專利名稱：西地那非單克隆抗體及用于檢測西地那非的膠體金層析試紙條的制作方法
技術領域：
本發明屬于藥品檢驗領域，涉及西地那非單克隆抗體及用于檢測西地那非的膠體金層析試紙條。
背景技術：
西地那非(Sildenafil)，又譯昔多芬，是一種研發治療心血管疾病藥物時意外發明出的治療男性勃起功能障礙藥物，一股以其商業用名Viagra(中國大陸注冊名萬艾可， 臺灣和香港注冊名威而鋼)廣為人知。不過相對于商品名西地那非在中國的俗名“偉哥” 使用的更廣泛，影響也更大。目前，在國內好多中成藥或保健品中非法添加西地那非以達到臨床的療效，作為患者，在長期不知情的情況下服用含有西地那非的中成藥或保健品會引起嚴重的副作用。目前，檢測中成藥或保健品中是否含有偉哥成分，采用的是傳統的檢驗方法，須將提取的樣品帶回實驗室進行分析，或是使用大型的試驗車，這樣都很不方便，而且反應時間長，實驗耗資較大。西地那非屬于分子量小于1000的小分子化合物，本身不具備反應性和免疫原性， 為了實現西地那非的免疫檢測，不僅需要合成具備高效價的西地那非抗原，而且還需要篩選特異性強、敏感度高的西地那非單克隆抗體。但是目前尚沒有有關西地那非單克隆抗體的相關報道。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一株分泌西地那非單克隆抗體的雜交瘤細胞系。本發明的另一目的是提供該雜交瘤分泌的西地那非單克隆抗體及其應用。本發明的有一目的是提供一種用于檢測西地那非的膠體金層析試紙條。本發明的目的可通過如下技術方案實現一株分泌西地那非單克隆抗體的雜交瘤細胞系，保藏于中國典型培養物保藏中心 (CCTCC)，保藏號為CCTCC No. C2010123，保藏日期為2010年11月30曰。一種西地那非單克隆抗體，由保藏號為CCTCC No. C2010123的雜交瘤細胞系產生。本發明利用人工合成抗原N-乙酸西地那非-BSA為免疫原，經過Balb/c小白鼠皮下免疫，加強免疫后取小白鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞做細胞融合、篩選及克隆化，建立了穩定分泌西地那非單克隆抗體的雜交瘤細胞株CCTCC No. C2010123。經ELISA、Western Blot、 膠體金免疫層析方法的鑒定，該雜交瘤細胞株所分泌的單克隆抗體能特異識別西地那非。本發明所述的西地那非單克隆抗體在制備西地那非膠體金檢測試劑中的應用。所述的西地那非檢測試劑為西地那非檢測用膠體金層析試紙條。一種用于檢測西地那非的膠體金層析試紙條，包含襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標結合墊、包被膜和吸水墊組成，金標結合墊為吸附西地那非金標抗體的聚酯纖維
4氈，在包被膜上有N-乙酸西地那非-BSA抗原溶液包被的直線式檢測線T線，和用羊抗鼠 IgG溶液包被的直線式對照線C線，兩條線豎向平行排列，所述的西地那非金標抗體是本發明所述的西地那非單克隆抗體的膠體金標記物。所述的西地那非抗原為西地那非人工合成抗原。所述的西地那非人工合成抗原為
權利要求
1.一株分泌西地那非單克隆抗體的雜交瘤細胞株2H5B12C3，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO :C2010123o
2.一種西地那非單克隆抗體，其特征在于由權利要求1所述的保藏號為CCTCCN0 C2010123的雜交瘤細胞株產生。
3.權利要求2所述的西地那非單克隆抗體在制備西地那非檢測試劑中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述的西地那非檢測試劑為西地那非檢測用膠體金層析試紙條。
5.一種用于檢測西地那非的膠體金層析試紙條，包含襯板(7)和在襯板(7)上依次銜接的樣品墊(1)、金標結合墊O)、包被膜(3)和吸水墊(6)組成，金標結合墊(2)為吸附西地那非單克隆抗體膠體金標記物和鼠IgG單克隆抗體膠體金標記物的聚酯纖維氈，在包被膜(3)上有用西地那非抗原溶液包被直線式檢測線T線G)，和用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對照線C線(5)，兩條線豎向平行排列，其特征在于所述的西地那非單克隆抗體膠體金標記物是權利要求2所述的西地那非單克隆抗體的膠體金標記物。
6.根據權利要求5所述的用于檢測西地那非的膠體金層析試紙條，其特征在于所述的西地那非抗原為西地那非人工合成抗原。
7.根據權利要求6所述的用于檢測西地那非的膠體金層析試紙條，其特征在于所述的西地那非人工合成抗原為
8.根據權利要求7所述的用于檢測西地那非的膠體金層析試紙條，其特征在于所述的載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或人血藍蛋白，優選牛血清白蛋白或雞卵清白蛋白，進一步優選牛血清白蛋白。
9.權利要求5所述的用于檢測西地那非的膠體金層析試紙條的制備方法，其特征在于包含如下步驟(1)制備式(1)所示的西地那非人工合成抗原；(2)制備西地那非單克隆抗體；(3)制備含抗西地那非單克隆抗體的膠體金標記物和鼠IgG單克隆抗體的膠體金標記物的混合溶液；(4)利用步驟C3)所述的含抗西地那非單克隆抗體的膠體金標記物和鼠IgG單克隆抗體的膠體金標記物的混合溶液制備西地那非單克隆抗體的金標結合墊；(5)在包被膜上用所述的西地那非人工合成抗原溶液包被直線式檢測線T線，用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對照線C線，兩條線豎向平行排列；(6)組裝試紙條。
10.根據權利要求9所述的膠體金層析試紙條的制備方法，其特征在于a、步驟C3)所述的含抗西地那非單克隆抗體的膠體金標記物和鼠IgG單克隆抗體的膠體金標記物的混合溶液通過如下方法制備用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成 20nm-40nm的膠體金溶液；用0. lmol/LK2C03調節所述的膠體金溶液至最適pH 8. 5-9. 0，將純化的本發明西地那非單克隆抗體純水透析后，按3μ g/ml量加入膠體金溶液中，室溫電磁攪拌15-30min，然后按5μ g/ml的量加入鼠IgG單克隆抗體，室溫電磁攪拌15-30min， 逐滴加入絡蛋白溶液，使終濃度為0. 1%，持續攪拌5min，4°C下15000rpm離心lOmin， 棄去上清，將沉淀物用重懸液重新恢復至原體積混勻，再次離心一次，用重懸溶液將沉淀物混懸至原體積1/20，4°C保存備用，即獲得所述的含抗西地那非單克隆抗體的膠體金標記物和鼠IgG單克隆抗體的膠體金標記物的混合溶液，其中所述重懸液為含5%海藻的 0. 02Tris-HCL 緩沖液；b、步驟(4)所述的制備西地那非單克隆抗體的金標結合墊的方法為將1 20-1 10 稀釋的含抗西地那非單克隆抗體的膠體金標記物和鼠IgG單克隆抗體的膠體金標記物的混合溶液噴涂吸附于聚酯纖維氈中，27°C保溫干燥；c、步驟(6)所述的組裝試紙條的方法為將樣品墊、金標組合墊、包被膜和吸水墊依次粘附在襯板上，樣品墊置于襯板的一端，吸水墊置于襯板的另一端，包被膜置于襯板的中間，金標結合墊置于樣品墊和包被膜之間，即得到用于免疫檢測的西地那非膠體金層析檢測試驗紙大板，將大板按顧客要求分切成2. 5mm-7. Omm寬度規格的試紙條，密封干燥保存。
全文摘要
本發明屬于藥品檢驗領域，公開了西地那非單克隆抗體及用于檢測西地那非的膠體金層析試紙條。本發明西地那非單克隆抗體，由保藏號為CCTCC No.C2010123的雜交瘤細胞系產生。本發明所述的西地那非單克隆抗體理化特性高度均一、生物活性單一、與抗原西地那非結合的特異性強、便于人為處理和質量控制，可在制備西地那非檢測用膠體金層析試紙條中應用。一種用于檢測西地那非的膠體金層析試紙條，其金標結合墊上包被的金標抗體是本發明所述的西地那非單克隆抗體的膠體金標記物。使用本發明膠體金層析檢測試紙條，無需任何其它試劑和儀器，可現場操作，將樣品用提取液混合后，取上清液進行檢測，在5-10min即可判定檢測結果簡便、快速、時效性強。
文檔編號C07K16/44GK102174474SQ20111000472
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月11日 優先權日2011年1月11日
發明者吳迪宏, 歐衛軍, 王蕾, 蔣澄 申請人:南通市伊士生物技術有限責任公司