專利名稱：具有腦靶向遞藥特性的多肽及其制備方法
技術領域：
本發明屬于蛋白質多肽技術領域，涉及具有腦靶向遞藥特性的多肽，包括所述肽的分子結構及其在制備腦靶向遞藥中的應用。
背景技術：
隨著人類社會的老齡化，腦部疾病的發病率正呈逐年上升的趨勢，正嚴重危害著人類的生命和健康。通常腦部疾病包括中樞神經系統疾病(帕金森病、老年性癡呆)、腦腫瘤、腦血管病變、腦部病毒和細菌感染等疾病。現有技術公開了血腦屏障(BBB)是存在于血液與腦組織間的屏障系統，它能將腦組織非必需或是有害的物質隔離在外，起到保護腦組織的作用。血腦屏障上的腦毛細血管內皮細胞和膠質細胞共同構成了緊密連接，即是一道BBB的機械屏障。研究顯示，腦毛細血管內皮細胞膜上還存在一些特殊的酶系統，能使某些藥物降解，如多巴胺脫羧酶能使L-多巴和L-5-羥色胺酸脫羧生成不易透過BBB的L-多巴胺和L-5-羥色胺，從而構成BBB的酶屏障；腦毛細血管內皮細胞膜上的P-糖蛋白等還起著外排泵的作用，它能選擇性地將腦內有害物質或過剩物質泵出腦外，限制物質的腦內遞送。血腦屏障的上述功能維持了正常生理狀態下腦組織內環境的恒定，但在疾病治療過程中卻限制了藥物的透過。據有關統計，目前臨床常規制劑給藥后，大約有98%的化學藥物和幾乎100%的蛋白多肽或基因藥物由于血腦屏障的作用而難以入腦，很大程度上限制了腦部疾病的治療。因此，增加藥物尤其是蛋白多肽藥物的腦內遞釋技術研究已成為藥劑學及其交叉學科的研究熱點。目前，在增加藥物透過血腦屏障的策略中，受體介導胞吞轉運入腦的納米遞釋系統最受關注。腦毛細血管內皮細胞膜上存在多種特異性受體，如轉鐵蛋白受體、胰島素受體、低密度脂蛋白受體等。受體介導胞吞轉運就是利用這些受體與相應配體或單克隆抗體的特異性結合，使得載藥系統(如納米粒，脂質體等)能夠以胞吞的方式介導相應的藥物入腦。其中研究較多的介導入腦的靶向功能基有轉鐵蛋白、胰島素和單抗0X^5等，它們均能介導納米載藥系統跨越血腦屏障，但仍存在某些不足，如轉鐵蛋白受體可能會被內源性轉鐵蛋白飽和；胰島素的體內半衰期非常短，并且可能引起低血糖；0X^5的免疫原性和動物種屬選擇性較強，應用到人體需采用抗人轉鐵蛋白受體單抗，制備技術較為復雜等等。因此，探尋新型的腦靶向功能基，構建更為合理、有效的腦靶向遞釋系統具有很高的研究價值和臨床意義。現有技術公開了噬菌體展示肽庫技術是一種篩選功能性多肽的生物技術，它將隨機多肽文庫表達于絲狀噬菌體的表面，通過多輪的“親和一洗脫一擴增”步驟，實現高通量親和篩選。有研究通過噬菌體展示技術篩選出與內皮細胞特異性結合的多肽，其中最具代表性的是可與腫瘤血管內皮細胞特異結合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽序列， RGD結合的長循環納米載藥系統表現出良好的腫瘤靶向性。Pasqualini等獲得一種與肺細胞特異性結合的肽，通過與抗腺病毒抗體連接而靶向于細胞膜上二肽酶的遞藥系統。Wan Xiaomei等也獲得一種能經鼻腔嗅粘膜入腦的七肽序列。研究顯示，經噬菌體展示篩選獲得的多肽親和力高、特異性強、安全性好、生物降解和生物相容性優良、合成方便，并易于在末端進行修飾。與本發明相關的現有技術還有Ito，et al. The effect of RGD peptide-conjugated magnetite cationic liposomes on cell growth and cell sheet harvesting. Biomaterials, 2005,26: 6185 ；Trepel Μ, et al. Molecular adaptors for vascular-targeted adenoviral gene delivery. Hum Gene Ther, 2000,11:1971 ； Xiao-Mei Wan et al. Identification of nose-to-brain homing peptide through phage display. Peptides, 2009,30:343。但目前為止，尚未見通過噬菌體展示技術篩選經靜脈注射入腦的靶向功能基的相關研究和報道。
發明內容
本發明的目的是提供與血腦屏障具有親和性的相關多肽，并提供該相關多肽的分子結構。本發明的另一目的是提供上述相關多肽在構建腦靶向遞藥系統中的用途。本發明的目的通過下述技術方案予以實現
首先，采用噬菌體展示肽庫逐輪篩選出具有血腦屏障親和性的多肽，其包括步驟采用大鼠體內篩選方法，將紐英倫生物技術有限公司(NEW ENGLAND Biolabs)的兩種肽庫噬菌體展示隨機環七肽庫(Ph. D-C7C Phage Display Peptide Library Kit)，噬菌體展示隨機十二肽庫(Ph. D-12 Phage Display Peptide Library Kit)進行多輪體內篩選，并逐輪增加淘選力度，獲得對腦部具有特異親和性的噬菌體單克隆；測序后獲得SEQ ID N0:1 20的多肽的氨基酸序列；經脫氧核苷酸(DNA)測序證實該些噬菌體展示多肽包含有共同序列，所述多肽的25%或更多是由堿性氨基酸殘基(K、H或R)組成；
本發明中，SEQ ID NO: 1 10的序列由噬菌體展示隨機環七肽庫篩選獲得，所述多肽由 9個氨基酸組成，包含一個環狀肽區域；該環肽區域由多肽兩端的半胱氨酸殘基形成的二硫鍵而被環化；所述的10條環肽的氨基酸序列分別為CPMKSHTNC，CSTPNLMLC，CTSTSAPYC， CVCCLAGLC, CNKffNLLNC, CTHDYPLVC, CPFGSPALC, CMTRHHLDC, CffANQPATC, CMRTHHMQC ；
本發明中，SEQ ID NO: 11 20的序列由噬菌體展示隨機十二肽庫篩選獲得；所述的多肽為由12個氨基酸組成的直鏈肽，其中包含至少一個或多個堿性氨基酸殘基(K、H或R)， 所述的10條直鏈肽的氨基酸序列分別為AHSLKSITNHGL，HHERMRLPQPPV, TGNPHATNILFR, AHSCPMKSHTNC, TPQLPKDRNADR, SISTRFHAYKLK, TGNYKALHPHNG, TGffARSTFYPHP, GPSYLHRLVPAF, DYGRDffLRYRLH ；
其次，在上述任何一多肽其氨基酸序列上增加、缺失或取代1 4個氨基酸后，獲得22 條衍生肽，它們的基本性質與原始肽相似，分別編號為SEQ ID N0: 21 44;
然后，將上述44條噬菌體展示肽及衍生肽隨機分為四組，分別連接至四種納米納米載體(納米粒、脂質體、泡囊和膠束)表面，構建成噬菌體展示多肽或衍生肽修飾的納米載體。經體內外親和性及靶向性評價，結果證實，所述的多肽及其衍生肽具有與血腦屏障中的腦毛細血管內皮細胞特異親和的特性；所述的多肽及其衍生肽用于修飾載藥納米粒、脂質體、泡囊或膠束，構建成腦靶向遞藥系統，該類系統能夠提高藥物的腦內遞送，增強對于腦部疾病的治療效果，降低全身性的毒副作用。本發明經篩選獲得的對腦部具有特異靶向性的SEQ ID N0:1 44多肽，經過生物信息學分析比對顯示，與美國國立生物技術住處中心(NCBI)GenBank DNA序列數據庫和 Swiss-Prot蛋白數據庫中的已知基因和蛋白無同源性。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果
1、本發明篩選得到的多肽，分子量小，與血腦屏障的親和力高，特異性強，生物相容性好，合成方便，成本低廉。2、本發明篩選得到的多肽具有良好的腦靶向作用，可以用作腦部疾病靶向治療載體的構建。
圖1是噬菌體展示肽腦靶向性免疫熒光鑒定結果，
圖中顯示了噬菌體單克隆大鼠尾靜脈注射后在腦中的分布，其中A T分別對應展示肽序列編號為 1、5、8、11、14、16、19、20、21、24、25、28、30、31、33、36、37、40、41、44 的噬菌體。圖2為PLGA納米粒的平均粒徑及其粒徑分布。圖3為PLGA納米粒的kta電位測定結果。圖4是大鼠腦毛細血管內皮細胞(BCEC細胞)攝取多肽修飾納米載體的定性觀察，
圖B-J中用于細胞攝取的樣品分別是P印3-NP、P印6-LS、Pepll-PO, P印14-LS、 P印21-LS、P印26-NP、P印29-MC、P印31-MC、P印33-MC ； 圖A中為表面未連接多肽的納米粒(NP)。圖5為普通納米載體、噬菌體展示多肽修飾納米載體經裸鼠尾靜脈注射1 h后的活體分布結果，
圖A為對照裸鼠，尾靜脈注射的是表面未接多肽的脂質體(LS) ；B-J圖中的裸鼠分別尾靜脈給入P印4-P0、P印8-NP、P印 13-P0、P印 16-P0、P印27-MC、P印28-LS、P印30-MC、 P印38-P0、P印43-NPo
具體實施例方式本發明通過以下實施例作進一步說明，但不作為本發明的限制。實施例1噬菌體展示隨機環七肽庫的體內篩選
本發明采用噬菌體展示隨機肽庫篩選具有血腦屏障親和性的多肽，其包括步驟如
下
將NEW ENGLAND Biolabs的Ph. D-C7C 肽庫稀釋至1 X 101° pfu滴度，稀釋液為 TBS緩沖液(三羥甲基胺基甲烷，Tris) (50 mM Tris, 150 mM氯化鈉)，通過尾靜脈注射給入大鼠體內，60 min后處死大鼠，生理鹽水心臟灌流以除去體循環內非特異性的噬菌體。超凈臺內取出大鼠腦組織，無菌條件下勻漿，同時加入含1 mM苯基磺酰氟(PMSF)，20 μ g/mL 蛋白酶抑制劑(Aprotin)和1 μ g/mL亮抑酶肽(Leup印tin)的TBS ；用洗滌液TBST (0. 1% 吐溫-20)沖洗三次；加入甘氨酸洗脫緩沖液(0.2M Glycine-HCl,pH 2.2)將入腦的特異性噬菌體洗脫回收，加入150 UL TBSCpH 9.1)中和，收集上清，即為第一輪篩選獲得的噬菌體。取適量所得噬菌體，用處于對數生長期的ER2738大腸桿菌通過滴定法確定噬菌體的滴度，其余的噬菌體擴增后用于下一輪篩選。第二輪篩選時，洗滌液TBST中的吐溫-20濃度提高至0. 5%，洗滌次數增加至 5次，其余條件、步驟與第一輪相同。第三輪篩選時，洗滌液TBST中的吐溫-20濃度提高至1%，洗滌次數增加至8 次，其余條件、步驟與第一輪相同。第四輪篩選時，條件、步驟與第三輪相同。測定每一輪篩選獲得的噬菌體滴度，并從最后一輪結果中隨機挑取出噬菌體單克隆備用。實施例2噬菌體展示隨機十二肽庫的體內篩選
選用NEW ENGLAND Biolabs的Wi. D-12 肽庫。第一輪篩選方法如下將NEW ENGLAND Biolabs的Ph. D-C7C 肽庫稀釋至1 X 101° pfu滴度，稀釋液為TBS緩沖液(三羥甲基胺基甲烷，Tris ;50 mM Tris, 150 mM氯化鈉)，大鼠尾靜脈注射。60min后將大鼠麻醉， 無菌條件下抽取腦脊液100 μ L0取適量腦脊液用處于對數生長期的ER2738大腸桿菌通過滴定法確定噬菌體的滴度，其余的擴增后用于下一輪篩選。以此進行四輪篩選，測定每一輪篩選獲得的噬菌體滴度，并從最后一輪結果中隨機挑取出噬菌體單克隆備用。實施例1和實施例2中所用LB培養基均為本領域通用培養基，均為OXOID的
女口
廣 PFt ο實施例3噬菌體滴度的測定
將實施例1和實施例2中每輪篩選獲得的噬菌體用LB培養基進行10倍比的稀釋，取10 yL稀釋后的噬菌體與200 PL對數生長期的大腸桿菌ER2738菌液混勻，加入到 50°C預熱的LB頂層瓊脂(頂層瓊脂每升含10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，5 g氯化鈉，1 g氯化鎂和7 g瓊脂粉，高壓滅菌后備用)后迅速倒入含有異丙基-β -D-硫代半乳糖苷和 5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(IPTG/Xgal)的LB板，過夜，通過噬菌體藍斑數來計數。滴度計算公式噬菌體滴度(Pfu)=IOOX噬菌斑數X稀釋倍數，即每1 mL中噬菌體形成單位。展示腦靶向性多肽噬菌體的富集如表1、表2所示，經過四輪篩選后，由環七肽庫和十二肽庫四輪篩選得到的噬菌體的腦回收率均比第一輪提高了 200多倍，表明從腦中回收的噬菌體得到了明顯的富集，目標噬菌體具有腦親和性。表1為噬菌體隨機環七肽庫經四輪體內篩選，每一輪的腦內噬菌體回收率，通過從腦中回收噬菌體的量與給入量可以計算得到腦攝取率(％ID/g)。表2為噬菌體隨機十二肽庫經四輪體內篩選，每一輪的腦內噬菌體回收率， 通過從腦中回收噬菌體的量與給入量可以計算得到攝取率(％ID/g)。表 權利要求
1.具有腦靶向遞藥特性的多肽，其特征在于，所述多肽具有SEQID N0:1 10的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO: 11 20的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO: 21 44的氨基酸序列。
2.按權利要求1所述的具有腦靶向遞藥特性的多肽，其特征在于，所述多肽的25%或更多是由堿性氨基酸殘基K、H或R組成。
3.按權利要求1所述的具有腦靶向遞藥特性的多肽，其特征在于，所述SEQID N0:1 10的氨基酸序列的多肽由噬菌體展示隨機環七肽庫篩選獲得，所述多肽由9個氨基酸組成，包含一個環狀肽區域；該環肽區域由多肽兩端的半胱氨酸殘基形成的二硫鍵而被環化。
4.按權利要求1所述的具有腦靶向遞藥特性的多肽，其特征在于，所述SEQID NO: 11 20的氨基酸序列的多肽由噬菌體展示隨機十二肽庫篩選獲得；所述多肽為由12 個氨基酸組成的直鏈肽，其中包含至少一個或多個堿性氨基酸殘基K、H或R。
5.按權利要求1所述的具有腦靶向遞藥特性的多肽，其特征在于，所述的SEQID NO: 21 44的氨基酸序列的多肽是在SEQ ID NO: 1 10的氨基酸序列，或SEQ ID NO: 11 20的氨基酸序列中任何一多肽其氨基酸序列上增加、缺失或取代1 4個氨基酸后，獲得的衍生肽，它們的基本性質與原始肽相似。
6.權利要求1的具有腦靶向遞藥特性的多肽在制備與血腦屏障中的腦毛細血管內皮細胞特異親和特性制劑中的用途。
7.權利要求1的具有腦靶向遞藥特性的多肽在制備腦靶向遞藥系統中的用途。
8.按權利要求7的用途，其中所述的腦靶向遞藥系統是SEQID NO: 1 10或SEQ ID NO: 11 20或SEQ ID N0: 21 44的氨基酸序列的多肽修飾載藥納米粒、脂質體、泡囊或膠束制成。
全文摘要
本發明屬于蛋白質多肽技術領域，涉及具有腦靶向遞藥特性的多肽，包括所述肽的分子結構及其在制備腦靶向遞藥中的應用。本發明通過噬菌體展示技術，經SpragueDawley遠交群大鼠(SD大鼠)體內多輪篩選，獲得具有穿透血腦屏障功能并能在腦內富集的噬菌體單克隆；經脫氧核苷酸(DNA)測序證實該些噬菌體展示多肽包含有共同序列。同時，經免疫組織化學方法及體內回收率比較，證實所獲得的多肽具有腦靶向遞藥特性。所述的多肽及其衍生肽可用于修飾載藥納米粒、脂質體、泡囊或膠束，構建成腦靶向遞藥系統。能夠提高藥物的腦內遞送，增強對于腦部疾病的治療效果，降低全身性的毒副作用。
文檔編號C07K7/06GK102174080SQ20111002980
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月27日 優先權日2010年9月19日
發明者馮亮, 李婧煒, 蔣新國 申請人:復旦大學