本擴增PCR產物雜交(用于擴增的模板濃度為 104CFU/mL，引物生物素標記)，于45°C雜交反應lh，處理之后備用。檢測流程取已雜交好的芯片加入HRP標記鏈酶親和素(1 500)37°C溫育30min 后用PBST洗滌三次，然后加入T-Au (1 400) 37°C溫育30min后用PBST洗滌三次，加入銀增強試劑(A液+B液)顯色。6.基因芯片Tyr-Cy3熒光顯色與納米金復合底物T-Au可視化顯色比較在醛基修飾的玻璃片上點制相應探針微陣列，在4°C干燥環境下放置24h后備用。 取已制備好的基因芯片與炭疽桿菌核酸樣本擴增PCR產物雜交(用于擴增的模板濃度為 104CFU/mL，引物生物素標記)，于45°C雜交反應lh，處理之后備用。Tyr-Cy3熒光檢測流程取已雜交好的基因芯片加入HRP標記鏈酶親和素 (1 500)37°C溫育30min后用PBST洗滌三次，然后加入Tyr-Cy3(l 500)，37°C溫育 30min后用PBST洗滌三次，熒光掃描顯色觀察結果。納米金復合底物T-Au用于基因芯片可視化檢測流程取已雜交好的基因芯片加入HRP標記鏈酶親和素(1 500)37°C溫育30min后用PBST洗滌三次，然后加入 T-Au (1 400)，37°C溫育30min后用PBST洗滌三次，然后加入銀增強試劑(A液+B液)顯色。7.化合物T (酪胺，C12，C18，C24)與納米金偶聯所形成的幾種納米金復合底物可視化顯色靈敏度比較化合物T (C12，C18，C24)的合成化合物T(C12)的合成取137mg酪胺以乙腈溶解，取己二酸活潑酯408mg以二氯甲烷溶解，取23aiig己二胺以甲醇溶解。將酪胺溶液滴加到己二酸活潑酯溶液中室溫反應池。將反應產物溶液滴加到己二胺甲醇溶液中，室溫反應池，停止反應，將產物柱層析(乙酸乙酯甲醇，4 1 ；Rf = 0. 5)分離純化即可得化合物T (C12)。化合物T(ClS)的合成取137mg酪胺以乙腈溶解，取十二烷二酸活潑酯508mg以二氯甲烷溶解，取23aiig己二胺以甲醇溶解。將酪胺溶液滴加到十二烷二酸活潑酯溶液中室溫反應2h。將反應產物溶液滴加到己二胺甲醇溶液中，室溫反應池，停止反應，將產物柱層析(乙酸乙酯甲醇，5 I5Rf = 0. 4)分離純化即可得化合物T(ClS)。化合物T(C24)的合成取137mg酪胺以乙腈溶解，取十二烷二酸活潑酯508mg以二氯甲烷溶解，取400mg十二烷二胺以甲醇溶解。將酪胺溶液滴加到十二烷二酸活潑酯溶液中室溫反應池。將反應產物溶液滴加到己二胺甲醇溶液中，室溫反應池，停止反應，將產物柱層析(乙酸乙酯甲醇，5 I5Rf = 0. 6)分離純化即可得化合物T (C24)。納米金復合底物T-Au (酪胺，C12，C18，C24)的制備取定量的Nanogold-NHS以DMF溶解，配制成lnmol/μ L溶液；取化合物T(C12， C18，C24)以DMF溶解，配制成0. lnmol/μ L溶液、；將上述兩種溶液混合，室溫避光反應濁。 即可得到納米金復合底物T-Au (C12，C18，C24)。芯片制備在醛基修飾的玻璃片上點制不同濃度的IgG(10yg/mL，2yg/ml， 0· 4μ g/mL，0. 08μ g/mL，0. 016 μ g/mL)，在 4°C下放置 12h 后用封閉液(1 XPBS+25%小牛血清)封閉2h，然后用PBST(lXPBS+0. 5%吐溫)洗三次晾干4°C保存備用。T-Au (酪胺，C12，C18，C24)的檢測流程取已制備好的芯片加入HRP標記的抗人 IgG抗體(1 5000) 37°C溫育30min后用PBST洗滌三次，然后在芯片不同區域內分別加入 T-Au (酪胺，1 400)，T-Au (C12，1 400) T-Au (C18,1 400) T-Au (C24,1 400)，37°C溫育30min后用PBST洗滌三次，然后加入銀增強試劑(A液+B液)顯色。結果顯示納米金復合底物T-Au(酪胺，C12，C18，C24)用于生物芯片檢測靈敏度相當。
權利要求
1.一類新的納米金復合底物是由一分子Nanogold-NHS的NHS的基團與化合物T形成酰胺鍵而得到的化合物。如附圖la，附圖lb。
2.如權利要求1所述化合物T的結構式為附圖2a，附圖2b。
3.如權利要求2所述m= 2時T的結構為附圖9a。m = 2，η = 4，t = 6時T的結構為附圖9b。m = 2，n = 10, t = 6時T的結構為附圖9c。m = 2，n = 10, t = 12時T的結構為附圖9d。
4.如權利要求1所述的一類新的納米金復合底物T-Au的制備方法，包括如下步驟 取定量的Nanogold-NHS以DMF溶解，配制成lnmol/ μ L溶液；取化合物T以DMF溶解，配制成0. lnmol/μ L溶液；將上述兩種溶液以1 10體積混合，室溫避光反應濁。即可得到納米金復合底物T-Au。產物4°C保存。
5.如權利要求1所述的一類新的納米金復合底物T-Au可以應用于基因芯片、蛋白芯片等的高靈敏度檢測，以及納米金免疫診斷試劑的研制。
全文摘要
本發明涉及一類新的納米金復合底物T-Au的制備方法及用途。納米金復合底物是由Nanogold-NHS的NHS的基團與化合物T的氨基反應形成酰胺鍵而得到的化合物。其制備方法是將Nanogold-NHS與化合物T分別溶解后在室溫下避光反應2h。產物4℃保存。納米金復合底物T-Au在HRP催化下可導致大量納米金顆粒沉積，可應用于生物芯片等的高靈敏度檢測，以及新型免疫診斷試劑的研制。
文檔編號C07F1/12GK102329331SQ20111008438
公開日2012年1月25日 申請日期2011年4月6日 優先權日2011年4月6日
發明者劉琪琦, 張敏麗, 張春, 王升啟 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所