專利名稱：琥珀酰酪蛋白鐵(iii)及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種琥拍酰酪蛋白鐵(III) (iron(III) caseinsuccinylate),其特征在于鐵含量在4. 5重量％和7重量％之間并且在水中的溶解率為大約92%以上。
本發明進一步涉及一種用于制備琥珀酰酪蛋白鐵(III)的方法。
背景技術：
鐵衍生物在藥品中廣泛使用，用于預防和治療貧血和妊娠期鐵缺乏、吸收不良綜合征、哺乳期鐵缺乏和生長期鐵缺乏。其中，蛋白琥拍酸鐵(Iron Protein Succinilate) (通常指的是首字母縮寫詞IPS)因其生物利用度和耐受性特性而尤為杰出。
意大利專利IT1150213中描述了 起始于牛奶蛋白而獲得的IPS的化學、物理學和生物學性質以及制劑(被稱為Ironlat)。此外，Ironlat的溶解率在pH>5時表示為對于含有6. 7%的鐵的絡合物而言，是部分溶解的；并且對于含有4. 6%的鐵的絡合物而言，是完全溶解的。
Cremonesi 等人在 International Journal of Clinical PharmacologyTherapy and Toxicology 31卷(1993)40-51頁中指出琥拍酰酪蛋白鐵(III)(起始于琥拍酰酪蛋白而獲得的鐵(III)絡合物)的化學和藥理學性質。在體內實驗中，相對于其它鐵衍生物， 該產品(具有等于5%的鐵含量)顯示出更好的胃腸耐受性。
歐洲專利EP939083B1中描述了一種用于生產琥珀酰酪蛋白鐵(III)的方法，該方法提供使用特定的撕碎和干燥程序以克服產品中存在不溶性成分的問題。此外，還描述了作為待用原料的食品級酪蛋白在琥珀酰酪蛋白鐵(III)的生產工藝中的用途。
為了有助于將產品中的微生物污染保持在規定的極限內，在工藝中加入尼泊金甲酯和尼泊金丙酯防腐劑；當分析最終產品時，分別測定以3%和1. 05%的水平存在的尼泊金甲酯和尼泊金丙酯。防腐劑的這種用途同樣在專利EP1776382B1中有所描述，其介紹了在工藝中濕式造粒與產品的噴霧干燥或冷凍干燥結合使用以促進溶解過程。
專利申請EP319664提出了一種基于琥珀酰酪蛋白鐵(III)的酶促降解的方法以克服在該絡合物中觀察到的溶解率和粘度的問題，尤其是當鐵的特定值超過10%時。
國際專利申請W02007/065812描述了琥珀酰酪蛋白鐵(III)的制備，在懸浮液中操作的所述制備不僅進行琥珀酰化反應，而且隨后進行使用鐵(III)離子的絡合反應，然而并未解決關于琥珀酰酪蛋白鐵(III)溶解困難的問題。事實上，該專利申請沒有提供關于所獲得的絡合物的溶解的信息，并且沒有測定可能獲得的溶液的粘度。
當特定鐵含量超過5%的極限時，這種溶解問題尤為明顯。
由于水溶液中產品濃度增加而觀察到的粘度增加的現象使得超過預定濃度時使用琥珀酰酪蛋白鐵(III)變得困難，或者甚至阻礙了超過預定濃度時使用琥珀酰酪蛋白鐵 (III)。
除非使用超過15ml溶液的制劑，否則這些作用的結合會將產品的劑量限制到不超過800mg的值,相當于每劑大約40mg的鐵(III)。
此外，琥珀酰酪蛋白鐵(III)的水溶液的粘度使得通過過濾和微細過濾來降低產品中微生物含量的操作復雜化，并且要求使用大量的防腐劑。
因此，顯而易見的是，現有技術沒有提供用于克服琥珀酰酪蛋白鐵(III)(一種高效治療各種形式的鐵缺乏的藥物)溶解問題的簡單方案。發明內容
目前，人們已經發現如果將食用酪蛋白(所述食用酪蛋白已經經受旨在除去蛋白質雜質、無機雜質和/或提高磷/氮比例(P/N比例)的純化工藝)用作原料，那么在琥珀酰酪蛋白鐵(III)的生產中可以獲得令人吃驚的優勢。事實上，因此有可能獲得琥珀酰酪蛋白鐵(III)，其特征不僅在于含有更少雜質的蛋白質性質，而且意想不到地在于改善的水中溶解率。這種改善的溶解率使其有可能獲得水溶液和/或懸浮液，所述水溶液和/或懸浮液顯示出比起始于商購的食品級酪蛋白而獲得的粘度更低的粘度。
關于酪蛋白，根據本發明的表述“蛋白質雜質”用于表示與各種變體酪蛋白不同的蛋白質，所述蛋白質雜質借助于采用考馬斯亮藍(Coomassie Blue)染色和密度計分析的一維電泳來測定。優選地，本發明的所述蛋白質雜質是與α-SI酪蛋白、a-S2酪蛋白、β酪蛋白、K酪蛋白和/或假K酪蛋白不同的蛋白質。
類似地，關于琥珀酰酪蛋白鐵(III)，根據本發明的表述“蛋白質雜質”用于表示與各種變體琥珀酰酪蛋白不同的物質，所述蛋白質雜質借助于采用考馬斯亮藍染色和密度計分析的一維電泳來測定。優選地，本發明的所述蛋白質雜質是與α-Sl酪蛋白、a-S2酪蛋白、β酪蛋白、K酪蛋白和/或假K酪蛋白(pseudo-kappa casein)的琥拍酰產品不同的琥拍酰蛋白質。
根據本發明的表述“無機雜質”用于表示硫酸灰分。
術語“P/N比例”用于表示樣品中存在的以重量計的磷的量(借助于ICP技術來測定)和以重量計的氮的量(通過元素分析來測定)之間的比例。
根據本發明，以重量百分比表示的值(重量％)應當旨在相對于琥珀酰酪蛋白鐵 (III)的總重量或酪蛋白的總重量。
因此，本發明的目的是琥珀酰酪蛋白鐵(III)，其特征在于鐵含量在4.5重量％和 7重量％之間并且在水中的溶解率為大約92重量％以上。優選地，這種在水中的溶解率被視為在大約11. 5份水中的溶解率。
所述琥珀酰酪蛋白鐵(III)進一步含有蛋白質雜質，所述蛋白質雜質的量為大約 15%以下，優選大約10%以下和/或P/N比例為大約5%以上，優選大約5. 5%以上。
本發明的另一個目的是一種用于制備琥珀酰酪蛋白鐵(III)的方法，其包含以下步驟
a)將酪蛋白和琥珀酸酐在水里反應以獲得琥珀酰酪蛋白，
b)將琥珀酰酪蛋白與三氯化鐵(III)反應以獲得琥珀酰酪蛋白鐵(III)，
其特征在于根據步驟a)的所述酪蛋白是純化的酪蛋白，其具有低的蛋白質雜質和 /或無機雜質含量和/或高的P/N比例。
優選地,所述蛋白質雜質的含量為15重量％以下,所述無機雜質的含量為1重量％ 以下，并且以重量計的磷含量與以重量計的氮含量之間的比例為大約5重量％以上。
更優選地，所述蛋白質雜質的含量為大約10重量％以下和/或所述無機雜質的含量為大約O. 4重量％以下和/或磷重量含量與氮重量含量之間的比例為大約5. 5%以上。
本發明所述蛋白質雜質是與α -SI酪蛋白、a -S2酪蛋白、β酪蛋白、K酪蛋白和 /或假K酪蛋白不同的蛋白質。
通常根據其制備中應用的沉淀技術來鑒定食用酪蛋白借助于酸化來進行酸凝酪蛋白(acid casein)沉淀,使用凝乳酶(rennet)獲得的酪蛋白是酶凝的(presamic),通常也被稱為凝乳酶凝酪蛋白(rennetcasein)。
根據本發明，作為原料使用的食用酪蛋白可以是酸凝酪蛋白或酶凝酪蛋白 (presamic casein)。
不管類型(酸凝或酶凝)，這些商購產品通常沒有分析文件；典型的指示參數是水含量、蛋白質含量(通過將倍增因數應用于總氮值來測定)、微生物污染水平和粒度測量。這種特性描述水平完全適合在食品工業中使用酪蛋白，但是我們目前已經發現琥珀酰酪蛋白鐵(III)的制備需要對該原料進行深入的分析評價。
根據本發明用于制備琥珀酰酪蛋白鐵(III)的、作為原料使用的商購食用酪蛋白和純化的酪蛋白借助于反相HPLC,根據Bonizzi等人Journal of Chromatography A 1261 卷(2009) 165-168頁(并入本文用于參考)指示的方法進行分析。
因此，有可能鑒定三種類型的酪蛋白α -S1、a -S2、β、κ和假κ。
通過一維和二維電泳分析，使用考馬斯亮藍作為指示劑，伴隨著各種類型的酪蛋白及其衍生自其轉錄后修飾(如糖基化和磷酸化)的各種變體的分離，還有可能評價蛋白質雜質的存在。
特別地，使用含有14%聚丙烯酰胺凝膠的SDS-PAGE電泳(采用考馬斯亮藍染色和基于以不同量的BSA構建的定標線的密度分析)來定量測定蛋白質雜質。
根據歐洲藥典(FarmacopeaEuropea, method Eu. Pharm. 2. 4. 14),使用硫酸灰分方法也可以分析所述酪蛋白和純化的酪蛋白。然后通過ICP技術來測定其磷(P)含量，并且通過元素分析來測定氮(N)含量，因此將關于磷所觀測的重量除以關于氮所觀測的重量并且將結果乘以100來計算P/N%比例。下表I顯示針對各種類型的酪蛋白，即商購食用酪蛋白(酸凝和酶凝)和根據本發明方法的純化的酪蛋白獲得的結果。
表I
酪蛋白原料蛋白質雜質硫酸灰分P/N%酸凝酪蛋白實施例化合物I和215%1. 6%酶凝酪蛋白實施例化合物320%9. 2%實施例4實施例8A和9A5%0. 4%5. 5%實施例5實施例8B9%0. 9%5. 1%實施例6實施例8C8%0. 2%5. 6%
權利要求
1.一種琥珀酰酪蛋白鐵(III)，其特征在于鐵含量在4.5重量％和7重量％之間并且溶解率為大約92%以上。
2.根據權利要求1所述的琥珀酰酪蛋白鐵(III)，其特征在于其含有的蛋白質雜質的量為大約15重量％以下,優選大約10重量％以下。
3.根據權利要求1所述的琥珀酰酪蛋白鐵(III)，其特征在于其具有的磷/氮比例為大約5重量％以上，優選大約5. 5重量％以上。
4.一種用于制備琥珀酰酪蛋白鐵(III)的方法，其包含以下步驟a)將酪蛋白和琥珀酸酐在水里反應以獲得琥珀酰酪蛋白，b)將琥珀酰酪蛋白與三氯化鐵(III)反應以獲得琥珀酰酪蛋白鐵(III)，其特征在于根據步驟a)的所述酪蛋白是純化的酪蛋白，其具有的蛋白質雜質含量為 15重量％以下和/或無機雜質含量為I重量％以下和/或磷/氮比例為大約5%以上。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述蛋白質雜質含量為大約10重量％以下和/或所述無機雜質含量為大約O. 4重量％以下。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述蛋白質雜質是與α-Sl酪蛋白、a-S2 酪蛋白、β酪蛋白、K酪蛋白、假K酪蛋白不同的蛋白質。
7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述純化的酪蛋白具有的磷/氮比例為大約5重量％以上。
8.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述純化的酪蛋白是從酸凝酪蛋白或酶凝釀蛋白獲得的。
9.根據權利要求4所述的方法，其包含琥珀酰酪蛋白鐵(III)水溶液的微細過濾的額外步驟。
10.一種琥珀酰酪蛋白鐵，其能夠通過根據權利要求4-9中任一項所述的方法獲得。
11.一種藥物組合物，其含有根據權利要求1至3和/或10所述的琥珀酰酪蛋白鐵 (III)和至少一種生理學上可接受的賦形劑。
12.根據權利要求11所述的組合物，其特征在于其是液體或固體形式，優選液體形式。
13.根據權利要求12所述的組合物，其特征在于所述液體形式為溶液或懸浮液，優選水溶液。
14.根據權利要求11所述的組合物，其特征在于所述組合物是含有大約8重量％的琥珀酰酪蛋白鐵(III)的溶液，所述溶液具有的粘度為大約400mPa·秒以下，優選大約 300mPa ·秒以下。
15.根據前述權利要求中任一項所述的組合物，其中相對于所述組合物的總重量，其中含有的琥珀酰酪蛋白鐵(III)的量在5重量％和15重量％之間，優選6重量％和12重量％ 之間，更優選7重量％和9重量％之間。
16.根據前述權利要求中任一項所述的組合物，其用于口服或腸胃外使用，優選用于口服使用。
17.根據前述權利要求中任一項所述的組合物，其用于治療鐵缺乏。
18.根據權利要求17所述的組合物，其用于治療貧血、妊娠期鐵缺乏、吸收不良綜合征、哺乳期鐵缺乏和生長期鐵缺乏。
全文摘要
本發明涉及一種琥珀酰酪蛋白鐵(III)，其特征在于鐵含量在4.5重量%和7重量%之間，并且在水中的溶解率大約為92%以上。本發明進一步涉及一種用于制備琥珀酰酪蛋白鐵(III)的方法。
文檔編號C07K14/47GK103025751SQ201080067086
公開日2013年4月3日 申請日期2010年6月30日 優先權日2010年6月30日
發明者A·斯蒂夫納奇, L·德菲拉, B·平托 申請人:意大發馬克股份公司