具有纖溶亢進的凝血病的治療的制作方法

專利名稱：具有纖溶亢進的凝血病的治療的制作方法
具有纖溶亢進的凝血病的治療本發(fā)明涉及具有纖溶亢進的凝血病的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及血友病例如A型血友病或B型血友病的治療。本發(fā)明要求PCT申請PCT/EP2009/004218的優(yōu)先權(quán)，所述申請的公開內(nèi)容完全并入本文。血友病是損害身體控制血凝或血液凝固的能力的一組遺傳性障礙，所述能力用于當血管破裂時阻止出血。A型血友病，最常見的形式，因因子VIII的基因突變引起；B型血友病，也稱為克雷司馬斯病(Christmasdisease)，因因子IX的基因突變引起。B型血友病，與A型血友病一樣，是X染色體連鎖的并且占約12%的血友病病例。癥狀與A型血友病的癥狀相同受傷后過度出血；以及自發(fā)出血，特別地至承重關(guān)節(jié)、軟組織和粘膜內(nèi)的自發(fā)出血。至關(guān)節(jié)內(nèi)的反復出血導致關(guān)節(jié)積血，從而引起通常必需進行關(guān)節(jié)置換術(shù)的令人疼痛的嚴重關(guān)節(jié)病。軟組織中的血腫可導致包含壞死的凝固的血液的假腫瘤(pseudo tumor);它們可阻塞、擠壓或破裂至相鄰的器官內(nèi)并且可導致感染。一旦形成，血腫就難以治療，即使進行手術(shù)也是如此。擠壓后神經(jīng)的恢復不佳，從而導致麻痹。牽涉胃腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)或氣道/腹膜后空間的那些出血事件，如果未被檢測到的話，可導致死亡。顱內(nèi)出血是血友病患者的主要死亡原因。據(jù)估計，在美國有100，000例先天性血友病病例。在這些先天性血友病中，約20，000例為B型血友病病例，此類患者的血液完全缺乏因子IX或嚴重缺乏血漿因子IX組分。因此，該疾病存在不同的嚴重程度，需要每周一次至每年一次或兩次的治療。完全缺乏的病例需要每周一次的替代治療；部分缺乏的病例僅在發(fā)生出血事件時才需要治療，所述出血事件可少至每年一次。先天性部分缺乏的病例中，出血事件通常由臨時獲得的易感性而非僅由損傷造成。充足的大量新鮮血漿或等量的新鮮血液的靜脈內(nèi)注射暫時校正缺陷受試者的缺陷。有益作用通常持續(xù)2或3周，雖然通過體外測試對患者血液測量的凝血缺陷似乎僅改善了 2或3天。這樣的利用新鮮血漿或新鮮血液的療法是有效的，但其具有幾個嚴重缺點(1)其需要隨時可獲得大量新鮮血漿；(2)需要住院來施用血漿；(3)許多患者對重復的血液或血漿輸注變得敏感并且最終遭致致死性輸血反應；(4)血漿充其量僅可部分緩解缺乏；以及(5)長期的治療或手術(shù)是不可能的，因為所需要的大量血液或血漿將引起急性和致死性水腫。改進的療法包括，利用因子VIII或因子IX濃縮物的靜脈內(nèi)替代療法。然而，同樣地該療法也受到幾個不利方面的困擾(1)當治療重大出血事件時，即使進行了迅速的檢測和治療，組織損傷也仍然存在；(2)許多患者變得抗拒凝血因子并且產(chǎn)生針對凝血因子的抑制性抗體(所謂的具有抑制劑的血友病)；(3)盡管使用了改進的病毒滅活法，但仍然存在增加的被致死性病毒例如HIV和丙型肝炎病毒污染的風險(據(jù)估計，在美國超過50%的血友病群體，超過10，000人通過受感染的血液供給感染了 HIV) ；(4)分離的凝血因子，尤其是重組凝血因子非常昂貴，并且在發(fā)展中國家通常是不可獲得的。在替代療法之外來治療或預防出血是個挑戰(zhàn)，因為血友病的出血是個復雜的病理生理過程，該過程可歸因于三個缺陷(1)在低組織因子濃度上通過外部途徑的減少的凝血酶產(chǎn)生，(2)通過內(nèi)部途徑的減少的凝血酶產(chǎn)生的繼發(fā)性爆發(fā)，和(3)通過內(nèi)部途徑的纖維蛋白溶解系統(tǒng)的存在缺陷的下調(diào)。減少的凝血酶產(chǎn)生導致減少的凝血傾向，從而導致增加的出血風險的事實已被廣泛接受。然而，過去十年的工作顯示，纖維蛋白溶解的下調(diào)缺陷可能也在血友病中起著重要作用。因此，血友病還可被分類為具有纖溶亢進的凝血病。最近的出版物通過體外顯示如下現(xiàn)象來支持該假設當血塊在因子VIII耗盡并且補充有組織型纖溶酶原激活物tPA的血漿(FVII1-DP)中形成時，纖維蛋白溶解不能被充分下調(diào)，結(jié)果血塊過早溶解(Broze和Higuchi, Bloodl996, 88:3815-3823 ；Mosnier ；Thromb. Haemost. 2001, 86:1035-1039)。此外，已顯不，該“過早溶解”歸因于凝血酶-可激活的纖維蛋白溶解抑制劑(TAFI)的減少的激活或不存在所述激活(Βι ζθ和Higuchi, 1996)，并且在FVII1-DP中，包含激活的TAFI的混合物增加了血塊溶解時間。已得出結(jié)論穩(wěn)定化的TAFI可用于治療血友病(W002/099098)。TAFI在纖維蛋白溶解的下調(diào)中起著關(guān)鍵作用，其是形成穩(wěn)定的血塊所必需的。TAFI (也稱為血漿羧肽酶原B2或羧肽酶原U)是當暴露于凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白復合物時，通過在Arg92上的蛋白質(zhì)水解被轉(zhuǎn)化成抑制纖維蛋白溶解的基礎羧肽酶(bas iccarboxypeptidase) (TAFI·a或激活的TAFI)的血衆(zhòng)酶原。其通過從血纖蛋白除去C末端賴氨酸和精氨酸殘基(其對于纖溶酶原的結(jié)合和激活是非常重要的)而有效地減弱纖維蛋白溶解。如上所論述的，與凝血酶復合的血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)負責TAFI激活。血栓調(diào)節(jié)蛋白為用作內(nèi)襯血管的內(nèi)皮細胞上的凝血酶受體的膜蛋白。凝血酶為凝血級聯(lián)中的中心酶，其將血纖蛋白原轉(zhuǎn)化成形成基質(zhì)凝塊的血纖蛋白。首先，局部損傷導致從其無活性前體凝血酶原產(chǎn)生少量凝血酶。接著，凝血酶激活血小板和，接下來，某些凝血因子包括因子V和VIII。后一作用產(chǎn)生所謂的凝血酶爆發(fā)(另外的凝血酶原分子的大量激活)，這最終導致形成穩(wěn)定的血塊。然而，當結(jié)合于血栓調(diào)節(jié)蛋白時，凝血酶的活性被間接改變凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白復合物的主要特征是其激活蛋白C的能力，所述蛋白C隨后通過蛋白質(zhì)水解性滅活重要的輔因子，因子Va和因子VIIIa來下調(diào)凝血級聯(lián)(Esmon等人，Ann. N. Y. Acad. Sc1.(1991)，614:30-43)，從而提供抗凝血活性。凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白復合物也能夠激活凝血酶-可激活的纖維蛋白溶解抑制劑(TAFI)，其隨后拮抗纖維蛋白溶解(參見上文)。成熟人TM包含559個殘基的單個多肽鏈，且由5個具有下列定位的結(jié)構(gòu)域組成氨基末端“凝集素樣”結(jié)構(gòu)域、包括6個表皮生長因子(EGF)樣重復的"6EGF-樣重復結(jié)構(gòu)域〃、O-糖基化結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(氨基酸位置如SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3中所示):
權(quán)利要求
1.一種血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物，其在與凝血酶結(jié)合后，與TMEM338L相比，具有減小的輔因子活性，所述類似物具有 a)根據(jù)SEQID N02的氨基酸序列，或 b)根據(jù)SEQID N03的氨基酸序列，或 c)根據(jù)SEQID N04的氨基酸序列，或 d)與根據(jù)SEQID N02, SEQ ID:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90%，更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少98%的同一性的氨基酸序列，或 e)血栓調(diào)節(jié)蛋白片段，其基本上由下述組成SEQID NO:2, SEQ ID NO:3或SEQ IDN0:4的6個EGF樣重復結(jié)構(gòu)域(如SEQ ID NO:1中編號的氨基酸位置227至462)、SEQ IDNO: 2，SEQ ID NO: 3或SEQID NO: 4的EGF-樣重復結(jié)構(gòu)域3至EGF-樣重復結(jié)構(gòu)域6 (如SEQID NO:1 中編號的氨基酸位置 307 至 462)或 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3 或 SEQID NO:4 的EGF-樣重復結(jié)構(gòu)域3的c環(huán)至EGF-樣重復結(jié)構(gòu)域6 (如SEQID NO:1中編號的氨基酸位置333 至 462)， 其中位置376 (如根據(jù)SEQ ID NO 1中編號的)上的苯丙氨酸被缺失或被甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸置換。
2.權(quán)利要求1的血栓調(diào)節(jié)蛋白，其還在位置387(如SEQ ID NO:1中編號的)上包括谷氨酰胺殘基的缺失或置換，其中所述置換優(yōu)選被Met、Thr、Ala、Glu、His、Arg、Ser, Val、Lys， Gly、lie、Tr、Tyr，Leu、Asn、Phe、Asp、Cys 置換。
3.權(quán)利要求1或2的血栓調(diào)節(jié)蛋白，其還在位置388(如SEQ IDNO中編號的)上包含甲硫氨酸殘基的缺失或置換，其中甲硫氨酸殘基優(yōu)選被Gin、Tyr，lie、Phe、His、Arg、Pro、Val、Thr、Ser，Ala、Trp、Asn、Lys，Gly、Glu、Asp、Cys 置換。
4.上述權(quán)利要求的任一項的血栓調(diào)節(jié)蛋白，其還在位置389(如SEQ ID N0:1中編號的)上包括苯丙氨酸殘基的缺失或置換，其中苯丙氨酸優(yōu)選被Val、Glu、Thr、Ala、His、Trp、Asp、Gin、Leu、lie、Asn、Ser， Arg、Lys， Met，Tyr，Gly、Cys， Pro 置換。
5.權(quán)利要求的任一項的血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白包含如表4中描述的一個或多個第一和第二氨基酸修飾。
6.權(quán)利要求的任一項的血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白包含如表5中描述的一個或多個第一、第二和第三氨基酸修飾。
7.血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物用于制備藥劑的用途，所述藥劑用于治療具有纖溶亢進的凝血病，其中 a)TM類似物如上述權(quán)利要求的任一項所定義，或 b)所述TM類似物的特征在于，在治療有效劑量上顯示抗纖維蛋白溶解作用。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物顯示一個或多個下列特征 (i)與兔肺血栓調(diào)節(jié)蛋白相比，減小的對凝血酶的結(jié)合親和力，和/或kD值超過O.2nM的對凝血酶的結(jié)合親和力；和/或 (ii)與TM類似物TMEM388L的輔因子活性相比，減小的輔因子活性， (iii)與TM類似物TMeM388L相比，增加的TAFI激活活性對輔因子活性的比率。
9.權(quán)利要求7或8的用途，其中所述具有纖溶亢進的凝血病選自如下疾病A型血友病、B型血友病、C型血友病、血管性血友病(vWD)、獲得性血管性血友病、因子X缺乏、副血友病、凝血因子1、I1、V或VII的遺傳性障礙、因循環(huán)抗凝物引起的出血障礙或獲得性凝血缺乏。
10.上述權(quán)利要求的任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物用于治療一個或多個選自下列的出血事件顱內(nèi)出血或其它CNS出血、關(guān)節(jié)、微毛細血管、肌肉、胃腸道、呼吸道、腹膜后空隙或軟組織中的出血。
11.上述權(quán)利要求的任一項的用途，其中所述患者具有抗-因子VIII抗體。
12.上述權(quán)利要求的任一項的用途，其中所述患者用因子VIII，優(yōu)選重組因子VIII或重組的缺失B結(jié)構(gòu)域的因子VIII分子，更優(yōu)選辛凝血素a或莫羅凝血素a來進行治療。
13.上述權(quán)利要求的任一項的血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物用于治療具有纖溶亢進的凝血病的用途，其特征在于將所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物與因子VIII，優(yōu)選重組因子VII1、重組的缺失B結(jié)構(gòu)域的因子VIII分子，更優(yōu)選辛凝血素a或莫羅凝血素a組合施用。
14.上述權(quán)利要求的任一項的用途，其中所述患者用因子VII1、優(yōu)選重組因子VII1、更優(yōu)選辛凝血素a來進行治療。
15.上述權(quán)利要求的任一項的用途，其中在出血發(fā)作時施用所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物。
16.上述權(quán)利要求的任一項的用途，其中在增加的出血風險例如手術(shù)或拔牙之前施用所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物。
17.上述權(quán)利要求的任一項的用途，其中給難以用血液/血漿輸注或凝血因子替代療法治療的患者施用所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物。
18.上述權(quán)利要求的任一項的用途，其中優(yōu)選在短于I周至4周的總時間中，每天一次，每2天一次，或每3、4、5、6或7天一次，更優(yōu)選以長期施用的方式，以多個劑量施用所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物。
19.上述權(quán)利要求的任一項的用途，其中以胃腸外施用的方式，優(yōu)選以靜脈內(nèi)或皮下施用的方式，施用所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物。
20.上述權(quán)利要求的任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物為可溶性TM類似物。
21.權(quán)利要求20的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物為人可溶性TM類似物。
22.上述權(quán)利要求的任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物包括選自EGF3、EGF4、EGF5、EGF6的至少一個結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選包含片段EGF3-EGF6，更優(yōu)選包含EGF結(jié)構(gòu)域1_6。
23.上述權(quán)利要求的任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物由EGF結(jié)構(gòu)域EGFl至EGF6組成，更優(yōu)選由EGF結(jié)構(gòu)域EGF3至EGF6組成。
24.上述權(quán)利要求的任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物具有相應于成熟血栓調(diào)節(jié)蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3中描述的)的氨基酸序列，并且包括下列修飾中的一個或多個 a)氨基酸1-3的去除；b)M388L；c)R456G；d)H457Q； e)S474A，和在P490上的終止。
25.上述權(quán)利要求的任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物具有包含與SEQIDNO: 2具有至少85%或至少90%或95%的序列同一性的序列的氨基酸序列。
26.上述權(quán)利要求的任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物在相應于天然序列(根據(jù)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3)的一個或多個如下位置上具有氨基酸修飾aa) 349Asp;bb) 355Asn; ac)357Glu; ad)358Tyr; ae)359Gln; af)361Gln; ag)363Leu; ah)364Asn;ai)368Iyr;aj) 371Val;ak) 374Glu;al) 376Phe; am) 384His;an) 385Arg; ba)387Gln; bb)389Phe; be) 398Asp; bd)400Asp; be)402Asn; bf)403Thr; bg)408Glu; bh)411Glu; bi)413Tyr; bj) 414Ile; bk) 415Leu; bl) 416Asp; bm) 417Asp; bn) 420Ile; bo) 423Asp; bp) 424Ile; bq) 425Asp; br) 426Glu; ca)428Glu; cb)429Asp; cc)432Phe; cd)434Ser;ce)436Val; cf)438His; eg) 439Asp; ch)440Leu; \ 443nTLci)Ihr;c j) 444Phe;ck) 445Glu;cl) 456Arg;cm) 458Ile ;或cn) 461Asp0
27.上述權(quán)利要求的任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物在根據(jù)SEQID NO:1或SEQ ID NO: 3的位置376上具有苯丙氨酸的修飾，其優(yōu)選被脂族氨基酸置換，更優(yōu)選被甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸置換，最優(yōu)選被丙氨酸置換。
28.上述權(quán)利要求的任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物具有根據(jù)SEQIDNO:1或SEQ ID N0:3的下列氨基酸中的一個或多個氨基酸的修飾 a)387Gln; b)388Met; b)389Phe, 其中所述氨基酸被缺失，被一個或多個額外的氨基酸插入，或優(yōu)選被置換。
29.上述權(quán)利要求的任一項的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物以其氧化形式使用，優(yōu)選被氯胺T、過氧化氫或高碘酸鈉氧化。
30.權(quán)利要求19的用途，其中TM類似物內(nèi)的一個或多個甲硫氨酸殘基被氧化，優(yōu)選位置388 (根據(jù)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3)上的甲硫氨酸殘基被氧化。
31.篩選適用于治療具有纖溶亢進的凝血病的血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物的方法，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白顯示下列特征中的一個或多個 (i)減小的對凝血酶的結(jié)合親和力， ( )減少的輔因子活性， (iii)增強的TAFI激活活性， 所述方法包括步驟 a)產(chǎn)生血栓調(diào)節(jié)蛋白序列(SEQID NO:1或SEQ ID NO: 3)的一個或多個氨基酸置換，優(yōu)選在權(quán)利要求15中所列的氨基酸位置上的一個或多個氨基酸置換； b)針對下列特征中的一個或多個，將修飾的類似物與對照分子，優(yōu)選兔肺TM或可溶性人TM類似物相比較 ba)對凝血酶的結(jié)合親和力(KD值)； bb)輔因子活性; be) TAFI激活活性或TAFIa潛能； bd)TAFI激活活性與輔因子活性的比率； be)蛋白質(zhì)氧化的作用； bf)在體外測定中在時間上對血塊溶解的影響；或bg)在凝血相關(guān)動物模型中的作用。
32.治療具有纖溶亢進的凝血病的方法，其包括施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至20的任一項的血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物。
33.治療具有纖溶亢進的凝血病的方法，其包括施用O.75 μ g/kg至140 μ g/kg待治療的受者的體重的劑量的根據(jù)權(quán)利要求1至20的任一項的血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物。
34.一種藥物組合物，其以O. 75 μ g/kg至140 μ g/kg待治療的受試者的體重的劑量包含用于治療具有纖溶亢進的凝血病的根據(jù)權(quán)利要求1至20的任一項的血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物。
全文摘要
本發(fā)明涉及血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物用于制備用于治療具有纖溶亢進的凝血病例如血友病障礙的藥劑的用途。此類血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物在治療有效劑量上顯示抗纖維蛋白溶解作用。公開了新的蛋白質(zhì)修飾和用于鑒定其的方法。
文檔編號C07K14/745GK103037893SQ201080068202
公開日2013年4月10日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月14日
發(fā)明者K-U·彼得森, M·E·內(nèi)舍姆, J·H·福萊 申請人:帕昂德國有限公司