專利名稱：糖蛋白中去除/滅活朊病毒的方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，尤其涉及治療不孕癥的糖基化蛋白質中的朊病毒去除/滅活的方法。
背景技術：
瓶病毒(proteinaceousinfectious particle ;縮寫為 prion)是一種蛋白質，不含核酸，分子量33KD-35KD，抗蛋白酶的？沖％是其唯一(或主要)成分；它是宿主PrP基因編碼的蛋白PrPe經翻譯后修飾構象改變形成，在朊病毒病理發生中起主導作用，其復制和分離物(或毒株)的不同特性都由其自身和宿主PrPe相互作用決定，而不依賴于任何核酸。在病毒分類上，近年來已將與衛星因子和類病毒一同納入亞病毒因子(subviral agents), 以與真病毒相區分。即正常生長的細胞膜糖蛋白PrPG(Cellular prion protein)僅通過構象改變錯誤折疊成非正常蛋白PrPsc (Scrapie form of prion protein),從而引起PrPsc的積聚，最終導致神經元的β_淀粉樣變性，是一系列神經退化性疾病如人類的庫魯病(Kuru disease),致死性家族失眠癥,人和動物的克-雅氏癥(Creutzfel-Jacob diseases,CJD),人和動物的傳染性海綿狀腦病(Transmissible Spongiform encephalopathies,TSE),牛海綿狀腦病(Bovine Spongiform encephalopathies, BSE,俗稱瘋牛病)，以及羊、貓或其他動物的瘙癢癥等的主因。朊病毒具有和一切已知傳統病原體不同的特性。它對物理化學因素有非常強的抵抗力，常規的烹飪甚至高壓蒸汽消毒134-138 18分鐘也不能使之完全失活；對UV254nm抵抗力比常規病毒高40-200倍；對離子輻射和超聲抵抗力也很強；在371^^20%的福爾馬林處理18小時，0. 35%福爾馬林處理3個月也不能使之完全失去活性，室溫下10% -20%福爾馬林溶液中可存活18個月。朊病毒不被多種核酸酶滅活，在電子顯微鏡下 看不到病毒顆粒。朊病毒不形成包涵體，不含非宿主蛋白；不誘生干擾素，對干擾素亦不敏感。免疫抑制劑和免疫增強劑不能改變朊病毒病的發生和發展過程。因此，使用現有的手段很難將其除去。朊病毒的傳播途徑包括食用動物肉骨粉飼料、牛骨粉湯；醫源性感染，如使用腦垂體生長激素、促性腺激素和硬腦膜移植、角膜移植、輸血等。朊病毒存在變異和跨種族感染，具有大量的潛在感染來源，主要為牛、羊等反芻動物，未知的潛在宿主可能很廣，傳播的潛在危險性不明，很難預測和推斷。朊病毒可感染多個器官，已知的主要為腦髓，但在潛伏期內除中樞神經系統外，各種組織器官均有感染，且感染多途徑，除消化道外，神經系統、血液均可感染，預防難度大，人畜一旦發病，6個月至I年全部死亡，100%的死亡率。治療不孕癥的糖蛋白是一類結構接近的物質，包括絨毛膜促性腺激素(HCG)、絕經期促性腺素(HMG)、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)，其中絕經期促性腺素是含有卵泡刺激素和黃體生成素且兩者成一定比例(I 0.1-1)的混合物。臨床上HCG、HMG、FSH、LH主要用于治療不育癥以及體外輔助生殖。它們可以從特定婦女(孕期或絕經期)的尿液中提取出來，也可通過DNA重組技術而制備。
由于這類治療不孕癥的糖蛋白藥物可以從特定婦女(孕期或絕經期)的尿液中提取出來，很可能存在包括朊病毒在內的大量各種類型的病毒，如果不能有效去除這些病毒就無法保證藥品的安全性。目前血制品藥物的工藝過程中所使用的針對性的病毒去除/滅活的多個步驟的組合，比如熱處理、低PH處理、表面活性劑處理等，對上述糖基化蛋白質藥物不完全適合，因為此類糖基化蛋白質藥物對熱和低PH的耐受性很差，容易失去活性。按照ICH Q5A生物制品病毒安全性評估的規程，要求工藝過程中應有2步或2步以上的步驟的組合，并且至少有一步的病毒去除/滅活率大于104，才能被認為是安全有效的病毒去除/滅活方法。因此，本領域迫切需要開發出適合治療不孕癥的糖基化蛋白質的去除/滅活朊病毒的工藝，以獲得安全有效的藥物。
發明內容
本發明旨在提供一種去除和/或滅活糖蛋白中的朊病毒的方法。在本發明的第一方面，提供了一種去除和/或滅活糖蛋白中的朊病毒的方法，所述的方法由下述步驟構成(a)將含糖蛋白的溶液進行微孔膜過濾；(b)將含糖蛋白的溶液進行納濾膜過濾或超濾膜過濾；和(C)將含糖蛋白的溶液進行陰離子交換層析；所述步驟順序為(a)至(b)至(C)或(C)至(a)至(b)。在上述方法中，所述的糖蛋白選自絨毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、黃體生成素、絕經期促性腺素、或其混合；所述絨毛膜促性腺激素是人絨毛膜促性腺激素或其變體，選自人尿來源的和/或重組的人絨毛膜促性腺激素或其變體；所述絕經期促性腺素是人絕經期促性腺素或其變體，選自人尿來源的和/或重組的人絕經期促性腺素或其變體；所述卵泡刺激素是人卵泡刺激素或其變體，選自人尿來源的和/或重組的人卵泡刺激素或其變體；所述黃體生成素是人黃體生成素或其變體，選自人尿來源的和/或重組的人黃體生成素或其變體。在上述方法中，步驟(a)中所述微孔膜選自孔徑為O. 1-1 μ m的過濾膜；更佳地為O. 1-0. 45 μ m的過濾膜。在上述方法匯總，步驟(b)中所述納濾膜選自孔徑為I-IOOnm的納濾膜；更佳地為10-50nm的納濾膜。在上述方法中，步驟(b)中所述超濾膜選自孔徑為1000道爾頓以上的超濾膜；更佳地為100000道爾頓以上的超濾膜。在上述方法中，步驟(C)中所述陰離子交換層析在PH5-10的條件下進行；更佳地，步驟(c)中所述陰離子交換層析在PH6-8的條件下進行。在上述方法中，步驟(C)中所述陰離子交換層析的樹脂的骨架介質包括瓊脂糖，葡聚糖，纖維素，苯乙烯和二乙烯基苯的交聯物，丙烯酸和/或其衍生物的交聯物；步驟(C)中所述陰離子交換層析的樹脂的活性基團選自二乙基季胺、或二乙基氨基乙基；更佳地，步驟(C)中所述陰離子交換層析的樹脂選自DEAE Sephadex A50、Q Sepharose FF或DEAE、Sepharose FF0在本發明的第二方面，提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物包括由上述的方法獲得的糖蛋白以及藥學上可接受的載體。據此，本發明提供了一種適合治療不孕癥的糖基化蛋白質的去除/滅活朊病毒的工藝，從而能夠獲得安全有效的藥物。
具體實施例方式雖然現有技術中已存在一些去除和/或滅活蛋白質中病毒的方法，但是同樣的方法對于不同的病毒，會產生無法預料的結果，有時甚至會適得其反。鑒于此，發明人經過廣泛而深入的研究，驚奇地發現可通過微孔膜過濾、納濾膜或超濾膜技術以及陰離子交換層析這3個步驟的適當組合，來達到去除/滅活糖基化蛋白質中的朊病毒的目的，從而在溫和條件下去除/滅活朊病毒，并且保留了目標物-糖基化蛋白質的活性。在此基礎上，發明人完成了本發明。在探索過程中，發明人注意到，采用合適的微孔膜過濾技術，以及納濾膜或超濾膜技術，不但可以截留朊病毒顆粒，而且可以讓目標物從膜上濾過，可以達到將目標物和病毒分離的目的。另外，發明人在試驗過程中意外發現，只要控制好適當的條件，可以通過陰離子層析將朊病毒和目標物分離，從而達到將目標物中的病毒去除的目的。通過上述3個步驟的組合，可以有效地去除/滅活朊病毒，從而獲得安全可靠的產品O定義如本文所用，“糖蛋白”和“糖基化蛋白質”可以互換使用，都是選自下述的一種或多種混合絨毛膜促性腺激素(chorionic gonadotropin, CG)、卵泡刺激素(follicule-stimulating hormone,FSH)、黃體生成素(luteotropic hormone, LH)、絕經期促性腺素(human menopausal gonadotropin, HMG)。術語“卵泡刺激素”和“FSH”可互換使用，都是指一類用于促進精子或卵泡產生、促進卵巢發育的激素或其變體。在天然情況下由垂體前葉分泌，也可從絕經期婦女的尿液中提取或可通過重組技術獲得的。本發明中的FSH可采用本領域常用的任何方式獲得，例如天然產生、通過重組技術獲得或合成，其中的雜質包括LH或CG。在本發明的一個實施方式中，所述卵泡刺激素是人卵泡刺激素或其變體，優選人尿來源的卵泡刺激素或是重組的人卵泡刺激素。可用于本發明中的含有FSH且包含作為雜質的LH和/或CG的原料可為未經任何預純化步驟的原料、經預純化步驟去除了部分雜質的原料、或經預純化步驟而基本上只含FSH和雜質LH和/或CG的原料。優選在采用本發明的方法純化FSH前，采用本領域常規方法對原料FSH進行初步純化，以分離除LH或CG以外的其它雜質。如本文所用，術語“黃體生成激素”和“LH”可互換使用，指在含有FSH的原料制備或獲取過程中摻雜于其中的與天然LH具有相同或相似結構和功能的激素。如本文所用，“絕經期促性腺素”、“尿促性素”和“HMG”可以互換使用，都是指一類由垂體產生的糖蛋白激素或其變體，含有FSH和LH兩種活性成分。HMG可以是重組的絕經期促性腺素或其變體、或是人尿來源的絕經期促性腺素或其變體。其中FSH和LH的生物效價比例在I : O. 1-3范圍，更佳的在I : O. 3-1范圍。類似地，術語“絨毛膜促性腺激素”和“CG”可互換使用，指在含有FSH的原料制備或獲取過程中摻雜于其中的與天然CG具有相同或相似結構和功能的激素。本發明提供的去除和/或滅活蛋白質中的朊病毒的方法除了用于糖蛋白，也可用于糖蛋白組合物，所述的糖蛋白組合物包括糖蛋白和藥學上/食品學上可接受的載體。如本文所用，術語“藥學上可接受的”或“食品學上可接受的”的成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態反應)的，即有合理的效益/風險比的物質。
如本文所用，術語“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在《雷明頓藥物科學》(Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Pub. Co. ,N. J. 1991)中可找到關于藥學上可接受的賦形劑的充分討論。所述的“藥學上可接受的載體”可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如填充劑、崩解齊ij、潤滑劑、助流齊 、泡騰齊 、潤濕劑或乳化劑、矯味劑、PH緩沖物質等。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。方法本發明提供的去除和/或滅活糖蛋白中的朊病毒的方法由微孔膜處理、納濾膜或超濾膜處理和陰離子交換層析處理步驟組成，其順序是微孔膜處理、納濾膜或超濾膜處理和陰離子交換層析處理；或是陰離子交換層析處理、微孔膜處理、和納濾膜或超濾膜處理。所述的步驟是微孔膜處理、納濾膜或超濾膜處理和陰離子交換層析處理。所述的微孔膜處理是將糖蛋白濃度為10-100毫克/毫升(較佳地為15-40毫克/毫升，更佳地為20-30毫克/毫升)的溶液通過微孔膜，去除和/或滅活朊病毒。所述微孔膜選自孔徑為O. I-Iym的細菌過濾膜；較佳地所述微孔膜選自孔徑為O. 1-0. 45 μ m的細菌過濾膜。所述溶液PH5-10，較佳地為pH6-8，所用緩沖液可以是磷酸鹽、醋酸鹽或Tris緩沖液等。所述的納濾膜或超濾膜處理是將糖蛋白濃度為10-100毫克/毫升(較佳地為15-40毫克/毫升，更佳地為20-30毫克/毫升)的溶液通過納濾膜或超濾膜，去除和/或滅活朊病毒。所述納濾膜選自孔徑為I-IOOnm的納濾膜；較佳地所述納濾膜選自孔徑為10-50nm的納濾膜。所述超濾膜選自孔徑在1000道爾頓以上的超濾膜；較佳地所述超濾膜選自孔徑在100000道爾頓以上的超濾膜。所述溶液PH5-10，較佳地為pH6-8，所用緩沖液可以是磷酸鹽、醋酸鹽或Tris緩沖液等。所述的陰離子交換層析處理是將糖蛋白濃度為15-60毫克/毫升(較佳地為20-40暈克/暈升,更佳地為25-35暈克/暈升)的溶液通過陰尚子交換樹脂，使得朊病毒被吸附在樹脂上，而糖蛋白隨著洗脫液流出，從而去除和/或滅活朊病毒。所述溶液PH5-10，較佳地為PH6-8，所用緩沖液可以是磷酸鹽、醋酸鹽或Tris緩沖液等。可以使用本領域常規的陰離子交換樹脂，例如但不限于，DEAE Sephadex A50,Q Sepharose FF或DEAE SepharoseFF。本發明提到的上述特征，或實施例提到的特征可以任意組合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。本發明的主要優點在于I、本發明提供的方法安全、高效。2、本發明提供的方法條件溫和，適合于工業化生產。下面將結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人,分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數按重量計。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。朊病毒原溶液的制備將受到朊病毒感染的動物的腦組織用高速勻漿器混勻I分鐘，然后在含O. 5%十二烷基肌酸鈉的磷酸緩沖液中進行六次超聲波混勻，每次15秒，得到均勻的腦組織勻漿。將腦組織勻漿在0°C培養30分鐘，然后再次進行超聲波混勻(共三次，每次15秒)。將勻漿在4°C，4500Xg條件下離心30分鐘，棄去顆粒物，取上清液，用含O. 5%十二烷基肌酸鈉的磷酸緩沖液稀釋到最終濃度為10% (w/v)，即為朊病毒原溶液，保存在-80°C ±15°C待用。實施例I將50ml ρΗ7· 8±0· I的磷酸緩沖液冷卻到12°C ±2°C，然后加入到O. 6g DEAESephadex A_50中。將溶液在12°C ±2°C保持至少15小時以使樹脂充分溶脹。將溶脹好的樹脂懸濁液裝在XK16柱中，使最終床層體積為15ml。將蠕動泵的管中充滿pH7. 0±0. I的醋酸鈉緩沖液，然后接在柱上。用上述緩沖液平衡至少5個柱體積(75ml)，控制流速在O. 17-0. 18ml/min。如果需要可在柱的流出口測定流速，調整泵速以控制流速。收集并測量流出液的PH，直到確定其與進口緩沖液pH值相同。關閉蠕動泵和柱出口，直到上柱樣品準備完畢。在12°C ±2°C 25ml平衡緩沖液(醋酸鈉緩沖液，ρΗ7. 0±0· I)中，邊攪拌邊加入750mg HCG粗制品(上海天偉生物制藥有限公司提供，免疫效價4855IU/mg)。樣品在12°C ±2°C持續攪拌適當時間，以確保HCG充分溶解。然后測量溶解液的pH，如果與平衡緩沖液不符，可用醋酸或氫氧化鈉溶液調節，作為樣品溶液，保持在12°C ±2°C。將朊病毒原溶液用超聲波混勻3次，每次15秒，然后在4°C，4500Xg條件下離心30分鐘，棄去顆粒物，取上清液，依次用孔徑為O. 45 μ m，O. 2 μ m和O. I μ m的濾膜進行預過濾，作為朊病毒溶液。將25ml樣品溶液邊攪拌邊加入朊病毒溶液2. 5ml，混勻后，取樣1ml，測定初始病毒加入量以及HCG免疫效價。將20mL加入病毒的樣品溶液以O. 17-0. 18ml/min的流速通過層析柱，同時開始收集流出液。當上樣結束后，用平衡緩沖液洗柱，流速控制在O. 10-0. llml/min。收集到50ml流出液時停止收集，作為收集液。混勻后取樣1ml，測定病毒殘留量以及HCG免疫效價。上述實驗平行做2份，分別為實驗A、實驗B。 病毒去除率的計算病毒去除率=Iogltl病毒加入量X上樣體積-Iogltl病毒殘留量X收集體積效價收率的計算效價收率％ =(上樣體積X上樣溶液的免疫效價)+ (收集體積X收集溶液的免疫效價)X 100%病毒去除結果
序號~ 效價收率％病毒去除率(Iogltj)^
~952736
~972 59結果表明，對朊病毒而言，病毒去除率大于102，可以認為這一步驟對提高HCG藥物安全性、去除朊病毒有一定的作用，但是尚未到達ICH要求的大于IO4的安全有效的標準；另外從HCG的效價收率可以看出整個過程對HCG的活性沒有任何影響，說明此步驟不會使HCG失活。實施例2除樣品為750mg HMG粗制品(上海天偉生物制藥有限公司提供)夕卜，其它步驟與實施例I 一致。病毒去除結果
序號~ 效價收率％病毒去除率(Iogltj)^
~982TT9
~962Λ9結果表明，對朊病毒而言，病毒去除率大于102，可以認為這一步驟對提高HMG藥物安全性、去除朊病毒有一定的作用，但是尚未到達ICH要求的大于IO4的安全有效的標準；另外從HMG的效價收率可以看出整個過程對HMG的活性沒有任何影響，說明此步驟不會使HMG失活。對照例I除平衡液為pH4. 0±0. I的醋酸鈉緩沖液之外，樣品及步驟都與實施例I 一致。病毒去除結果
權利要求
1.一種去除和/或滅活糖蛋白中的朊病毒的方法，其特征在于，所述的方法由下述步驟構成 (a)將含糖蛋白的溶液進行微孔膜過濾； (b)將含糖蛋白的溶液進行納濾膜過濾或超濾膜過濾； (c)將含糖蛋白的溶液進行陰離子交換層析； 所述步驟順序為(a)、(b)、和(C)或(c)、(a)、和(b)。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述的糖蛋白選自絨毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、黃體生成素、絕經期促性腺素、或其混合。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述絨毛膜促性腺激素是人絨毛膜促性腺激素或其變體，選自人尿來源的和/或重組的人絨毛膜促性腺激素或其變體；所述絕經期促性腺素是人絕經期促性腺素或其變體，選自人尿來源的和/或重組的人絕經期促性腺素或其變體；所述卵泡刺激素是人卵泡刺激素或其變體，選自人尿來源的和/或重組的人卵泡刺激素或其變體；所述黃體生成素是人黃體生成素或其變體，選自人尿來源的和/或重組的人黃體生成素或其變體。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(a)中所述微孔膜選自孔徑為O.1-1 μ m的過濾膜；更佳地為O. 1-0. 45 μ m的過濾膜。
5.如權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(b)中所述納濾膜選自孔徑為I-IOOnm的納濾膜；更佳地為10-50nm的納濾膜。
6.如權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(b)中所述超濾膜選自孔徑為1000道爾頓以上的超濾膜；更佳地為100000道爾頓以上的超濾膜。
7.如權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(c)中所述陰離子交換層析在PH5-10的條件下進行。
8.如權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(c)中所述陰離子交換層析在PH6-8的條件下進行。
9.如權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(c)中所述陰離子交換層析的樹脂的骨架介質包括瓊脂糖，葡聚糖，纖維素，苯乙烯和二乙烯基苯的交聯物，丙烯酸和/或其衍生物的交聯物。
10.如權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(C)中所述陰離子交換層析的樹脂的活性基團選自二乙基季胺、或二乙基氨基乙基。
11.如權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(C)中所述陰離子交換層析的樹脂選自 DEAE Sephadex A50> Q Sepharose FF 或 DEAE Sepharose FF。
12.—種藥物組合物，其特征在于，它包括權利要求1-11任一所述的方法獲得的糖蛋白以及藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發明公開了一種去除和/或滅活糖蛋白中的朊病毒的方法，所述的方法選自下述步驟的一種或多種，并且所述步驟的順序可以任意交換(a)將含糖蛋白的溶液進行微孔膜過濾；(b)將含糖蛋白的溶液進行納濾膜過濾或超濾膜過濾；(c)將含糖蛋白的溶液進行陰離子交換層析。
文檔編號C07K1/18GK102675414SQ201110055149
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月8日 優先權日2011年3月8日
發明者季斌, 季曉銘, 洪云海, 郭照曄, 高霄梁 申請人:上海天偉生物制藥有限公司