專利名稱：狂犬病毒糖蛋白衍生肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種多肽及其應(yīng)用，特別涉及一種狂犬病毒糖蛋白衍生肽(rabies virus glycoprotein-derived peptide, RDP)及其在制藥方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
老年性癡呆、腦腫瘤、精神性疾病等腦部疾病愈日俱增，嚴(yán)重威脅人類健康。治療腦部疾病的瓶頸之一在于血腦屏障，95%以上具有治療潛力的生物活性大分子如蛋白質(zhì)、核酸等都因無法穿越血腦屏障進入腦內(nèi)而不能發(fā)揮治療作用。此外，治療腦部疾病還需要解決的一個重要問題是如何實現(xiàn)腦部的靶向給藥，以減少全身給藥帶來的極大副作用。腦靶向給藥方法主要有三類一是侵入損傷性的直接給藥，包括高滲休克、頸動脈注射血管活性物質(zhì)和鞘內(nèi)或腦室內(nèi)注射給藥，但這種方法容易造成腦部感染以及外科性損傷，對腦有明顯的侵害性；二是增加藥物透過血腦屏障的能力，但這種方法對藥物本身的理化性質(zhì)要求較高，具有較大的局限性；三是由腦靶向給藥載體介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運，這種方法能夠增加藥物的腦內(nèi)靶向攝取，并且極大地降低對腦部的侵入性損傷，但目前尚無理想的能夠攜帶生物活性大分子的腦靶向給藥載體。因此，尋找能夠攜帶生物活性大分子穿透血腦屏障實現(xiàn)腦靶向給藥的載體是目前治療腦部疾病藥物研究中的重點和難點。狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein, RVG)由505個氨基酸殘基組成， 能夠攜帶其它物質(zhì)向中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運，還能夠促進其它病毒轉(zhuǎn)運到腦中。文獻報道，由 RVG衍生出來的長四個氨基酸的短肽(RVG29)可以攜帶包裹有DNA的納米粒子實現(xiàn)腦靶向轉(zhuǎn)運。在RVG^的羧基端添加九聚精氨酸(9R)形成嵌合肽RVG29-9R后，還能夠攜帶小干涉RNA (siRNA)穿越血腦屏障并將其傳遞給神經(jīng)元細胞，從而使大腦中特定基因發(fā)生沉默， 而且，重復(fù)進行RVG29-9R結(jié)合siRNA的治療不會誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥因子或抗肽抗體。
發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種RDP，其能夠攜帶生物活性大分子如蛋白質(zhì)等穿透血腦屏障，實現(xiàn)腦靶向給藥。為達到上述目的，本發(fā)明的RDP由RVG第189 214位或第330 357位肽段的羧基端通過連接肽與九聚精氨酸連接而得。進一步，所述RDP的氨基酸序列如SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2所示。九聚精氨酸富含正電荷，可以使RVG第189 214位或第33(Γ357位肽段定位并暴露在所攜帶的生物活性大分子如蛋白質(zhì)等的表面，從而更好地利用其嗜神經(jīng)性發(fā)揮腦靶向作用。連接肽在物理上將RVG第189 214位或第33(Γ357位肽段與九聚精氨酸分隔開來， 有利于RVG第189 214位或第33(Γ357位肽段與九聚精氨酸折疊成相互獨立的結(jié)構(gòu)域，消除二者之間可能存在的相互干擾，使二者各自更好地發(fā)揮作用。通常情況下，連接肽不會影響或較少影響RVG第18^214位或第33(Γ357位肽段形成正確的折疊和空間構(gòu)象。在本發(fā)明中，RVG第18^214位肽段的羧基端優(yōu)選通過連接肽GGGG與九聚精氨酸連接(SEQID No. 2)，第33(Γ357位肽段的羧基端優(yōu)選通過連接肽VNGGG與九聚精氨酸連接(SEQ ID No. 1)。本發(fā)明的目的之二在于提供所述RDP在制備腦靶向給藥載體中的應(yīng)用，為難以穿越血腦屏障的生物活性大分子及其它活性小分子的腦靶向轉(zhuǎn)運提供一種高效、安全、非侵入性的方法，提高腦部疾病的治療效果。為達到上述目的，本發(fā)明分別以難以穿越血腦屏障的β-半乳糖苷酶 (β -galactosidase, β—Gal)禾口增強型綠色焚光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)作為生物活性大分子模板，通過基因工程重組技術(shù)利用大腸桿菌表達制備了所述RDP與β -Gal或EGFP的融合蛋白RDP-β -Gal和RDP-EGFP，并考察了這兩種融合蛋白在人神經(jīng)母細胞瘤SK-N-SH細胞中的跨膜轉(zhuǎn)運情況以及在小鼠體內(nèi)跨血腦屏障的腦靶向轉(zhuǎn)運情況。結(jié)果顯示，本發(fā)明的RDP能夠快速、特異地介導(dǎo)大分子蛋白質(zhì)β-Gal和EGFP 跨血腦屏障的腦靶向轉(zhuǎn)運，可用于制備腦靶向給藥載體。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了一種RDP及其在制備腦靶向給藥載體中的應(yīng)用，為難以穿越血腦屏障的生物活性大分子及其它活性小分子的腦靶向轉(zhuǎn)運提供了一種高效、安全、非侵入性的方法，有助于提高腦部疾病的治療效果，在腦部疾病的新藥研發(fā)和臨床治療領(lǐng)域具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
圖1為重組質(zhì)粒pET28a(+)-RDP-β -Gal構(gòu)建圖。圖2為雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pET28a(+)-RDP_i3 -Gal，其中1泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，2泳道為重組質(zhì)粒pET28a(+)-RDP-i3 -Gal，3泳道為雙酶切片段。圖3為融合蛋白RDP- β -Gal的SDS-PAGE電泳，其中1泳道為未經(jīng)異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)的pET28a (+) -RDP- β -Gal轉(zhuǎn)化菌，2泳道為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的 pET28a (+) - RDP- β -Gal 轉(zhuǎn)化菌，3 泳道為經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)的 pET28a (+) -RDP- β -Gal 轉(zhuǎn)化菌超聲破碎后的離心上清液，4泳道為純化后的融合蛋白RDP-β -Gal，5泳道為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖4為融合蛋白RDP-β-Gal以不同濃度處理SK_N_SH細胞和Hela細胞，其中 A為SK-N-SH細胞空白對照，B為用50 μ g/ml的RDP- β -Gal處理SK-N-SH細胞，C為用 25 μ g/ml的RDP-P-Gal處理SK-N-SH細胞，D為Hela細胞空白對照，E為用50 μ g/ml的 RDP- β -Gal 處理 Hela 細胞，F(xiàn) 為用 25 μ g/ml 的 RDP- β -Gal 處理 Hela 細胞。圖5為融合蛋白RDP-β -Gal靜脈注射后在大腦和延髓中的分布。圖6為融合蛋白RDP-β -Gal靜脈注射后在肝、肺、心、脾、腎中的分布。圖7為融合蛋白RDP-EGFP的SDS-PAGE電泳，其中1泳道為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，2 泳道為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET28a(+)轉(zhuǎn)化菌，3泳道為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET28a(+)-RDP-EGFP 轉(zhuǎn)化菌，4泳道為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET28a (+) -RDP-EGFP轉(zhuǎn)化菌，5泳道為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的 pET28a (+) -RDP-EGFP轉(zhuǎn)化菌超聲破碎后的離心上清液，6_7泳道為純化后的融合蛋白 RDP-EGFP。圖8為融合蛋白RDP-EGFP靜脈注射后在大腦中的分布。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件， 例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1、RDP介導(dǎo)的β -Gal腦靶向轉(zhuǎn)運
本實施例使用的RDP的氨基酸序列為MGKSVRTffNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNGGG-RRRRRRRRR (SEQ ID No. 1)，由RVG第33(Γ357位肽段(下劃線部分)的羧基端通過連接肽 VNGGG與九聚精氨酸連接而得，命名為RDPl。一、融合蛋白RDP-β -Gal的制備
1、重組質(zhì)粒pET28a(+)-RDP-β -Gal的構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a(+)-RDP-β -Gal的構(gòu)建示意圖如圖1所示。首先，設(shè)計并合成RDPl cDNA,核苷酸序列如下ataccatgggcaaaagcgtgcgtacctgg aat-gaaattatcccgagcaaaggctgcctgcgtgtgggtggccgttgccatccgcatgtgaatggtggcggtcgtc gccgtcgccgtcgccgtcgccgt￡tcgacat( SEQ ID No. 3，下戈lj線部分分另lj為 Nco I 禾口 Sal I 酶切位點)，將合成的cDNA用限制性內(nèi)切酶Nco I和Ml I雙酶切，再與同樣經(jīng)Nco I和Ml I 雙酶切的質(zhì)粒pET28a(+)在T4 DNA連接酶的作用下連接，獲得重組質(zhì)粒pET28a (+)-RDP。其次，根據(jù)質(zhì)粒pCMV-β上的Lac Z基因(S卩β-Gal基因)序列設(shè)計并合成如下弓丨物上游弓丨物 Lacl-2 :5，-tataagcttggaggctcagtcgttttacaac-3，(SEQ ID No. 5, T 劃線部位為 Hind III酶切位點)，下游引物 Lac2 :5，-tcactcgagtttttgacaccagaccaac-3‘ (SEQ ID No. 6，下劃線部位為B10 I酶切位點)；以質(zhì)粒pCMV-β為模板，應(yīng)用上述引物， PCR擴增兩端分別帶有Hind III和Bio I酶切位點的Lac Z基因片段(總長度為3072bp)； PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，用限制性內(nèi)切酶Hind III和Β ο I雙酶切，再與同樣經(jīng)Hind III和 Xho I雙酶切的重組質(zhì)粒pET28a(+)-RDP在T4 DNA連接酶的作用下連接，即得重組質(zhì)粒 pET28a (+)-RDP- β -Gal。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a(+)-RDP-β -Gal用Hind III和Xho I雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示，從重組質(zhì)粒中酶切出大小分別約5500bp和3000bp的兩個片段，與理論值一致。同時，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a(+)-RDP-i3-Gal送測序公司進行測序，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒中正確地插入了 RDPl基因和β-Gal基因。說明重組質(zhì)粒 pET28a (+) -RDP- β -Gal 構(gòu)建成功。2、融合蛋白RDP- β -Gal的表達與純化
將含有重組質(zhì)粒pET28a(+)-RDP-β -Gal的大腸桿菌BL21用LB培養(yǎng)基在溫度37°C條件下培養(yǎng)，待生長至OD6tltl值為0. 6 0. 8時，加入終濃度為0. 5mM的IPTG，溫度25°C誘導(dǎo)4 小時，收集菌體，超聲破碎至菌液清澈，離心取上清液，用孔徑為0. 45 μ m的濾膜過濾后，用 Ni2+親和層析柱(天根生化科技(北京)有限公司)純化，即得融合蛋白RDP-β -Gal。分別取經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET28a(+)-RDP-β -Gal轉(zhuǎn)化菌、超聲破菌后的離心上清液以及純化后的融合蛋白RDP-β -Gal進行10%的SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖3所示，與未經(jīng) IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化菌相比，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化菌在分子量120KDa附近有明顯的新生蛋白條帶出現(xiàn)，與融合蛋白RDP-i3-Gal的分子量相符；超聲破菌后的離心上清液中含有融合蛋白
5RDP-β -Gal，說明該融合蛋白為可溶性表達。二、融合蛋白RDP-β -Gal在人神經(jīng)母細胞瘤SK_N_SH細胞中的跨膜轉(zhuǎn)運
將融合蛋白RDP- β -Gal分別以終濃度為50 μ g/ml、25 μ g/ml加入到體外培養(yǎng)的 SK-N-SH細胞中，以Hela細胞為對照細胞，同時設(shè)空白對照，孵育5小時后用PBS洗滌細胞 4次，分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為m的甲醛溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 2%的異戊醇溶液于溫度4°C條件下固定10分鐘，再用PBS洗滌細胞3次，加入X-gal顯色液，溫度37°C避光染色，最后將細胞置顯微鏡下觀察及拍照，檢測融合蛋白RDP-i3-Gal的跨膜轉(zhuǎn)運活性。結(jié)果如圖4所示，SK-N-SH細胞空白對照、Hela細胞空白對照以及用不同濃度融合蛋白處理的Hela細胞用X-gal顯色液染色后均無藍染出現(xiàn)，而用不同濃度融合蛋白處理的SK-N-SH細胞用X-gal顯色液染色10分鐘即出現(xiàn)藍染，且隨著染色時間延長，藍染程度逐漸加深，2小時后藍色達到飽和，提示融合蛋白RDP- β -Gal具有強的嗜神經(jīng)性，能夠特異地靶向神經(jīng)細胞轉(zhuǎn)運；同時，用高濃度融合蛋白處理的SK-N-SH細胞明顯較低濃度融合蛋白處理的SK-N-SH細胞的藍染程度深，說明融合蛋白的濃度越高，跨膜轉(zhuǎn)運到SK-N-SH細胞中的融合蛋白的量越高，即融合蛋白RDP- β -Gal在SK-N-SH細胞中的跨膜轉(zhuǎn)運活性呈一定的濃度依賴性。三、融合蛋白RDP-β -Gal在小鼠體內(nèi)跨血腦屏障的腦靶向轉(zhuǎn)運
將昆明小鼠按5mg/kg的劑量尾靜脈注射融合蛋白RDP-β -Gal，同時設(shè)β -Gal對照組和空白對照組(control)，分別于注射后15分鐘和5小時處死小鼠，取大腦、延髓、心、肝、 脾、肺、腎等組織，置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 2%的多聚甲醛溶液中固定，依次用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、30% 的蔗糖溶液在溫度4°C條件下脫水，用OCT樹脂冷凍包埋，40 μ m冷凍組織切片；將組織切片置六孔板中，用PBS洗滌1次，加入X-gal顯色液，溫度37°C避光染色過夜，最后將組織切片置顯微鏡下觀察及拍照，檢測融合蛋白RDP-β -Gal在小鼠體內(nèi)的分布。結(jié)果如圖5飛所示，小鼠靜脈注射融合蛋白RDP-β -Gal 15分鐘后，其大腦、延髓灰質(zhì)區(qū)和海馬區(qū)均出現(xiàn)明顯藍染，而β-Gal對照組和空白對照組未出現(xiàn)明顯藍染，說明 RDP能夠快速(15分鐘以內(nèi))攜帶大分子蛋白質(zhì)β -Gal穿透血腦屏障進入腦內(nèi)，廣泛分布于大腦和延髓神經(jīng)元中，并與海馬神經(jīng)元有較強的結(jié)合能力；同時，小鼠靜脈注射融合蛋白 RDP-β -Gal后，與β -Gal對照組和空白對照組相比，其心、肝、脾、肺組織的藍染程度未出現(xiàn)明顯變化，而腎臟在注射15分鐘后藍染程度明顯增強，提示RDP能夠攜帶大分子蛋白質(zhì) β -Gal特異地靶向腦組織，其主要由腎臟代謝出體外。綜合上述實驗結(jié)果，β-Gal為分子量約116kD的大分子蛋白質(zhì)，本身不能穿過生物膜。本發(fā)明將RDP與β -Gal形成融合蛋白RDP-β -Gal，用該融合蛋白處理SK-N-SH細胞，經(jīng)X-gal染色后可見胞內(nèi)有藍染出現(xiàn)，表明該融合蛋白可穿過SK-N-SH細胞膜，而在對照Hela細胞中，不管融合蛋白處理濃度高低及處理時間長短，經(jīng)X-gal染色后胞內(nèi)均無藍染出現(xiàn)，說明該融合蛋白未進入Hela細胞中，從而初步證實融合蛋白RDP-β-Gal可選擇性地進入神經(jīng)細胞。在體內(nèi)實驗中，小鼠靜脈注射融合蛋白RDP-^-Gal后，大腦、延髓神經(jīng)元和海馬神經(jīng)元經(jīng)X-gal染色均出現(xiàn)明顯的藍色，腎臟經(jīng)X-gal染色也出現(xiàn)比對照組更明顯的藍色，而其他外周組織如心、肝、脾、肺等未見明顯藍染出現(xiàn)，說明RDP能夠介導(dǎo)β -Gal快速穿越血腦屏障并選擇性地進入中樞神經(jīng)細胞中，與細胞實驗結(jié)果一致。實施例2、RDP介導(dǎo)的EGFP腦靶向轉(zhuǎn)運本實施例使用的RDP的氨基酸序列為MGCDIFTKSRGKRASKGSETCGFVDERGGGG-RRRRRRRRR (SEQ ID No. 2)，由RVG第189 214位肽段(下劃線部分)的羧基端通過連接肽 GGGG與九聚精氨酸連接而得，命名為RDP2。一、融合蛋白RDP-EGFP的制備
1、重組質(zhì)粒pET28a(+)-RDP-EGFP的構(gòu)建
首先，設(shè)計并合成RDP2 cDNA,核苷酸序歹丨J如下:ataccat￡ggcaaaagcgtgcgtacctggaatg aaattat cccgagcaaaggctgcctgcgtgtgggtggccgttgccatccgcatgtgaatggtggcggtcgtcgccg tcgccgtcgccgtcgccgtKtcgacatt (SEQ ID No. 4，下劃線部分分別為 Nco I 和 Sal I 酶切位點)，將合成的cDNA用限制性內(nèi)切酶Nco I和Ml I雙酶切，再與同樣經(jīng)Nco I和Ml I雙酶切的質(zhì)粒pET28a(+)在T4 DNA連接酶的作用下連接，獲得重組質(zhì)粒pET28a (+)-RDP。其次，將質(zhì)粒pEGFP上的EGFP基因序列經(jīng)酶切后，在T4 DNA連接酶的作用下直接連接到重組質(zhì)粒pET28a (+) -RDP上，即得重組質(zhì)粒pET28a (+) -RDP-EGFP。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a(+)-RDP-EGFP送測序公司進行測序，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒中正確地插入了 RDP2基因和EGFP基因。2、融合蛋白RDP-EGFP的表達與純化
將含有重組質(zhì)粒pET28a(+)-RDP-EGFP的大腸桿菌BL21用LB培養(yǎng)基在溫度37°C條件下培養(yǎng)，待生長至OD6tltl值為0. 6^0. 8時，加入終濃度為0. 5mM的IPTG，溫度25°C誘導(dǎo)4小時， 收集菌體，超聲破碎至菌液清澈，離心取上清液，用孔徑為0. 45 μ m的濾膜過濾后，用Ni2+親和層析柱(天根生化科技(北京)有限公司)純化，即得融合蛋白RDP-EGFP。分別取經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET28a(+)-RDP-EGFP轉(zhuǎn)化菌、超聲破菌后的離心上清液以及純化后的融合蛋白RDP-EGFP進行10%的SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖7所示，與未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化菌相比，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化菌在分子量22KDa附近有明顯的新生蛋白條帶出現(xiàn)， 與融合蛋白RDP-EGFP的分子量相符；超聲破菌后的離心上清液中含有融合蛋白RDP-EGFP， 說明該融合蛋白為可溶性表達。二、融合蛋白RDP-EGFP在小鼠體內(nèi)跨血腦屏障的腦靶向轉(zhuǎn)運
將昆明小鼠按5mg/kg的劑量尾靜脈注射融合蛋白RDP-EGFP，同時設(shè)空白對照組 (control)，然后將小鼠麻醉，依次用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液和生理鹽水進行心臟灌注，再分離小鼠大腦，依次用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、20%、30%的蔗糖溶液在溫度4°C條件下脫水，用OCT樹脂冷凍包埋，40 μ m冷凍組織切片；將組織放置在載玻片上，熒光封片劑封片。 最后將切片置熒光顯微鏡下觀察及拍照，檢測融合蛋白RDP-EGFP在小鼠大腦中的分布。結(jié)果如圖8所示，小鼠靜脈注射融合蛋白RDP-EGFP后，其大腦皮層和海馬等腦組織細胞中有大量熒光分布，說明RDP可攜帶EGFP通過血腦屏障進入小鼠中樞神經(jīng)細胞。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.狂犬病毒糖蛋白衍生肽，其特征在于由狂犬病毒糖蛋白第18纊214位或第33(Γ357 位肽段的羧基端通過連接肽與九聚精氨酸連接而得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的狂犬病毒糖蛋白衍生肽，其特征在于氨基酸序列如SEQID No. 1 或 SEQ ID No. 2 所示。
3.權(quán)利要求1所述的狂犬病毒糖蛋白衍生肽在制備腦靶向給藥載體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種狂犬病毒糖蛋白衍生肽及其應(yīng)用，該狂犬病毒糖蛋白衍生肽由狂犬病毒糖蛋白第189~214位或第330~357位肽段的羧基端通過連接肽與九聚精氨酸連接而得，可以快速、特異地攜帶生物活性大分子如蛋白質(zhì)等穿越血腦屏障，實現(xiàn)腦靶向給藥，可用于制備腦靶向給藥載體，從而為難以穿越血腦屏障的生物活性大分子及其它活性小分子的腦靶向轉(zhuǎn)運提供一種高效、安全、非侵入性的方法，有助于提高腦部疾病的治療效果，在腦部疾病的新藥研發(fā)和臨床治療領(lǐng)域具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號C07K19/00GK102174110SQ20111002562
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月24日
發(fā)明者付愛玲, 徐興然, 李曉榮, 胡昌華 申請人:西南大學(xué)