具有降低的免疫原性的bmp-7變體的制作方法

專利名稱：具有降低的免疫原性的bmp-7變體的制作方法
技術領域：
本發明涉及已經被修飾以降低免疫原性的骨形態發生蛋白-7(BMP_7)和修飾BMP-7以降低免疫原性的方法。
背景技術：
BMP-7，也稱為成骨蛋白-I (0P-1)，是能夠誘導骨生長的蛋白質，其可用于治療各種軟骨和骨的疾病和缺陷。例如，重組人BMP-7在全球已被用于治療超過40，000位的患者。然而，臨床結果已經顯示重組人BMP-7在ー些臨床適應癥中是高度免疫原性的。換言 之,該重組蛋白可刺激患者的免疫應答,這引起患者產生抗BMP-7的抗體。這些抗體也可抑制由患者內源性產生BMP-7的功能，導致對患者健康潛在的長期后果。因此，本領域中需要BMP-7——包括重組BMP-7，其具有降低的免疫原性，以便提高其有效性并降低對患者的副作用，同時保持其生物活性和臨床相關的骨形態發生性質。

發明內容
本申請涉及BMP-7，例如人重組BMP-7，其與野生型人BMP-7相比已經被修飾以降低其免疫原性。更具體地，根據本發明的BMP-7蛋白被修飾，以去除潛在的免疫原性表位。因此，與野生型BMP-7相比，本發明的BMP-7蛋白具有改進的生物學性質。根據ー個方面，本發明包括與成熟人BMP-7具有至少90%序列同一性的變體BMP-7蛋白。該變體BMP-7包含在與成熟人BMP-7相應的以下位置中的ー個或多個、兩個或多個、三個或多個、四個或多個、五個或多個、六個或多個、七個或多個或八個或多個處的取代G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102 或A105。在進ー步的實施方式中，該變體蛋白與成熟人BMP-7具有至少95%的同一性。在進ー步的實施方式中，取代為以下的ー個或多個G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70G/D、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A或A105V。在進ー步的實施方式中，該變體顯示了BMP-7活性。在另ー個方面中，本發明涉及編碼本發明變體BMP-7蛋白的核酸。例如，該核酸為DNA 或 RNA。在另ー個方面中，本發明涉及包含編碼本發明變體BMP-7蛋白的核酸的重組表達載體。還在另ー個方面中，本發明涉及包含表達載體的細胞，所述表達載體包含編碼本發明變體BMP-7蛋白的核酸。該細胞在一個實施方式中可為原核的，或在另ー個實施方式中可為真核的。在進ー步的方面中，本發明涉及包括本發明變體BMP-7蛋白和藥物載體的藥物組合物。根據進一歩的方面，本發明涉及治療患者骨骼病的方法。該方法要求向患者施用治療有效量的本發明變體BMP-7蛋白。根據又進一歩的方面，本發明涉及降低人BMP-7蛋白的免疫原性的方法。該方法要求識別人BMP-7上的免疫原性表位和通過在BMP-7的氨基酸序列中改造一個或多個取代以產生修飾的氨基酸序列來修飾人BMP-7的氨基酸序列中的表位。所述ー個或多個取代在與成熟人BMP-7相應的以下位置中的一個或多個處發生G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、I94、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102 或 A105。在一個實施方式中，人 BMP-7是重組的。在進ー步的實施方式中，所述ー個或多個取代為以下中的任ー個或多個G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70G/D、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。在進ー步的實施方式 中，該方法可包括在合適的表達系統中表達由修飾的氨基酸序列編碼的蛋白質和純化該蛋白質的步驟。在一個實施方式中，該蛋白質可在真核細胞中表達，或在另ー個實施方式中，該蛋白質可在原核細胞中表達。


圖I顯示了包括人BMP-7成熟區域的整個序列的十八種肽，每種肽十五個氨基酸長，并且重疊5或10個氨基酸。圖2是十八種肽的示意圖，其顯示與人BMP-7整個成熟區域相關的這些肽之間的重疊。圖3為條形圖，其顯示在圖I示出的十八種肽的ELISA中結合至來自患者血清樣本的非中和抗BMP-7抗體的結果。(條形從左到右為111266-、111694+、111945+、111665+和 1B12/12G3+)。圖4為條形圖，其顯示在圖I示出的十八種肽的ELISA中結合至來自患者血清樣本的中和抗BMP-7抗體的結果。(條形從左到右為113791-、113113+、113331+、113756+、112956+、113757+、113766+、111694+ 和 1B12/12G3+)。圖5A是與肽9 (如圖I所示)相應的BMP-7部分與BMP_2、4、5、6和9中的相應區域的比對。圖5B是與肽13(如圖I所示)相應的BMP-7部分與BMP_2、4、5、6和9中的相應區域的比對。圖6為成熟人BMP-7 (SEQ ID NO: I)的序列。發明詳述已經顯示重組人BMP-7在ー些臨床適應癥中是高度免疫原性的。例如，當BMP-7作為OP-It6Putty 或OP-l Implant (Stryker Biotech Hopkinton, MA)的一部分被植入患者時，引起ー些患者通過產生對重組人BMP-7的抗體顯示免疫應答。這降低了 BMP-7治療的有效性并可導致副作用。因此，本發明涉及變體BMP-7蛋白，其與野生型BMP-7相比具有降低的免疫原性。本發明也包括制造和使用具有降低的免疫原性的BMP-7變體的方法。根據本發明，通過修飾包含潛在免疫原性表位的BMP-7部分的氨基酸殘基降低免疫原性。因此，根據本發明修飾的BMP-7蛋白保持了它們的生物學活性，但與它們的野生型BMP-7對應物相比大大減少了免疫原性。例如，根據本發明，BMP-7的免疫原性性質被消除或大大降低。因此，預期當被施用給患者例如人患者時，這樣的變體BMP-7蛋白將具有更少的免疫原性。骨形態發生蛋白骨形態發生蛋白(BMP)屬于TGF-P超家族。TGF-0超家族蛋白是以六個保守的半胱氨酸殘基為特征的細胞因子。該人基因組包含大約42個編碼TGF-P超家族蛋白的開放閱讀框。TGF-P超家族蛋白可基于序列相似性和它們激活的特定信號傳導通路至少被分成BMP亞家族和TGF-P亞家族。BMP亞家族包括但不限于BMP-2、BMP-3(骨生成蛋白)、BMP-3b (⑶ F-10)、BMP-4 (BMP_2b)、BMP-5、BMP-6、BMP-7 (成骨蛋白-1 或 0P-1)、BMP-8 (0P-2)、BMP-8B (0P-3)、BMP-9 (⑶F-2)、BMP-10, BMP-11 (GDF-Il)、BMP-12 (⑶F-7)、BMP-13 (⑶F-6、CDMP-2)、BMP-15 (⑶F-9)、BMP-16、⑶F-1、⑶F-3、⑶F_5 (CDMP-1、MP-52)和 ⑶F-8(肌骨素(myostatin))。此外，在人群的不同成員之間的BMP序列中具有等位基因變異，并且在至今發現和表征的BMP之間具有物種差異。如在此所用的，“BMP亞家族”、“BMP”、“BMP配體”和其語法上的等同物指BMP亞家族成員，除非另有具體說明。公開這些序列以及它們的化學和物理性質的出版物包括BMP_7和0P_2(美國專利號 5,011,691;美國專利號 5，266，683 ;0zkaynak 等，EMBOJ.，9，pp.2085-2093(1990) ;0P_3 (W094/10203 (PCT US93/10520))、BMP-2、BMP-4、(W088/00205 ；ffozney 等 Science,242,pp. 1528-1534(1988))、BMP-5 和 BMP-6(Celeste等，PNAS, 87，9843-9847(1990))、Vgr-I (Lyons 等，PNAS, 86，pp. 4554-4558 (1989))；DPP (Padgett 等 Nature, 325, pp. 81-84(1987)) ；Vg-l (Weeks, Cell, 51, pp. 861-867(1987)) ；BMP-9(W095/33830(PCT/US95/07084) ；BMP-10(W094/26893(PCT/US94/05290)；BMP-11 (W094/26892 (PCT/US94/05288) ；BMP-12 (W095/16035 (PCT/US94/14030)；BMP-13 (W095/16035 (PCT/US94/14030) ;GDF_1(W092/00382 (PCT/US91/04096)和Lee 等 PNAS,88，pp. 4250-4254 (1991) ；GDF-8(W094/21681 (PCT/US94/03019)；GDF-9 (W094/15966 (PCT/US94/00685) ;GDF_10 (W095/10539 (PCT/US94/11440)；GDF-Il (W096/01845 (PCT/US95/08543) ;BMP_15 (W096/36710 (PCT/US96/06540)；MP-121 (W096/01316 (PCT/EP95/02552) ；GDF-5 (CDMP-1, MP52) (W094/15949 (PCT/US94/00657)和 W096/14335(PCT/US94/12814)和 W093/16099 (PCT/EP93/00350))；⑶F-6(CDMP-2, BMPI3)(W095/01801(PCT/US94/07762)和 W096/14335 和 W095/10635(PCT/US94/14030)) ；GDF-7 (CDMP-3, BMP 12) (W095/10802 (PCT/US94/07799)和W095/10635 (PCT/US94/14030)) 以上出版物在此通過引用并入。如在此所用的，“TGF-P超家族成員”或“TGF-P超家族蛋白質”，指本領域技術人員稱為轉化生長因子-P (TGF-P)超家族成員的蛋白質。在結構上，這樣的蛋白質為同ニ聚體或異ニ聚體，其表達為大的前體多肽鏈，所述大的前體多肽鏈包含疏水信號序列、數百個氨基酸的N-末端前區(pro region)和成熟結構域，所述成熟結構域包括可變N-末端區域和包含大約100個氨基酸的高度保守的C-末端區域，所述100個氨基酸含有具有保守的六個或七個半胱氨酸骨架的特征性半胱氨酸基序。這些結構上相關的蛋白質已經被鑒定為涉及多種發育事件。術語“形態發生蛋白”指屬于具有真實形態發生活性的蛋白質的TGF-P超家族的蛋白質。例如，這種蛋白質能夠誘導祖細胞増殖和/或啟動分化途徑中的級聯事件，其根據局部環境信號導致形成軟骨、骨、腱、韌帶、神經或其他類型的分化組織。因此，根據本發明可用的形態發生蛋白在不同的周圍環境中可表現不同。在某些實施方式中，本發明的形態發生蛋白可為同ニ聚體種類或異ニ聚體種類。術語“成骨蛋白(OP) ”指也能夠誘導祖細胞形成軟骨和/或骨的形態發生蛋白。該骨可為膜內骨或軟骨內骨。大多數成骨蛋白是BMP亞家族的成員并因此也是BMP。然而，反過來說是不對的。根據本發明，由DNA序列同源性或氨基酸序列同一性識別的BMP也必須具有功能性生物測定中可論證的成骨活性或軟骨形成活性，成為成骨蛋白。合適的生物測定在本領域中是公知的；特別有用的生物測定為異位骨形成測定(見例如美國專利號5，011，691 ;美國專利號 5，266，683)。在結構上，BMP為ニ聚半胱氨酸結蛋白。每個BMP單體包括多個分子內ニ硫鏈。 額外的分子間ニ硫鏈調節了大多數BMP中的ニ聚作用。BMP可形成同ニ聚體。ー些BMP可形成異ニ聚體。BMP被表達為包括長的前域、一個或多個切割位點和成熟結構域的前蛋白。該前域被認為幫助正確折疊和加工BMP。此外，在ー些但不是所有的BMP中，該前域可非共價結合成熟結構域并可起到抑制劑的作用(例如，Thies等，(2001)Growth Factors18:251-259)。BMP自然地表達為包括長的前域、一個或多個切割位點和成熟結構域的前蛋白。該前蛋白隨后通過細胞機器加工以產生ニ聚的成熟BMP分子。該前域被認為幫助正確折疊和加工BMP。此外，在ー些但不是所有的BMP中，該前域可非共價結合成熟結構域并可起到蛋白伴侶以及抑制劑的作用(例如，Thies等，(2001)Growth Factors, 18:251-259)。當BMP ニ聚體結合兩個I類型和兩個II類型的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體時，BMP信號轉導被啟動。I類型受體包括但不限于ALK-1、ALK-2(也稱為ActRla或ActRI)、ALK-3 (也稱為BMPRIa)和ALK-6 (也稱為BMPRIb)。II類型受體包括但不限于ActRIIa (也稱為ActRII)、ActRIIb和BMPRII。人基因組包含受體絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的12個成員，包括7個I類型和5個II類型受體，其全部參與TGF-P信號傳導(Manning等，2002，Science, 298:1912-1934)，其公開在此通過引用并入)。BMP結合后，II類型受體使類型I受體磷酸化，I類型受體使轉錄因子的Smad家族成員磷酸化，并且Smad家族成員易位至細胞核并激活許多基因的表達。BMP也與抑制劑、可溶受體和誘殺型受體相互作用，其包括但不限于BAMBI (BMP和激活蛋白膜結合抑制劑)、BMPER(BMP-結合內皮細胞前體源調節子)、Cerberus、cordin、類chordin、Dan、Dante、促濾泡素抑制素、促濾泡素抑制素相關蛋白(FSRP)、ectodin、gremlin、頭蛋白、與Dan和cerberus相關的蛋白(PRDC)、硬化蛋白(sclerostin)、類硬化蛋白(sclerostin-like)和子宮致敏相關基因-1 (USAG-I)。此外，BMP可與共同受體相互作用，例如BMP-2和BMP-4結合共同受體DRAGON (Samad等(2005) J. Biol.Chem. ,280:14122-14129);和細胞外基質成分，諸如硫酸肝素和肝素(Irie等(2003)Biochem. Biophys. Res. Commun. 308:858-865)。如在此考慮的，術語“BMP”指屬于在DNA同源性和氨基酸序列同一性的基礎上定義的蛋白質的TGF-P超家族的BMP亞家族的蛋白質。根據本發明，當蛋白質具有與表征BMP亞家族的保守C-末端半胱氨酸-富含結構域內的已知BMP亞家族成員至少50%氨基酸序列同一性時，該蛋白質屬于BMP亞家族。BMP亞家族的成員可總的來說具有小于50%的DNA或氨基酸序列同一性。如在此所用的，術語“BMP”進ー步指如此蛋白該蛋白是天然產生的骨形態發生蛋白以及由兩個不同的単體BMP肽形成的異ニ聚體蛋白諸如BMP-2/7、BMP-4/7、BMP-2/6、BMP-2/5、BMP-4/7、BMP-4/5 和 BMP-4/6 異ニ聚體的氨基酸序列變體、結構域交換變體、平截和活性片段。合適的BMP變體和異ニ聚體包括在US 2006/0235204 ；WO07/087053 ;WO 05/097825 ;WO 00/020607 ；WO 00/020591 ；WO 00/020449 ;WO 05/113585 ；W095/016034 和 W093/009229 中提出的那些。根據ー個實施方式，根據本發明的方法產生的BMP變體諸如BMP-7變體與相應的野生型BMP蛋白序列保持至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性。
根據ー個實施方式，根據本發明方法產生的BMP變體諸如BMP-7變體與相應的野生型BMP蛋白序列的C-末端區域的保守半胱氨酸結構域保持至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性。對于“相應的野生型蛋白”，其指修飾的或變體BMP的野生型版本。例如，如果修飾的或變體BMP為修飾的或變體BMP-7，則相應的野生型BMP為野生型BMP-7。為了確定兩個氨基酸序列或兩個核酸的同一性百分比，出于最優化比較的目的，比對該序列(例如，缺ロ可被引入第一氨基酸序列或核酸序列，用干與第二氨基酸或核酸序列進行最優化比對)。兩個序列之間的同一性百分比是序列共享的相同位置數量的函數(即，%同源性(homology) =相同位置的數量/位置的總數量X 100)。兩個序列之間同源性百分比的測定可利用數學算法完成。用于比較兩個序列的優選的、非限制性數學算法的實例為 Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68 的算法，如在Karlin and Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77 中改進的。這樣的算法被并入 Altschul,等(1990) j. Mol. Biol. 215:403-10 的 NBLAST 和 XBLAST 程序。BLAST 核苷酸搜索可用NBLAST程序實施,得分(score) =100,字長(wordlength) =12。BLAST蛋白搜索可用XBLAST程序實施，得分=50，字長=3。為了獲得用于比較目的的有缺ロ的(gapped)比對，Gapped BLAST可如Altschul 等，(1997)Nucleic Acids Research 25(17) :3389-3402中描述的進行使用。當利用BLAST和Gapped BLAST程序時，可使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省參數。變體MIP-7本發明提供了降低BMP-7免疫原性的方法。為了降低或消除免疫原性，產生不同于野生型BMP-7的變體BMP-7蛋白。根據本發明的一個實施方式，因為BMP-7免疫原性表位中的一個或多個氨基酸被修飾，所以這些變體不同于野生型BMP-7。根據本發明的一個實施方式，BMP-7潛在的免疫原性表位如在本文中描述的和/或根據在本領域中已知的其他方法進行識別，并且表位被修飾以降低或消除表位的免疫原性作用。氨基酸修飾，諸如取代、缺失或插入，隨后在表位(epitopic)區域中根據標準遺傳工程操作進行，以降低或消除表位的免疫原性作用。根據本發明的一個實施方式，本發明的BMP-7變體保持了它們的生物活性，同時與野生型BMP-7相比，它們已經降低或大大降低或消除了免疫原性。根據本發明的一個實施方式，識別為包含表位的BMP-7的區域被來自另ー個BMP的相應區域的氨基酸序列置換，以便去除該表位。例如，在一個實施方式中，來自殘基61-75的成熟人BMP-7的序列被來自以下的相應氨基酸序列置換BMP-2(GYHAFYCHGECPFPL(SEQID NO:20)-圖 5A 的殘基 319-333)、BMP-4(GYQAFYCHGDCPFPL(SEQ ID N0:21) —圖 5A 的殘基 33卜345)、BMP-5 (GYAAFYCDGECSFPL (SEQ ID NO: 22) —圖 5A 的殘基 376-390)、BMP-6(GYAANYCDGECSFPL (SEQ ID NO: 23) — 圖 5A 的 殘基 435-449)或 BMP-9(EYEAYECKGGCFFPL(SEQ ID NO:24)— 圖 5A 的殘基350-364)。在另ー個實施方式中，來自殘基91-105的成熟人BMP-7的序列被來自以下的相應氨基酸序列置換BMP-2(VNSVNSKIPKACCV(SEQ IDNO: 25) — 圖 5B 的殘基 349-362)、BMP-4(VNSVNSSIPKACCV (SEQ ID NO: 26) —圖 5B 的殘基 361-374)、BMP-5(VHLMFPDHVPKPCCA (SEQ ID NO :27)-圖 5B 的殘基 406-420)、BMP-6 (VHLMNPEYVPKPCCA (SEQ ID NO: 28) — 圖 5B 的殘基 465-479)或BMP-9 (VHLKFPTKVGKACCV (SEQ ID NO: 29)—圖 5B 的殘基 380-394)。在本發明的另ー個實施方式中，識別為處于包含表位的BMP-7區域中的BMP-7的一個或多個氨基酸，通過例如用與另ー個BMP中的該殘基相應的氨基酸取代進行修飾，以便去除表位。例如，如圖5A和5B所示，顯示了兩個推定表位區域(肽9和13)與來自其他BMP蛋白的相應區域的比對，其建議對BMP-7可能的氨基酸修飾。在本發明的另ー個實施方式中，一個或多個點突變被引入人BMP-7，以去除表位。例如，在一個實施方式中，BMP-7 在殘基 G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102或A105中的ー個或多個處具有取代。在另ー個實施方式中，BMP-7在殘基 G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102或A105中的兩個或多個處具有取代。在另ー個實施方式中，BMP-7在殘基 G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102或A105中的三個或多個處具有取代。在另ー個實施方式中，BMP-7在殘基 G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102或A105中的四個或多個處具有取代。在另ー個實施方式中，BMP-7在殘基 G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102或A105中的五個或多個處具有取代。在另ー個實施方式中，BMP-7在殘基 G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102或A105中的六個或多個處具有取代。在另ー個實施方式中，BMP-7在殘基 G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102或A105中的七個或多個處具有取代。在另ー個實施方式中，BMP-7在殘基 G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102或A105中的八個或多個處具有取代。在另ー個實施方式中，BMP-7 在殘基 G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102或A105中的九個或多個處具有取代。在另ー個實施方式中，BMP-7在殘基 G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102或A105中的十個或多個處具有取代。在進ー步的實施方式中，BMP-7具有以下取代中的ー個或多個G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70D/G、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。在進ー步的實施方式中，BMP-7具有以下取代中的兩個或多個G 61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70D/G、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V,N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。在進ー步的實施方式中，BMP-7具有以下取代中的三個或多個G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70D/G、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。在進ー步的實施方式中，BMP-7具有以下取代中的四個或多個G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70D/G、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。在進ー步的實施方式中，BMP-7具有以下取代中的五個或多個G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70D/G、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。在進ー步的實施方式中，BMP-7具有以下取代中的六個或多個G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70D/G、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。在進ー步的實施方式中，BMP-7具有以下取代中的七個或多個G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70D/G、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。在進ー步的實施方式中，BMP-7具有以下取代中的八個或多個G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70D/G、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。在進ー步的實施方式中，BMP-7具有以下取代中的九個或多個G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70D/G、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。在進ー步的實施方式中，BMP-7具有以下取代中的十個或多個G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70D/G、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。根據本發明的另ー個方面，根據本發明的BMP-7變體保持了 BMP-7的生物學活性。如在此所用的，術語“生物學活性”指任何體內或體外的BMP的可測量的功能。可測量BMP的生物學活性的ー些方法被列在以下的“實施例”部分中。在一個實施方式中，與野生型BMP-7相比，本發明的BMP-7變體具有至少30%、至少40%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%的生物學活性。例如，在一個實施方式中，與人野生型BMP-7或重組人野生型BMP-7相比，本發明的BMP-7變體具有前述的生物學活性％中的至少ー個。BMP-7奪體的治療用涂根據本發明的BMP-7變體可被植入或施用給哺乳動物患者，例如人，以治療各種病癥。本發明的BMP-7變體可単獨或與合適的載體或其他制劑結合，以固體、凝膠或糊狀物形式植入患者，或以凝膠，糊狀物或液體形式注入患者。本發明的BMP-7變體對于治療各種病癥是有用的。例如，本發明的BMP-7變體可用于治療骨骼病，包括不管是由創傷還是炎性疾病引起的軟骨退變(cartilage degeneration)。例如,本發明的BMP-7變體可治療的疾病包括類風濕性關節炎(RA)和骨關節炎(OA)和自身免疫疾病諸如系統性紅斑狼瘡(SLE)和硬皮病。本發明的BMP-7變體可有效用于治療骨骼疾病或損傷。例如，BMP-7變體可用于治療骨折，諸如開放性骨折或閉合性骨折。對于治療閉合性骨折，BMP-7變體優選在骨折位置上被注入。對于開放性骨折，臨界尺寸缺陷或持續不結合，BMP-7變體可通過在骨折位置上手術植入而被施用。在兩種情況下，BMP-7變體可被単獨施用，或與合適的載體、基質(基 體，matrix)或支架，諸如骨粘骨粉、磷酸鈣材料、凝膠材料或膠原蛋白基質結合施用。合適的載體、基質和支架包括在美國專利號6，919，308,6, 949，251和7，041, 641中公開的那些。在優選的實施方式中，本發明的BMP-7變體可用于治療導致軟骨退化(cartilagedegradation)或軟骨缺陷的疾病或損傷。例如，本發明的BMP-7變體可被應用于軟骨缺陷位置，諸如退變的椎間盤，或其他纖維軟骨組織，包括腱、韌帶或關節盤。這種方法在美國專利號6，958，149中說明。本發明的BMP-7變體可也用于治療關節軟骨的缺陷或退變，如在公布的PCT申請WO 05/115438中所提出的，諸如關節的軟骨襯墊(cartilage lining ofa joint)，諸如滑膜關節，包括膝蓋、肘部、臀部或肩膀。在該實施方式中，BMP-7變體優選被注入關節的滑液空間(synovial space)。在另ー個實施方式中，本發明的BMP-7變體用于治療關節中的關節軟骨缺陷位置，諸如軟骨缺陷或骨軟骨缺陷。這樣的關節軟骨缺陷可為疾病過程諸如骨關節炎或類風濕性關節炎的結果，或者由于關節損傷。在該實施方式中，BMP-7變體可被注入關節空間或其可通過外科手術植入。例如，BMP-7變體可被單獨或與一種或多種附加的活性劑、支撐基質或支架或髓基質細胞結合放置在缺陷內。BMP-7變體——被放置在缺陷內的——可任選地被覆蓋有合適的覆蓋物，例如肌瓣或生物可再吸收膜，諸如膠原蛋白膜。如本領域技術人員將理解的，被施用給患者的BMP-7變體的濃度將根據多種因素而變化，包括但不限于被施用的藥物劑量和給藥途徑。待被施用藥物的優選劑量也類似地根據如此變量，其包括但不限于，疾病、組織損失或缺陷的類型和程度，具體患者的總體健康情況，所選擇化合物的相對生物學效力，化合物的制劑，制劑中賦形劑的存在和類型，和給藥途徑。本申請的BMP-7變體可被提供給個人，其中典型的劑量范圍為每天大約10ng/kg至大約lg/kg體重；優選的劑量范圍為大約0. lmg/kg至100mg/kg體重,和更特別優選的劑量范圍為IO-IOOOii g/劑。在特別優選的實施方式中，IO-IOOOii gBMP-7的劑被施用給遭受骨關節炎的個體。另外，如下所述，本申請的BMP-7變體可用于治療非骨骼組織的疾病或損傷。如本申請進ー步考慮的，BMP能夠對不同于骨或骨骼軟骨的哺乳動物中的多種組織，誘導骨形態發生和組織形態發生的發育級聯(developmental cascade)。該形態發生活動包括誘導祖細胞増殖和分化的能力，以及通過導致骨、軟骨、非礦化骨骼或結締組織和其他成年組織形成的事件發展支持和維持分化表型的能力。例如，本發明的BMP-7變體可用于在代謝性骨疾病中進行治療以防止損失和/或増加骨質量。在代謝性骨疾病中利用成骨蛋白進行治療以防止損失和/或増加骨質量的一般方法在美國專利號5，674，844中公開，其公開在此通過引用并入。本申請的BMP-7變體可用于牙周組織再生。利用成骨蛋白的牙周組織再生的一般方法在美國專利號5，733，878中公開，其公開在此通過引用并入。BMP-7變體可用于肝臟再生。利用成骨蛋白的肝臟再生的一般方法在美國專利號5，849，686中公開，其公開在此通過引用并入。BMP-7變體可用于治療慢性腎衰竭。利用成骨蛋白治療慢性腎衰竭的一般方法在美國專利號6，861，404中公開，其公開在此通過引用并入。本發明的BMP-7可用于提高中樞神經系統缺血或創傷之后的功能恢復。利用成骨蛋白提高中樞神經系統缺血或創傷之后的功能恢復的一般方法在美國專利號6，407, 060中公開，其公開在此通過引用并入。本發明的BMP-7變體可用于誘導樹突生長(dendritic growth)。利用成骨蛋白誘導樹突生長的一般方法在美國專利號6，949，505中公開，其公開在此通過引用并入。BMP-7變體可用于誘導神經細胞黏著。利用 成骨蛋白誘導神經細胞黏著的一般方法在美國專利號6，800, 603中公開，其公開在此通過引用并入。BMP-7變體可用于治療和預防帕金森氏病。利用成骨蛋白治療和預防帕金森氏病的一般方法在美國專利號6，506，729中公開，其公開在此通過引用并入。作為另ー個實例，BMP-7變體也可用于誘導牙本質發生。至今，牙髓組織對損傷的不可預測的應答是牙科醫學中的基礎臨床難題。作為又另ー個實例，BMP-7變體可誘導對中樞神經系統(CNS)修復的再生作用，這可利用大鼠腦刺模型(rat brain stab model)進行評估。實施例I :經ELISA識別免疫原件表位為了識別BMP-7的潛在線性T-細胞表位，合成覆蓋野生型人BMP-7成熟區域的整個序列的月太(Synthetic Biomolecules San Diego, CA)。十五個(15)氨基酸的十八種(18)肽中的每ー種都被構造。每種肽都與覆蓋BMP-7鄰接區域的肽具有5至10個氨基酸的重疊。18種肽中的每ー種的序列都在圖I中示出，在不同肽之間的重疊在圖2中示出。所述18種肽在ELISA測定中進行檢測，以確定它們與抗BMP-7抗體的結合。18種肽中的每ー種都以g/mL的濃度單獨包被在96孔高結合微量滴定板的単獨一行上。使用三個平板，平板I具有肽1-6，平板2具有肽7-12，平板3具有肽13-18。以合成方法生成的陰性對照肽被包被在每個平板的第7行上，以用作陰性對照。BMP-7被包被在每個平板的第8行上，以用作陽性對照。包被的平板在室溫下溫育過夜。第二天，在BBS/T中清洗平板六次。平板隨后用200 u I/孔的BBS/T牛奶封閉，并在37°C下溫育2小吋。該平板被再次用BBS/T清洗六次。對BMP-7的中和抗體呈陽性的七個患者血清樣本和對BMP-7的非中和抗體呈陽性的的三個患者血清樣本在BBS/T牛奶中以1:80進行稀釋，并被添加至所有3個平板的兩個鄰近列(以100 U I/孔,一式兩份檢測)。患者血清樣本從用OP-I Putty (Stryker BiotechHopkinton, MA)治療的患者獲得。例如，來自患者I的血清被添加至所有平板的第1_2列，來自患者2的血清被添加至所有平板的第3-4列等等。對抗BMP-7抗體呈陰性的ー個患者血清樣本被用作陰性對照。單克隆抗BMP-7抗體、1B12和12G3的組合被用作陽性對照。
患者血清樣本被添加至肽包被的平板并在37°C下溫育I小吋。該平板用BBS/T清洗六次。IOOu I的山羊抗人Ig HRP (Southern Biotech)以在BBS/T牛奶中1:40,000的稀釋添加至每個孔。該平板隨后在37°C下溫育I小吋，并且隨后在BBS/T牛奶中清洗六次。IOOu I的TMB底物(BioFX)被添加至每個孔，用于研究。IOOiU的0.18M H2SO4硫酸停止液被添加至每個平板。平板隨后被放置在M5SpectraMax (Molecular Devices)中并在 450nm 下讀取光密度。結合來自患者血清的非中和抗BMP-7抗體與18種肽的結果在圖3中示出，結合來自患者血清的中和抗BMP-7抗體與18種肽在圖4中示出。如圖3所示，肽13顯示了對來自3個陽性患者血清樣本(111694、111945和111665)的非中和抗BMP-7抗體的高結合親和性，但陰性患者血清(111266)，如所預期的，沒有顯示結合親和性。這說明肽13包含這些非中和抗BMP-7抗體的線性結合表位。如圖4所示，肽13再次顯示了對來自數個陽性患者樣本的中和抗BMP-7抗體的高結合親和性，這提示肽13包含中和抗BMP-7抗體的線性結合表位。此外，圖4中的數據不 但證實了抗BMP-7抗體與包含在肽13中的線性表位的結合，而且提示了中和抗體也可具有ー些對包含在肽I和9中的線性表位的結合親和性。對于肽5來說，也觀察到ー些結合。實施例2.通過改變表位改造具有降低的免疫原性的BMP-7蛋白肽9具有氨基酸序列GYAAYYCEGECAFPL (SEQ ID NO: 10)，而肽13具有氨基酸序列VHFINPETVPKPACCA (SEQ ID NO: 14)。然而，如在實施例I所示的，表位位于與肽9和肽13相應的BMP-7的區域中。因此，為了降低或消除這些序列的免疫原性，在BMP-7中在與肽9和肽13中的殘基相應的殘基處，進行氨基酸改變。為了確定造成肽9和13免疫原性的具體殘基，產生數種肽類似物，其中兩個連續的氨基酸被修飾，每ー個被修飾為丙氨酸殘基。產生足夠的肽，以便產生具有兩個連續丙氨酸殘基的肽9和13的所有排列。隨后，測定該肽類似物以分析與肽9和13與抗BMP-7抗體結合的能力相比，它們結合抗BMP7抗體的能力。與抗BMP-7抗體的結合降低的肽類似物被識別，并且確定肽9的殘基1、3、5、6、8、10或12中的ー個或多個(與成熟人BMP-7 (SEQ IDNO: I)的殘基 61、63、65、66、68、70 和 72 相應)和 / 或肽 13 的殘基 2、3、4、5、6、7、8、9、10、12 或 15 中的ー個或多個(與成熟人 BMP-7 (SEQ ID NO: I)的殘基 92、93、94、95、96、97、98、99、100、102或105相應)是與抗BMP-7抗體結合的原因，并由此引起重組人BMP-7的免疫原性。因此，確定為引起BMP-7免疫原性的那些殘基例如通過取代被修飾，以產生具有降低的免疫原性的BMP-7變體。根據本發明的改變，諸如本文中教導的氨基酸取代，根據標準重組遺傳工程技術被引入BMP-7的遺傳序列。變體BMP-7隨后根據標準方案在原核或真核表達系統中進行表達。所表達的變體BMP-7隨后根據標準方案被純化。實施例3. BMP-7變體誘導堿件磷酸酶活件測定了本發明的BMP-7變體在大鼠骨肉瘤細胞系ROS 17/2. 8中誘導堿性磷酸酶(ALP)活性的能力。本發明的變體BMP-7在九個點的劑量響應中一式三份進行檢測，野生型BMP-7用作陽性對照。具體地，ROS 17/2. 8細胞在96孔組織培養平板中鋪板。BMP-7變體以以下劑量添加至細胞6000、2000、666、222、74、24、8、2和0. 9ng/ml，并被溫育48小時的時間。細胞隨后被裂解，并且基于從樣本的平均光密度(OD)的非線性回歸獲得的EC50評估生長因子誘導ALP活性的能力。所有檢測的BMP-7變體證明了穩固的堿性磷酸酶活性，這說明變體保持了它們的生物活性。實施例4.與野生型相比，BMP-7變體具有降低或消除的免疫原性根據本發明實施方式的BMP-7變體在靈長類中被檢測，以確定它們的免疫原性。以真核產生的BMP-7變體被檢測，野生型人BMP-7(以真核產生的)被施用作為對照。在典型的實驗中，稱猴(rhesus macaques)被皮下注射40 ii g/kg的蛋白樣本,姆天一次,持續四周。以規定的間隔，從動物處獲得血清，并且抗BMP-7的抗體的血清濃度利用人IL-7包被的96孔平板，通過ELISA進行測量。通常，每個血清樣本的系列稀釋被添加至每個孔，一式三份，持續兩個小時，用PBS中的0. 05%吐溫(Tween)(吐溫20)清洗，并用PBS中1%BSA/1%山羊血清封閉。向每個樣本，添加辣根過氧化物酶綴合的抗獼猴IgG(在樣本緩沖液中為1:60, 000)，在37°C下溫育2小時，并且平板用PBS中的0. 05%吐溫清洗8次。樣本隨后利用比色基質溶液OPD (鄰苯ニ胺ニ鹽酸鹽)，通過在490nm下測量0D，減去在650nm下的背 景讀數進行測定。
發現以真核產生的野生型人BMP-7導致高抗BMP-7抗體的效價。相比之下，以真核產生的變體人BMP-7的抗體效價導致顯著較低的抗BMP-7抗體的效價。實施例6.變體BMP-7以低濃度，在人患者體內，在誘導骨和軟骨生長方面是有效尥。兩位人患者，每個都要求治療，以實現腰脊柱中的后外側融合。在一位患者中，在牛骨膠原蛋白和羧甲基纖維素鈉(類似于OP-1 Putty, Stryker Biotech, Hopkinton, MA)的基質中I. 5mg的變體BMP-7通過手術植入脊柱的每ー側要求融合的位置上。該基質在植入前用無菌鹽水(0.9%)溶液重建。在另一位患者中，在牛骨膠原蛋白和羧甲基纖維素鈉(類似于OP-I⑩ Putty, Stryker Biotech, Hopkinton, MA)的基質中 3. 5mg 的野生型 BMP-7通過手術植入脊柱的每ー側要求融合的位置上。在數個月的第一段時間后，每位患者的脊柱都用射線照相技術例如通過X射線觀看，以確定在融合處出現骨生長。在接受變體BMP-7的患者中，在融合位置上檢測到骨生長。然而，融合是不完全的。在接受野生型BMP-7的患者中，與在接受變體BMP-7的患者中相同水平的骨生長被檢測到。同樣，椎骨的融合是不完全的。在與數個月的第一段時間相同的數個月的第二段時間后，每位患者的脊柱都再次用射線照相技術例如通過X射線觀看。在每位患者中，在植入位置處的椎骨融合是完全的。因此，變體BMP-7可以以低于相應野生型BMP的濃度施用，同時仍然促進相同骨生長速度。這可歸因于對BMP-7變體減弱的免疫應答，由此允許施用與野生型BMP-7相比更低濃度的變體BMP-7，以實現相同水平的骨生長，這是因為對于免疫系統應答，沒有BMP-7損失。在另ー個實施例中，兩位患者，每位都要求治療，以實現腰脊柱中的后外側融合。在一位患者中，在牛骨膠原蛋白和羧甲基纖維素鈉(類似于OP-r'Putty，StrykerBiotech, Hopkinton, MA)的基質中3. 5mg的變體BMP-7通過手術植入脊柱的姆一側要求融合的位置上。該基質在注入前用無菌鹽水(0.9%)溶液重建。在另一位患者中，在牛骨膠原蛋白和羧甲基纖維素鈉(類似于OP-1 Putty, Stryker Biotech, Hopkinton, MA)的基質中
3.5mg的野生型BMP-7通過手術被注入脊柱的每ー側要求融合的位置上。
在數個月的第一段時間后，每位患者的脊柱都用射線照相技術例如通過X射線觀看，以確定在融合處出現骨生長。在接受變體BMP-7的患者中，在融合位置上檢測到骨生長，并且椎骨融合是完全的。相比之下，在接受野生型BMP-7的患者中，在植入位置處檢測到骨生長。然而，椎骨融合是不完全的。在與數個月的第一段時間相同的數個月的第二段時間后，接受野生型BMP-7的患者的脊柱再次用射線照相技術例如通過X射線觀看。在植入位置處的椎骨融合是完全的。因此，變體BMP-7可以以與相應的野生型BMP相同的濃度施用，以實現加速的骨生長速度。這可歸因于對BMP-7變體發動的(mount)減弱的免疫應答，由此允許與野生型相 比更多的變體BMP-7促進骨生長。
權利要求
1.BMP-7變體，其包括與成熟人BMP-7 (SEQ ID NO: I)至少90%的序列同一性，其中所述BMP-7變體包括在與成熟人BMP-7相應的以下位置中的一個或多個處的取代G61、A63、Y65、Y66、E68、E70、A72、H92、F93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102 或 A105。
2.根據權利要求I所述的BMP-7變體，其中所述取代為以下中的ー個或多個G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70G/D、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。
3.根據權利要求I所述的BMP-7變體，其中所述變體顯示BMP-7活性。
4.根據權利要求I所述的BMP-7變體，其中所述變體包括與成熟人BMP-7至少95%的序列同一性。
5.編碼根據權利要求I所述的BMP-7變體的核酸。
6.包括權利要求I所述的核酸的重組表達載體。
7.包括權利要求6所述的表達載體的細胞。
8.根據權利要求7所述的細胞，其中所述細胞為原核的。
9.根據權利要求7所述的細胞，其中所述細胞為真核的。
10.組合物，其包括根據權利要求I所述的BMP-7變體和藥物載體。
11.治療患者中骨骼病的方法，其包括對所述患者施用治療有效量的根據權利要求I所述的BMP-7變體。
12.降低人BMP-7蛋白免疫原性的方法，其包括以下步驟 識別人BMP-7的氨基酸序列中的免疫原性表位；和 通過在所述BMP-7的氨基酸序列中改造ー個或多個取代修飾所述表位，其中所述ー個或多個取代在與成熟人81^-7相應的位置661、463、￥65、￥66、￡68、￡70、ム72、1192、？93、194、N95、P96、E97、T98、V99、P100、P102或A105中的任何一個或多個處發生，以產生修飾的氨基酸序列。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述ー個或多個取代為以下中的任何一個或多個G61E、A63E/Q/H、Y65F/N、Y66E、E68D/K/H、E70G/D、A72S/F/P、H92N、F93N/L/S、I94M/K/S/V, N95V/F、P96S/N、E97S/T/D/K、T98K/I/S/Y/H、V99I、P100G、P102A 或 A105V。
14.根據權利要求12所述的方法，進ー步包括在合適的表達系統中表達由修飾的氨基酸序列編碼的蛋白質和純化所述蛋白質的步驟。
15.根據權利要求12所述的方法，其中表達所述蛋白在真核細胞中發生。
16.根據權利要求12所述的方法，其中表達所述蛋白在原核細胞中發生。
全文摘要
本發明涉及具有降低的免疫原性的骨形態發生蛋白。具體地，本發明涉及通過改變野生型BMP-7的氨基酸序列已被修飾以降低免疫原性的人BMP-7。
文檔編號C07K14/51GK102822197SQ201080064396
公開日2012年12月12日 申請日期2010年12月21日 優先權日2009年12月22日
發明者M·E·帕特森, M·H·阿拉維-伊斯瑪儀 申請人:史賽克公司