專利名稱：大腸桿菌外膜蛋白單克隆抗體及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及大腸桿菌外膜蛋白單克隆抗體及其制備方法和應用，屬于生物技術領域。
背景技術：
禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌引起，為對養禽業危害最為嚴重的疫病之一，目前，對大腸桿菌病的預防主要采用疫苗和抗菌藥物。但大腸桿菌血清亞型眾多，各血清型間的交叉免疫效果不佳，給疫苗和藥物的預防帶來一定困難。單克隆抗體是指由一個B細胞分化增殖的子代細胞產生的針對單一抗原決定簇的抗體，單抗具有較強的病原體特異性，不影響正常組織和細胞，相對比較安全，在細菌和病毒病的診斷和治療方面都發揮重要作用，也是研究蛋白質結構與功能的重要工具。大腸桿菌的外膜蛋白位于大腸桿菌菌體的表面，具有良好的免疫原性，可加快巨噬細胞對抗原的提呈作用，激活淋巴細胞的增殖反應，刺激機體產生體液免疫和細胞免疫；而且更為重要的是大腸桿菌的外膜蛋白在不同血清型菌株間具有交叉保護作用，能抵抗同源和異源菌株的攻擊。在目前一些大腸桿菌病的防治中都具有重要的應用價值。
發明內容
本發明的目的是提供一種大腸桿菌外膜蛋白單克隆抗體，該抗體是以克隆、表達、 純化的禽致病性大腸桿菌O78(Avian pathogenic Escherichia coli APEC O78)外膜蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤技術制備而成。本發明的單克隆抗體對同型大腸桿菌感染具有良好的中和活性和保護效率，可用于大腸桿菌的防治；而且該單克隆抗體特異性高、 敏感性強的，為今后通過免疫學方法快速、特異性的檢測大腸桿菌感染奠定了實驗基礎。本發明的另一目的是提供該大腸桿菌外膜蛋白單克隆抗體的制備方法和應用。本發明的目的是通過以下技術方案實現的本發明提供一種大腸桿菌外膜蛋白單克隆抗體，其特征在于以原核表達、純化的禽致病性大腸桿菌O78(Avian pathogenic Escherichia coli APEC O78)的外膜蛋白作為抗原，加入弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑乳化分別制成弗氏完全佐劑免疫原和弗氏不完全佐劑免疫原，免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤技術制備單抗，所制備抗體免疫球蛋白類型為 IgGh，其輕鏈為κ鏈抗體。其中，弗氏完全佐劑免疫原和弗氏不完全佐劑免疫原中禽致病性大腸桿菌O78的外膜蛋白與弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑體積比均為1 1。本發明還提供了該大腸桿菌外膜蛋白單克隆抗體的制備方法，其制備步驟如下(1)禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白OMPA原核表達及純化根據大腸桿菌外膜蛋白基因序列設計特異性引物，PCR擴增禽致病性大腸桿菌O78 外膜蛋白0ΜΡΑ，將OMPA先連接到PMD18T上測序，測序鑒定正確的OMPA分別以BamH I.Xhol 進行雙酶切后克隆到pET48a(+)上，轉化DH5ci感受態細胞，通過卡那霉素抗性篩選得到的陽性質粒pET48a(+)-OMPA再轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，通過抗性篩選陽性表達菌株，以 IPTG誘導目的蛋白表達，并以Ni-NTA His. Bind Resin純化柱純化禽致病性大腸桿菌Ore外膜蛋白0ΜΡΑ，最后調整濃度至50 μ g/mL ；(2)免疫性抗原的制備純化后的禽致病性大腸桿菌078外膜蛋白OMPA分別加入弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑乳化制成弗氏完全佐劑免疫原和弗氏不完全佐劑免疫原；⑶BALB/c小鼠免疫8周齡BALB/c小鼠腹腔注射制備的禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白弗氏完全佐劑免疫原0. 5mL/只；免疫后7天和14天后分別以弗氏不完全佐劑免疫原以相同的方法和劑量進行加強免疫；(4)單抗制備利用PEG法，進行細胞融合，融合7 10天后，對有生長的雜交瘤細胞進行陽性篩選，以全菌包被，應用間接ELISA篩選陽性雜交瘤細胞，獲得穩定表達禽致病性大腸桿菌O78 外膜蛋白的雜交瘤細胞株，并對此株單抗進行效價測定、亞類鑒定、穩定性測定及特異性與中和活性測定。其中，禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白的引物序列如下上游弓丨物ATTGGATCCGCTCCGAAAGATAACA下游引物TTCTCGAGTTAAGCCTGCGGCTGAGTTA本發明的大腸桿菌外膜蛋白單克隆抗體可用于檢測大腸桿菌。本發明的大腸桿菌外膜蛋白單克隆抗體還可用于制備防治大腸桿菌病的制劑。本發明中的禽致病性大腸桿菌Ore購自中國獸醫藥品監察所，其外膜蛋白有一個開放閱讀框(ORF)，長1041bp，編碼346個氨基酸，前21個為信號肽，成熟的OmpA由325個氨基酸殘基組成，相對分子質量為37KD。本發明中擴增到的禽致病性大腸桿菌Ore外膜蛋白大小97^p，原核表達的禽致病性大腸桿菌Ore外膜蛋白分子量為37KD。其中，禽致病性大腸桿菌O78也可以使用任何一株當前中國國內公開的大腸桿菌菌株，不影響本發明的實施。本發明首次利用雜交瘤技術制備出特異性高、敏感度強的新型抗大腸桿菌外膜蛋白OMPA單克隆抗體，具有廣泛的研究和商業使用價值，可以直接鑒定大腸桿菌的血清型， 篩選大腸桿菌制苗菌株，用于禽大腸桿菌致病機理的研究，本發明的抗體同時具有良好的中和活性和保護效率，可用于大腸桿菌病的治療，而且單抗可以用體內或體外方法無限量生產，易于純化和標準化。
圖1擴增的禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白OMPA片段電泳2 原核表達質粒 pET_28a (+) -OMPA
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白免疫性抗原的制備(1)外膜蛋白的克隆
根據Genebank中大腸桿菌K12W3110株(登錄號AP009048)的OMPA基因序列設計特異性引物，上游引物引入BamH I酶切位點，下游引物引入BiolI酶切位點。上游引物為:ATTGGATCCGCTCCGAAAGATAACA，下游引物TTCTCGAGTTAAGCCTGCGGCTGAGTTA。以禽致病性大腸桿菌O78的基因組為模板PCR擴增外膜蛋白0ΜΡΑ。將OMPA先連接到pMD18T上測序，測序鑒定正確的OMPA分別以BamH I、Xhol進行雙酶切后克隆到pET48a(+)上，轉化 DH5 α感受態細胞，通過卡那霉素抗性篩選得到的陽性質粒pET48a(+)-OMPA再轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，通過抗性篩選陽性表達菌株。(2)禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白原核表達菌株的誘導表達及純化將篩選出的禽致病性大腸桿菌 外膜蛋白原核表達陽性菌液按1 1000的比例接種加有Kan抗性的LB培養基中，每個菌接種兩管，一管用于誘導，另一管用于非誘導對照，同時要接種一管空質粒菌作為對照。37°C過夜培養至OD6tltlnm值約為0. 4 0. 5時，誘導管和空質粒對照管加入IPTG至終濃度為lmmol/L，非誘導對照不加，最終挑選表達能力高的兩個菌，用于大量的蛋白的表達。并按照常規的SDS-Page方法對表達產物進行鑒定。然后以Ni-NTAHis. Bind Resin純化柱純化蛋白，經測定純化后的蛋白濃度為396mg/L。(3)免疫性抗原的乳化將外膜蛋白稀釋至50 μ g/mL，分別加入等體積的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑混合，震蕩乳化半小時，分別制成弗氏完全佐劑免疫原和弗氏不完全佐劑免疫原，4°C保存實施例2禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白單克隆抗體的制備(l)BALB/c 小鼠免疫8周齡BALB/c小鼠腹腔注射制備的禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白弗氏完全佐劑免疫原0. 5mL/只；免疫后7d和14d后分別以弗氏不完全佐劑免疫原同法同劑量進行加強免疫。(2)雜交瘤細胞融合最后一次加強免疫后的第三天取免疫小鼠的脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞SP2/0按細胞數量4 1混合，利用經典的PEG法，進行細胞融合。(3)雜交瘤細胞的篩選融合后用HAT作為選擇性培養基，同時加入飼養細胞，分裝在96孔細胞培養板，置于37°C，5% CO2培養箱內培養，7 10天進行觀察，對有生長的雜交瘤細胞進行陽性篩選， 以全菌包被，應用間接ELISA篩選陽性雜交瘤細胞，同時用SP2/0細胞培養上清液作陰性對照。對于初步篩選的陽性菌株采用稀釋法進行克隆化和再克隆，反復篩選最終獲得了一株穩定表達禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白的雜交瘤細胞株8A4。(4)單抗腹水的制備分別將經降植烷處理的BALB/c小鼠，腹腔內注射鑒定后再克隆的雜交瘤細胞，注射量為5 X IO5個細胞，約經過一周，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，離心后取上清以親核層析法純化單抗。(5)單抗腹水效價的測定以禽致病性大腸桿菌O78全菌包被，采用間接ELISA測定單抗腹水效價為16000。(6)免疫球蛋白亞型鑒定
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采用Southern biotech公司單克隆抗體亞型鑒定試劑盒進行抗體亞型鑒定，最終確定禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白特異性單克隆抗體8A4免疫球蛋白類型為IgGh，其輕鏈均為κ鏈抗體。(7)單抗穩定性鑒定將所制備的單抗菌株8A4連續培養3個月或液氮凍存復蘇后，仍能穩定分泌McAb。實施例38A4株單抗特異性試驗以禽致病性大腸桿菌078、O1, O2和沙門氏菌標準毒株分別與篩選到的單克隆抗體 8A4株做玻板凝集試驗，用接種環沾取少量平板上的選擇禽致病性大腸桿菌078、O1, O2和沙門氏菌菌落，于生理鹽水中混勻，然后分別滴加到事先的標記好的潔凈載玻片上，并同時滴加單克隆抗體8A4株，設置禽致病性大腸桿菌O78W1W2和沙門氏菌與生理鹽水及單抗與生理鹽的對照組。結果見表1，結果表明本單克隆抗體具有良好的特異性，只與禽致病性大腸桿菌Ore反應呈陽性，與禽致病性大腸桿菌Op O2型均呈陰性，與沙門氏菌也不存在交叉反應。表1單抗8A4株特異性鑒定
權利要求
1.一種大腸桿菌外膜蛋白單克隆抗體，其特征在于以原核表達、純化的禽致病性大腸桿菌078(Avian pathogenic Escherichia coli APEC O78)的外膜蛋白作為抗原，加入弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑乳化分別制成弗氏完全佐劑免疫原和弗氏不完全佐劑免疫原，免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤技術制備單抗，所制備抗體免疫球蛋白類型為化6加，其輕鏈為κ鏈抗體。
2.如權利要求1所述的大腸桿菌外膜蛋白單克隆抗體，其特征在于弗氏完全佐劑免疫原和弗氏不完全佐劑免疫原中禽致病性大腸桿菌Ore的外膜蛋白與弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑體積比均為1 1。
3.如權利要求1-2任一項所述的大腸桿菌外膜蛋白單克隆抗體的制備方法，其制備步驟如下(1)禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白OMPA原核表達及純化根據大腸桿菌外膜蛋白基因序列設計特異性引物，PCR擴增禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白0ΜΡΑ，將OMPA先連接到PMD18T上測序，測序鑒定正確的OMPA分別以BamH I、Xhol 進行雙酶切后克隆到pET48a(+)上，轉化DH5ci感受態細胞，通過卡那霉素抗性篩選得到的陽性質粒pET48a(+)-OMPA再轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，通過抗性篩選陽性表達菌株，以 IPTG誘導目的蛋白表達，并以Ni-NTA His. Bind Resin純化柱純化禽致病性大腸桿菌Ore外膜蛋白0ΜΡΑ，最后調整濃度至50 μ g/mL ；(2)免疫性抗原的制備純化后的禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白OMPA分別加入弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑乳化制成弗氏完全佐劑免疫原和弗氏不完全佐劑免疫原；(3)BALB/c小鼠免疫8周齡BALB/c小鼠腹腔注射制備的禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白弗氏完全佐劑免疫原0. 5mL/只；免疫后7天和14天后分別以弗氏不完全佐劑免疫原以相同的方法和劑量進行加強免疫；(4)單抗制備利用PEG法，進行細胞融合，融合7 10天后，對有生長的雜交瘤細胞進行陽性篩選， 以全菌包被，應用間接ELISA篩選陽性雜交瘤細胞，獲得禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白的雜交瘤細胞株，并對此株單抗進行效價測定、亞類鑒定、穩定性測定及特異性與中和活性測定。
4.如權利要求3所述的大腸桿菌外膜蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白的引物序列如下上游引物ATTGGATCCGCTCCGAAAGATAACA 下游引物TTCTCGAGTTAAGCCTGCGGCTGAGTTA。
5.如權利要求1-2任一項所述的大腸桿菌外膜蛋白單克隆抗體在檢測大腸桿菌中的應用。
6.如權利要求1-2任一項所述的大腸桿菌外膜蛋白單克隆抗體在制備防治大腸桿菌病的制劑中的應用。
全文摘要
本發明屬于獸醫生物技術領域，具體涉及大腸桿菌外膜蛋白單克隆抗體及其制備方法和應用。本發明的抗體是以克隆、表達、純化的禽致病性大腸桿菌O78(AvianpathogenicEscherichiacoliAPECO78)外膜蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤技術制備而成。該抗體特異性高、敏感性強，為今后通過免疫學方法快速、特異性的檢測大腸桿菌感染奠定了實驗基礎，同時通過實驗還證明了本發明的單克隆抗體對同型大腸桿菌感染具有良好的中和活性和保護效率，可用于大腸桿菌病的防治。
文檔編號C07K14/245GK102584992SQ201110001650
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月6日 優先權日2011年1月6日
發明者盧會英, 杜金玲, 牟巍, 王勇鶼, 趙亞榮, 郭書豪 申請人:北京大北農科技集團股份有限公司, 福州大北農生物技術有限公司