專利名稱：一種赭曲霉毒素b的制備方法
技術領域：
本發明涉及從赭曲霉毒素高產菌株的大米培養物中分離純化赭曲霉毒素B(OTB) 的方法。
背景技術：
赭曲霉毒素(Ochratoxins)是ー類對人和動物健康有害的真菌代謝產物，主要由赭曲霉(Aspergillus)和青霉(Penicillium)在適宜的環境條件下產生，基本結構為異香豆素連接到β -苯丙氨酸上的衍生物，有Α、B、C、D等7種類型。目前，赭曲霉毒素污染食品和中藥材的問題日趨嚴重，為了保證檢測分析所需赭曲霉毒素標準品的供給，獲得大量、高純度的赭曲霉毒素，我們選擇了高產的赭曲霉進行大米培養，從中分離純化出高純度的赭曲霉毒素B，為該真菌毒素的深入研究提供了基礎。
發明內容
本發明的目的是提供從赭曲霉毒素高產菌株的大米培養物中分離純化赭曲霉毒素B的方法。本發明的技術方案依次包含如下方法步驟1.篩選高產菌株2.分離純化赭曲霉毒素B
具體實施例方式下面所實施例有助于本領域技術人員更好地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。1.篩選高產菌株根據我們前期的工作基礎，考察培養條件(溫度、濕度、光照、PH值、碳源、氮源等) 對產毒菌株生長及產毒量的影響，優化培養條件，篩選產赭曲霉毒素的高產菌株，通過大米培養，得到培養物。2.分離純化赭曲霉毒素B應用反相中壓制備色譜、凝膠LH-20柱色譜和反相高壓制備色譜等技術對該培養物中的赭曲霉毒素進行分離和純化，建立赭曲霉毒素B的制備方法。對赭曲霉毒素高產菌株的大米培養物Qkg)進行粉碎，用80%的乙醇溶液加熱回流提取4次，每次提取時間為2小吋，合并提取液減壓濃縮至無醇味時，轉入分液漏斗中，采用等體積乙酸乙酯進行萃取，萃取四次后，合并萃取液，減壓濃縮得到乙酸乙酯萃取物。將該萃取物溶于甲醇中，過濾除去不溶物，濾液濃縮后，采用反相中壓制備色譜進行分離，依次以30%、50%、70%和100%甲醇/水溶液梯度洗脫，薄層檢查各流份，對含有藍色熒光的流份進行合井，合并后的流份濃縮過濾后，采用凝膠LH-20柱色譜分離，甲醇洗脫，得到含毒素的粗品，對該粗品進行反相高效液相制備色譜分離，薄層檢查各流份，回收溶剤，得到白色固體，經甲醇重結晶后，得到無色晶體ang。赭曲霉毒素B(0chratoxin B)[1]，分子式為 C2tlH19NO6,分子量為 369。ESI-MS :m/ ζ 370 [M+H]392 [M+Na]761 [2M+Na]+ ； 1H NMR(CDCl3,600MHz) δ :8. 32 (1H, d, J = 7. 8Hz, H-7) ,7. 21-7. 29 (5H, m, H-17 21)，6·83(1Η，d, J = 8. 4Hz, H-6) ,4. 99 (1H, m, H_3)， 4. 76 (1H, td, J = 6. 0，4. 2Hz，H-14)，3. 32 (1H, dd, J = 14. 4，5. 4Hz, H_15b)，3. 19 (1H, J =13. 8，6· 6Hz，H-15a)，2· 99(1H，m，H-4b)，2· 97(1H，m，H-4a)，1. 55(3H，d, J = 6. OHz, H-ll) ； 13C NMR(CDCl3,150MHz) δ 173. 6 (C-22), 170. 3 (C-I), 164. 2 (C-12), 160. 4 (C-9), 143. 9(C-5)，138. 9(C-16)，136. 4(C_7)，129. 5(C-17,21)，128. 6 (C-18,20)，127.1 (C-19)， 119. 2 (C-6), 118. 7 (C_8)，108. 8 (C-IO)，76. 4 (C_3)，54. 3 (C-14)，37. 7 (C-15)，34. 7 (C_4)， 20. 7(C-Il)。儀器和試劑Bruker AV-600型超導核磁共振儀；LTQ Orbitrap XL質譜儀；德國LUMTECH液相色譜儀K-1001 ；薄層板GF254 (青島海洋化工廠廠品)；試劑為分析純(北京化工廠)。薄層條件展開劑氯仿/甲醇/甲酸10 1 0. 05 (ν ν ν)；檢測波長254nm和365nm。色譜條件色譜柱=Kromasil MZ-C18 (10 μ m，250 X I(Mim)；流動相甲醇/水，梯度洗脫；流速 2ml/min ；柱溫常溫；檢測波長333nm。參考文獻[1]M. W. Bredenkamp, J. L. Μ. Dillen, P. H. van Rooyen, P. S. Steyn. Crystal Structures and Conformational Analysis of Ochratoxin A and B :Probing the Chemical Structure causing Toxicity. J. CHEM. S0C. PERKIN TRANS. II，1989，1835-1839.
圖1-赭曲霉毒素B的結構圖2-分離流程圖3-赭曲霉毒素B的氫譜圖4-赭曲霉毒素B的碳譜
權利要求
1. ー種赭曲霉毒素B的制備方法，其特征在于對赭曲霉毒素高產菌株的大米培養物進行粉碎，用80%乙醇溶液加熱回流提取4次，每次提取時間為2小吋，合并提取液減壓濃縮至無醇味，轉入分液漏斗中，等體積乙酸乙酯進行萃取，萃取四次后，合并萃取液，減壓濃縮得到乙酸乙酯萃取物，將該萃取物溶于甲醇中，過濾除去不溶物，濾液濃縮后，采用反相中壓制備色譜進行分離，依次以30 %、50 %、70 %和100 %甲醇/水溶液梯度洗脫，薄層檢查各流份，對含有藍色熒光的流份進行合井，合并后的流份濃縮過濾后，采用凝膠色譜分離， 甲醇洗脫，得到含毒素的粗品，對該粗品進行反相高壓制備色譜分離，薄層檢查各流份，合并后回收溶剤，得到白色固體，經甲醇重結晶后，得到赭曲霉毒素B (OTB)。
全文摘要
本發明涉及一種赭曲霉毒素B的制備方法，所說赭曲霉毒素B是從赭曲霉毒素高產菌株的大米培養物中，應用反相中壓制備色譜、凝膠LH-20柱色譜和反相高壓制備色譜等技術分離純化獲得的，該工藝簡單，收率提高，成本降低，極有利于工業化生產。
文檔編號C07D311/76GK102584772SQ20111000080
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月5日 優先權日2011年1月5日
發明者吳海峰, 楊美華, 許旭東, 高微微 申請人:中國醫學科學院藥用植物研究所