專利名稱：山羊tnnc1基因和克隆山羊tnnc1基因編碼區全序列的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其是山羊TNNCl基因和克隆山羊TNNCl基因編碼區全序列的方法。
背景技術：
慢肌肌鈣蛋白(TNNCl)是存在于心肌和慢收縮性骨骼肌中的鈣離子結合蛋白復合物成員之一。肌鈣蛋白C(TNC)與肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白一起形成蛋白復合物，在肌肉的收縮和舒張中起著關鍵作用。肌鈣蛋白Cl是慢速收縮骨骼肌和心肌的鈣離子受體，并且是鈣離子激活肌小節收縮的關鍵。鈣離子的結合啟動了細肌絲褶皺般的結構的變化通過細肌絲組成蛋白。導致肌球蛋白和肌動蛋白間的橫橋的形成，促使細肌絲向粗肌絲的滑動產生肌肉收縮的效果肌肉收縮的效果。快肌肌鈣蛋白Cl含有4個鈣離子結合位點，但只要鈣離子結合位點II，III和IV有接受鈣離子產生效應的位點。每個鈣離子結合位點均有一個由12個氨基酸殘基組成的鈣離子結合環，鈣離子結合環存在于一對a-helices中。每個鈣離子結合環都富含酸性氨基酸(Asp and Glu)負責結合單個鈣離子。TNNCl整體結構包括一個N-末端和一個C-末端的球形區域，這兩個球形區域被一個靈活的螺旋鏈接形成啞鈴形。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種山羊TNNCl基因及其克隆山羊TNNCl基因編碼區全序列的方法。山羊TNNCl基因，核苷酸序列為SEQ ID NO :1。所述的山羊TNNCl基因，所述基因的編碼區序列為SEQ ID NO :2。所述的山羊TNNCl基因，所述基因的編碼區序列編碼氨基酸為SEQ ID NO :3。所述的山羊TNNCl基因的克隆方法，包括如下步驟步驟一提取山羊心肌組織中的總RNA，然后將總RNA反轉錄成cDNA ；步驟二引物的設計及PCR反應；依據已發表的牛的TNNCl基因的序列設計一對簡并引物，上游引物在起始密碼子的上游區域設計，下游引物在終止密碼子的下游區域設計； 所述簡并引物為上游引物P1 5 ‘ -CCTGTGAGTCGCCAGTATG-3 ‘下游引物P2:5' -TGGGTGAAGGTTGGTGTC-3 ‘用所述cDNA為模板進行梯度PCR反應；步驟三PCR產物的回收和純化；步驟四克隆。所述的方法，所述步驟二中，所述PCR反應體系為PCR反應體系為20 μ 1體系 10μ L的2XMaster Mix Tap，上下游引物各1 μ L，4 μ L的cDNA，4 μ L的ddH20 ；反應條件為95°C預變性 5min ；35 個循環(94°C,40s ；50°C 60°C，40s ；72°C，50s)，最后 72°C IOmin0目前還沒有山羊TNNCl基因的相關報道，為獲得山羊TNNCl基因的完整編碼區序列，研究RT-PCR克隆法獲取山羊TNNC1(慢肌肌鈣蛋白)基因編碼區全序列的方法，以建立一種基因克隆的新方法。
圖1是TNNCl基因的8個溫度點的梯度PCR產物電泳圖。圖2是山羊TNNCl基因編碼區的核苷酸序列和編碼的氨基酸序列。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。步驟一提取山羊心肌組織中的總RNA (核糖核酸)，然后將總RNA反轉錄成cDNA ；1.組織的采集選取周歲的天府肉羊頸動脈放血后立即取約Ig心肌放入液氮罐中用于提取總 RNA。2. RNA的制備及cDNA的合成在實驗室用液氮將心肌磨成粉末裝入1. 5ml的EP管，放入零下80的超低溫冰箱中備用。取新的1. 5ml的EP管，加入1. Iml的Trizol液，然后加入約80mg的心肌組織粉末。立即用手搖晃混勻后，用震蕩儀震蕩約30秒后室溫放置4分鐘。4°C下13000rpm離心3分鐘將液體用移液槍轉運到另一個新的1. 5ml的EP管，并往這個新EP管中加入0. 2ml的氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管約15秒，然后4°C下 13000rpm離心8分鐘。離心結束以后用移液槍將這個EP管中的上層水相約0. 4ml移入一新的離心管，加入0. 4ml的異丙醇，室溫放置10分鐘，接著4°C下12000rpm離心10分鐘。 棄去上清液，加入Iml的75%乙醇(DEPC水配制)混勻，4°C下7500g離心5分鐘。小心棄去上清液，然后用移液槍吸干管壁上多余的乙醇，注意不要把RNA吸掉，然后根據RNA量的多少，加入50到150 μ L的DEPC水。用1. 5%瓊脂糖電泳法檢測RNA的質量，將效果好的RNA立即反轉錄成cDNA。步驟二引物的設計及PCR反應；依據已發表的牛的TNNCl基因的序列(登錄號為BC102995. 1)設計一對簡并引物，上游引物在起始密碼子的上游區域設計，下游引物在終止密碼子的下游區域設計。設計的引物為上游引物 P1 5 ‘ -CCTGTGAGTCGCCAGTATG-3 ‘下游引物P2 5 ‘ -TGGGTGAAGGTTGGTGTC-3 ‘用cDNA為模板進行梯度PCR反應，擴增TNNCl基因，溫度為范圍在50°C到65°C之間的8個溫度點，PCR反應體系為20 μ 1體系(IOyL的2XMaster Mix Tap，上下游引物各 lyL，4yL 的 cDNA，4yL 的 ddH20.)，反應條件為 95°C預變性 5min，35 個循環(94°C,40s ； 50°〇 601，408;721，508)，最后721 IOmin。反應結束后將約有500bp的PCR產物收集到一個EP管中并切膠回收(圖1)，將回收的基因片段克隆到質粒載體中，然后挑取陽性菌進行PCR反應，產物送測序公司測序。設計的簡并引物不會出現影響PCR反應的發夾結構，引物二聚體，上下游引物交聯。適宜的PCR反應溫度范圍跨度大。步驟三PCR產物的回收和純化；PCR產物用寶生物膠回收試劑盒純化回收，具體操作步驟為a. PCR產物經2.0%瓊脂糖IlOV電泳分離后，在紫外光下用消毒刀片切下與預期片段大小一致的DNA條帶，裝入1. 5mL的EP管中，將膠輕柔切碎。b.在離心管中加入600 μ 1的溶膠液Α，放置于55°C水浴鍋中水浴IOmin溶膠，中
間取出離心管緩慢搖動一到兩次。c.膠溶解后放至室溫，加入加20 μ L溶液B，混勻，轉入離心柱，8000rpm離心40s。d.棄離心液，將柱子放入新的1. 5M1 EP管中，加50(^1^洗脫液(，8000印111離心 Imin重復此步驟3次。e.將離心柱放入新離心管，加20 μ 1滅菌蒸餾水，浸潤lOmin，IOOOOrpm離心 1. 5min。f.離心管中的溶液即為回收的DNA片段的水溶液。g.取2μ L回收產物于1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測回收效率和純度。步驟四克隆；(1)目的片段與載體連接將回收、檢測后的目的片段與PMD-18T載體連接，根據TaKaRa的pMD_18T載體試劑盒使用說明書，操作連接體系為PMD-18T Vectorl.OyL純化回后的PCR片段4. OyL連接液 Ligase buffer5. 0 μ LTotal10. 0μ L以上操作在冰上進行，稍離心混勻，16°C在PCR儀中連接過夜，-20°C保存備用。(2)大腸桿菌感受態細胞的制備(CaCl2法)a.挑取大腸桿菌Dffia菌種，在LB瓊脂板上畫線，37°C培養過夜(12_16h)。b.挑取單菌落，接種到IOOmL LB液體培養基中。37°C 190rpm振蕩培養12h，當 ODD600值達到0. 4-0. 5時(輕搖培養基肉眼可見云霧狀)，停止培養。c.將菌液以50mL/份分裝至預冷的IOOmL滅菌離心管中，冰浴10_15min，4000rpm 4°C離心 IOmin0d.棄上清，每管用50mL的預冷的0. IMol的CaCl2 (液體中有冰粒效果最好)重懸菌體沉淀，冰浴30min后，4000rpm 4°C離心3min。e.棄上清，每管用IOmL預冷的0. IM的CaCl2重懸菌體沉淀，冰浴10-15min，即為感受態細胞。f.現制現用。或將制備好的感受態細胞加入30%甘油至終濃度為15-20%，混勻， 分裝成200uL/份，投入液氮快速冷凍后，-80°C保存(3)連接產物的轉化a.從_80°C冰箱取出保存的感受態細胞，置于冰上解凍。
b.將2. 5μ1連接產物緩慢打入200μ1的感受態細胞中，動作要輕柔，冰浴 20minoc. 42°C水浴熱激90s (中間不能搖晃離心管)，迅速取出置于冰上，冰浴5-lOmin。d.加入800 μ 1 LB液體培養基(不加Amp)，于37°C、小于150rpm振蕩培養50min 以復蘇細胞。e.3000rpm離心5min，吸去部分上清，輕柔懸浮細菌，涂布于選擇性平板上。待液體完全滲入瓊脂后，倒扣平板，于37°C恒溫培養箱中培養9_16h。(4)陽性菌落的篩選隨機挑選菌落接種于LB氨節培養液中，培養至中等濃度后以菌液為模板，用于相應基因PCR擴增相同的引物及反應條件進行擴增。擴增產物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測， 將擴增產物與目的片段大小一致的菌液0.5mL裝入1.5ml EP離心管中，加入30%甘油。交送寶生物工程技術有限公司完成測序。步驟五檢驗試驗的正確性；將測序結果在NCBI上運用blast在線比對軟件以驗證序列的正確性和該方法的可靠性。結果表明該方法獲得的山羊TNNCl基因完整編碼區序列的核苷酸序列與其他已知的哺乳動物的TNNCl基因序列同源性為92. 18% 99. 38%。表明該方法能達到獲得山羊 TNNCl基因的完整編碼區序列的目的。獲得的山羊TNNCl基因核苷酸序列為SEQ ID NO :1， 編碼區序列為SEQ ID NO :2，編碼氨基酸序列SEQ ID NO :3。本發明簡單、快捷的獲取了山羊TNNCl基因的完整編碼區序列，填補了該基因在山羊上的空白，為進一步研究山羊的該基因奠定了基礎。該技術相比較分段克隆和RACE技術而言，目的PCR片段的長短大致明確，工作量小(只需克隆一次)，具有成本低，效率高的優勢。應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換， 而所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。
權利要求
1.山羊TNNCl基因，其特征在于，核苷酸序列為SEQID NO :1。
2.根據權利要求1所述的山羊TNNCl基因，其特征在于，所述基因的編碼區序列為SEQ ID NO :2。
3.根據權利要求1所述的山羊TNNCl基因，其特征在于，所述基因的編碼區序列編碼氨基酸為 SEQ ID NO :3ο
4.權利要求1所述的山羊TNNCl基因的克隆方法，其特征在于，包括如下步驟 步驟一提取山羊心肌組織中的總RNA，然后將總RNA反轉錄成eDNA ；步驟二引物的設計及PCR反應；依據已發表的牛的TNNCl基因的序列設計一對簡并引物，上游引物在起始密碼子的上游區域設計，下游引物在終止密碼子的下游區域設計；所述簡并引物為上游引物 P1 5 ‘ -CCTGTGAGTCGCCAGTATG-3 ‘ 下游引物 P2 5 ‘ -TGGGTGAAGGTTGGTGTC-3 ‘ 用所述cDNA為模板進行梯度PCR反應； 步驟三PCR產物的回收和純化； 步驟四克隆。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟二中，所述PCR反應體系為PCR 反應體系為20μ 1體系10μ L的2XMaster Mix iTap,上下游引物各1 μ L，4 μ L的cDNA, 4μ L 的 ddH20 ；反應條件為95 °C 預變性 5min ；35 個循環(94°C，40s ； 50°C 60°C，40 s ； 72°C，50s)，最后 72°C IOmin0
全文摘要
本發明公開了山羊TNNC1基因，核苷酸序列為SEQ ID NO1。所述基因的編碼區序列為SEQ ID NO2。所述基因的編碼區序列編碼氨基酸為SEQ ID NO3。還提供一種山羊TNNC1基因的克隆方法，包括如下步驟步驟一，提取山羊心肌組織中的總RNA，然后將總RNA反轉錄成cDNA；步驟二，引物的設計及PCR反應；步驟三，PCR產物的回收和純化；步驟四，克隆。本發明簡單、快捷的獲取了山羊TNNC1基因的完整編碼區序列，填補了該基因在山羊上的空白，為進一步研究山羊的該基因奠定了基礎。
文檔編號C07K14/47GK102181451SQ20111007475
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月28日 優先權日2011年3月28日
發明者徐剛毅, 汪代華, 鄭程莉, 陳浩林 申請人:四川農業大學