用于制備產生期望的多肽的抗體生產細胞的方法

專利名稱：用于制備產生期望的多肽的抗體生產細胞的方法
技術領域：
本申請要求于2009年11月19日提交的日本專利申請號2009-264398以及于2009年11月20日提交的美國臨時專利申請號61/263，285的優先權，其完整內容通過引用并入到本文中。本發明涉及將編碼期望的多肽的DNA導入到抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域中的方法。本發明還涉及用于制備產生導入了突變的多肽的抗體生產細胞的方法，以及用于產生導入了突變的多肽的方法。本發明還涉及用于上述方法中的細胞和基因打靶載體。背景領域響應抗原刺激而產生的抗體的親和力在體內隨時間而升高。這被稱為“親和力成熟”。在活化后活躍分裂的抗原特異性B細胞中，在抗體可變區基因中高頻率地發生體細胞突變。親和力成熟通過從不同的突變B細胞的群體中嚴格地選擇高親和力的B細胞克隆來進行。基于該原則，常規上通過重復地免疫動物和制備雜交瘤來生產單克隆抗體。但是，制 備抗體需要大量的勞動和時間，且制備出的抗體的抗原特異性和親和力不能改變。然而，在許多情況下，為了制藥或診斷試劑的用途，需要進一步改善制備出的抗體的特異性和親和力。出于該目的，目前通常使用噬菌體展示方法，這是一種體外技術。在噬菌體展示方法中，可以比雜交瘤方法更快速地實施選擇抗體的方法。但是，已知噬菌體展示方法存在問題。例如，抗體的成功產生在很大程度上依賴于文庫的質量，由于Fv結構域是作為重組svFv展示在噬菌體上的，因而當從scFv制備完整抗體并表達時，特異性經常改變。特別是對于該方法而言關鍵性的突變文庫的制備需要大量的工作和先進的DNA重組技術。認為如果利用體外培養細胞系統來重現體內抗體生產系統，可以快速高效地生產抗體。具有向抗體基因導入突變的能力的DT40雞B細胞系適用于該目的，理由如下(I)由于它們自發地導入突變的能力，可以通過簡單地培養DT40細胞而生產多種抗體文庫；(2)因為DT40細胞在細胞表面上表達抗體并將它們分泌到培養上清液中，所以可以基于抗原結合來選擇特定克隆；(3)由于非常高的同源重組效率，因而可以通過基因敲除等方便地修飾DT40細胞的功能。本發明人建立了 DT40-SW細胞系，其中DT40的一種突變特征(mutation feature)可以任意開啟和關閉。然后，本發明人開發了用于在體外使用DT40-SW生產抗體的方法(專利文件I和非專利文件I)。使用該方法，本發明人通過開啟突變特征并培養，成功的從抗體文庫中制備了抗各種抗原的抗體，包括難以通過常規方法獲得的抗體(非專利文件2和3)。此外，該方法允許通過進一步導入突變到制備出的抗體生產細胞中以產生多種多樣的抗體，并重復進行抗體選擇，而實現抗體親和力成熟(專利文件2)。通過該方法制備的抗體是雞IgM抗體，親和力成熟僅對于通過該方法制備的這些抗體是可能的。因此，如果該方法可以應用于通過雜交瘤方法、噬菌體展示方法等制備的抗體，則將是非常有用的技術，因為它可以用于改善積累的單克隆抗體的特異性和親和力。改善通過雜交瘤方法獲得的抗體的性質需要使用體外系統，例如噬菌體展示方法。但是，基于噬菌體展示的抗體功能改變不一定是簡單的技術。同時，對于具有突變能力的細胞系(例如DT40)，已通過向其自身的抗體基因導入突變而將其作文庫(非專利文件
2、4和5)。但是，尚未有關于使用此類細胞系修飾外源抗體基因的報道。引用列表專利文獻PTLl :日本專利申請公開號(JP-A) 2006-109711(未審查，已公開的日本專利申請)
PTL2 JP-A(Kokai)2009-60850PTL3 W02007/026661非專利文獻NPLl Kanayama, N.等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 327，70-75Todo, K.等人，J. Biosci. Bioeng. 102，478-481 (2006)Kanayama, N.等人，YAKUGAKU ZASSHI 129,11-17(2009) Cumbers, S. J.等人，Nat. Biotechnol. 20，1129-1134 (2002)Seo, H.等人，Nat. Biotechnol. 23，731-735 (2005)Fawell 等人，Characterization and colocalization of steroid binding anddimerization activities in the mouse estrogen receptor. Cell (1990),第 60 卷，(6)第953-62頁Danielian等人，Identification of residues in the estrogen receptor thatconfer differential sensitivity to estrogen and hydroxytamoxifen. Mol Endocrinol(1993)，第 7 卷，(2)，第 232-40 頁Littlewood 等人,A modified oestrogen receptor ligand-binding domain asan improved switch for the regulation of heterologous proteins. Nucleic AcidsRes (1995)，第 23 卷，(10)，第 1686 頁Zhang 等人，Inducible site-directed recombination in mouse embryonicstem cells. Nucleic Acids Res (1996),第 24 卷,(4),第 543-8 頁發明概述技術問題如果可以將編碼包含期望的氨基酸序列的多肽的基因導入到抗體生產細胞(例如DT40)的抗體基因座中，則可以利用抗體生產細胞的導入突變的能力來修飾DNA。但是，用于將外源DNA導入到抗體生產細胞的抗體基因座中的有效技術尚未被研發出來。本發明是鑒于上述情況實現的。本發明的一個目標是提供將編碼期望的氨基酸序列的DNA導入到抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域中的方法。本發明的另一個目標是提供用于制備產生多肽的抗體生產細胞的方法，用于產生多肽的方法，用于制備產生導入了突變的多肽的抗體生產細胞的方法，和用于產生導入了突變的多肽的方法。
本發明的另一個目標是提供用于上述方法中的細胞和包含所述細胞的試劑盒。本發明的另一個目標是提供用于上述方法的基因打靶載體，以及包含所述載體的細胞和試劑盒。本發明的另一個目標是提供包含編碼雞抗體重鏈可變區的DNA的DNA，包含所述DNA的載體，和包含所述DNA或載體的細胞。解決問題的手段本發明人開發了用于將編碼期望的氨基酸序列的DNA高效地導入到DT40-SW的抗體可變區基因座中的方法，DT40-SW是源自DT40雞B細胞系的突變細胞系，具有自發導入突變的能力。該方法允許通過突變所導入的DNA而修飾多肽，使其具有更好的功能。特別是，本發明人揭示了 DT40細胞系的抗體重鏈可變區基因座的核苷酸序列。藉此，本發明人成功的構建了能夠用編碼期望的氨基酸序列的DNA高效地取代DT40細胞系的抗體重鏈可變區基因座的打靶載體。
本發明是基于上述發現的，并涉及以下內容[I]將DNA構建體與抗體生產細胞的編碼包含抗體可變區的DNA的區域同源重組的方法，包括將包含DNA構建體的打靶載體導入抗體生產細胞中的步驟，所述DNA構建體包含(I)在所述細胞中執彳丁功能的啟動子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的DNA。[2] [I]的方法，其中(3)的DNA抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間，且其中⑶的DNA包括在細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因，且(3)的DNA能夠通過位點特異性重組酶從所述DNA構建體中被去除。[3]選擇細胞的方法，包括下述步驟(a)通過向抗體生產細胞中導入包含DNA構建體的打靶載體而允許DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間同源重組，所述DNA構建體包含(I)在所述細胞中執行功能的啟動子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的DNA ;和(b)選擇其中在所述DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間已發生同源重組的細胞。[4] [3]的方法，其中(3)的DNA抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間，且其中⑶的DNA包含在細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因，且(3)的DNA能夠通過位點特異性重組酶而從DNA構建體中被去除。[5] 一種制備產生多肽的抗體生產細胞的方法，包括下述步驟
(a)通過向抗體生產細胞中導入包含DNA構建體的打靶載體而允許DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間同源重組，所述DNA構建體包含(I)在所述細胞中執行功能的啟動子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的DNA ；
(b)選擇其中在DNA構建體與抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間已發生同源重組的細胞；和(c)從步驟(b)中選擇的細胞的基因組DNA中去除(3)的DNA。[6] [5]的方法，其中(3)的DNA抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間，且其中⑶的DNA包含在細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因，且(3)的DNA能夠通過位點特異性重組酶從所述DNA構建體中被去除。[7] [5]的方法，其中步驟(a)至(c)定義如下(a)通過向抗體生產細胞中導入包含DNA構建體的打靶載體而允許DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間同源重組，所述DNA構建體包含(I)在所述細胞中執彳丁功能的啟動子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA,該DNA包含在所述細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因，并且能夠通過位點特異性重組酶從該DNA構建體中被去除；(b)選擇其中在所述DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間已發生同源重組的細胞；和(C)通過使位點特異性重組酶在步驟(b)中選擇的細胞的基因組中的位點特異性重組酶識別序列處反應而從該細胞的基因組DNA中去除位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA。[8] [5]至[7]中任一項的方法，其中所生產的多肽被展示在細胞的表面上，和/或被分泌到細胞外。[9] [4]、[6]和[7]中任一項的方法，其中利用所述標記基因的表達作為指標來選擇所述細胞。[10] [3]、[4]、[6]、[7]和[9]中任一項的方法，其中利用內源性抗體表達在所述抗體生產細胞中的缺失作為指標來選擇所述細胞。[11] 一種制備產生導入了突變的多肽的抗體生產細胞的方法，包括下述步驟(a)通過向表達AID基因的抗體生產細胞中導入包含DNA構建體的打靶載體而允許DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間同源重組，所述DNA構建體包含(I)在所述細胞中執行功能的啟動子DNA ；
(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的DNA ；(b)選擇其中在所述DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間已發生同源重組的細胞；和(c)從步驟(b)中選擇的細胞的基因組DNA中去除(3)的DNA。[12] [11]的方法，其中步驟(a)至(c)定義如下(a)通過向表達AID基因的抗體生產細胞中導入包含DNA構建體的打靶載體而允
許DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間同源重組，所述DNA構建體包含(I)在所述細胞中執行功能的啟動子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA,該DNA包含在所述細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因，并且能夠通過位點特異性重組酶從該DNA構建體中被去除；(b)選擇其中在所述DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間已發生同源重組的細胞；和(c)通過使位點特異性重組酶在步驟(b)中選擇的細胞的基因組中的位點特異性重組酶識別序列處反應而從所述細胞的基因組DNA中去除位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA。[13] 一種制備產生導入了突變的多肽的抗體生產細胞的方法，包括下述步驟(a)通過向抗體生產細胞中導入包含DNA構建體的打靶載體而允許DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間同源重組，所述抗體生產細胞中AID基因表達可以人為開啟和關閉，所述DNA構建體包含(I)在所述細胞中執彳丁功能的啟動子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的DNA ；(b)選擇其中在所述DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間已發生同源重組的細胞；和(c)從步驟(b)中選擇的細胞的基因組DNA中去除(3)的DNA ；(d)開啟和關閉AID基因表達；和(e)選擇表達AID基因的細胞。[14] [13]的方法，權利要求13的方法，其中步驟(a)至(e)定義如下(a)通過向抗體生產細胞中導入打靶載體而允許DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間同源重組，其中所述打靶載體包含DNA構建體，所述DNA構建體包含(I)在所述細胞中執彳丁功能的啟動子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和
(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA,該DNA包含在所述細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因，并且能夠通過位點特異性重組酶從該DNA構建體中被去除，其中該抗體生產細胞中的內源性AID基因被功能性破壞，且抗體生產細胞包含這樣的DNA構建體，所述DNA構建體包含在所述細胞中執行功能的啟動子DNA，位于兩個按相反方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA，該DNA能夠被位點同一性重組酶倒位，并包含外源性AID基因；(b)選擇其中在所述DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間已發生同源重組的細胞；(C)通過使位點特異性重組酶在步驟(b)中選擇的細胞的基因組中的位點特異性重組酶識別序列處反應而從所述細胞的基因組DNA中去除位于兩個按相同方向排列的位 點特異性重組酶識別序列之間的DNA ；(d)通過使位點特異性重組酶在步驟(b)選擇的細胞的基因組中的位點特異性重組酶識別序列處反應而使位于兩個按相反方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA轉位，以開啟和關閉AID基因表達；和(e)選擇表達AID基因的細胞。[15] [13]的方法，其中步驟(a)至(e)定義如下(a)通過向抗體生產細胞中導入打靶載體而允許DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間同源重組，其中抗體生產細胞中內源性AID基因被功能性破壞，且該抗體生產細胞包含DNA構建體，其包含在所述細胞中執行功能的啟動子DNAjP位于兩個按相反方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA，該DNA能夠通過位點特異性重組酶轉位，并包含外源性AID基因，和包含在細胞中執行功能的啟動子DNA和編碼位點特異性重組酶的DNA的DNA構建體，其中在所述抗體生產細胞中，位點特異性重組酶在存在胞外刺激的條件下活化，在沒有胞外刺激的條件下不活化，其中所述打靶載體包含DNA構建體，所述DNA構建體包含(I)在所述細胞中執彳丁功能的啟動子DNA ;(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA,該DNA包含在所述細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因，并且能夠通過位點特異性重組酶從該DNA構建體中被去除；(b)選擇其中在所述DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間已發生同源重組的細胞；(C)通過對步驟(b)中選擇的細胞的胞外刺激活化位點特異性重組酶的活性，使所述位點特異性重組酶在所述細胞的基因組中的位點特異性重組酶識別序列處反應，藉此從所述細胞的基因組DNA中去除位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA ；(d)通過對步驟(b)中選擇的細胞的胞外刺激活化位點特異性重組酶的活性，使所述位點特異性重組酶在所述細胞的基因組中的位點特異性重組酶識別序列處反應，藉此使所述位于兩個按相反方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA轉位，以開啟和關閉AID基因表達；和(e)選擇表達AID基因的細胞。
[16] [11]至[15]中任一項的方法，其中所產生的導入了突變的多肽被展示在細胞表面上和/或分泌到細胞之外。[17] [11]至[16]中任一項的方法，其中在步驟(b)中利用標記基因的表達作為指標選擇細胞。[18] [11]至[17]中任一項的方法，其中在步驟(b)中利用抗體生產細胞中內源性抗體表達的缺失作為指標選擇細胞。[19] [15]的方法，其中所述位點特異性重組酶是位點特異性重組酶與雌激素受體或包含其雌激素結合結構域的蛋白質的融合蛋白；且其中能夠結合雌激素結合結構域的配體充當胞外刺激。[20] [19]的方法，其中雌激素受體或其雌激素結合結構域是小鼠突變型雌激素受體，其中氨基酸第525位的甘氨酸被精氨酸取代；或者是其小鼠突變型雌激素結合結構域；且其中能夠結合雌激素結合結構域的配體是4-羥泰米芬。[21] [11]至[20]中任一項的方法，其中抗體生產細胞具有下列特性(a)在該抗體生產細胞中，XRCC3基因的兩個等位基因中僅一個是失活的；和(b)與具有XRCC3基因的兩個等位基因的細胞相比，導入點突變的頻率是升高的。[22] [21]的方法，其中在XRCC3基因的兩個等位基因的任一個中，第6個外顯子是失活的。[23] [11]至[22]中任一項的方法，其中抗體生產細胞是B細胞。[24] [23]的方法，其中B細胞源自雞。[25] [2]、[4]、[6]、[7]、[9]、[10]、[12]、[14]和[15]中任一項的方法，其中位點特異性重組酶和位點特異性重組酶識別序列的組合是下列(i)或(ii)(i)位點特異性重組酶是Cre重組酶，且位點特異性重組酶識別序列是IoxP序列；(ii)位點特異性重組酶是FLP重組酶，且位點特異性重組酶識別序列是FRT序列。[26] [I]至[25]中任一項的方法，其中包含期望的氨基酸序列的多肽包含抗體恒定區的氨基酸序列和期望的氨基酸序列。[27] [26]的方法，其中期望的氨基酸序列是抗體可變區的氨基酸序列。[28] [I]至[25]中任一項的方法，其中包含期望的氨基酸序列的多肽是抗體重鏈或輕鏈。[29] 一種用于產生編碼多肽或導入了突變的多肽的DNA的方法，包括下述步驟(a)通過[5]_[8]和[11]_[24]中任一項的方法制備產生多肽或導入了突變的多肽的抗體生產細胞；
(b)從步驟(a)制備的抗體生產細胞中分離編碼多肽或導入了突變的多肽的DNA。[30] 一種用于產生編碼多肽或導入了突變的多肽的方法，包括下述步驟(a)通過[5]_[8]和[11]_[24]中任一項的方法制備產生多肽或導入了突變的多肽的抗體生產細胞；(b)從步驟(a)生產的抗體生產細胞中或從來自所述細胞的分泌產物中分離所述多肽或導入了突變的多肽。[31]產生編碼多肽或導入了突變的多肽的方法，包括下述步驟(a)通過[29]的方法產生編碼多肽或導入了突變的多肽的DNA ；(b)分離由步驟(a)生產的DNA編碼的多肽。
[32]抗體生產細胞，其中包含編碼抗體可變區的DNA的區域與DNA構建體同源重組，所述DNA構建體包含(I)在所述細胞中執行功能的啟動子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的DNA。[33] [32]的細胞，其中(3)的DNA是這樣的DNA :其抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間，且其包含在細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因，并能夠通過位點特異性重組酶從所述DNA構建體中被去除。[34] [32]或[33]的細胞，其中所述抗體生產細胞表達AID基因。[35] [32]或[33]的細胞，其中所述抗體生產細胞是其中AID基因表達可以被人為開啟和關閉的細胞。[36] [35]的細胞，其中內源性AID基因被功能性破壞，且細胞包括這樣的DNA構建體，所述構建體包含在所述細胞中執行功能的啟動子DNA ;和位于兩個按相反方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA，該DNA能夠通過位點特異性重組酶轉位，并且包含外源性AID基因。[37] [36]的細胞，其中所述抗體生產細胞還包含如下所述的DNA構建體，該構建體包含在細胞中執行功能的啟動子DNA和編碼位點特異性重組酶的DNA，其中該位點特異性重組酶在存在胞外刺激的條件下活化，而在缺少胞外刺激的條件下不活化。[38] [37]的細胞，其中位點特異性重組酶是位點特異性重組酶與雌激素受體或包含其雌激素結合結構域的蛋白質的融合蛋白。[39] [38]的細胞，其中雌激素受體或其雌激素結合結構域是小鼠突變型雌激素受體，其中氨基酸第525位的甘氨酸被精氨酸取代；或者是其小鼠突變型雌激素結合結構域。[40] [32]至[39]中任一項的細胞，其中所述抗體生產細胞具有下列特性(a)在抗體生產細胞中，XRCC3基因的兩個等位基因中僅一個是失活的；和(b)與具有XRCC3基因的兩個等位基因的細胞相比，導入點突變的頻率是升高的。[41] [40]的細胞，其中在XRCC3基因的兩個等位基因的任一個中，第6個外顯子是失活的。
[42] [32]至[41]中任一項的細胞，其中抗體生產細胞是B細胞。[43] [42]的細胞，其中B細胞源自雞。[44] [33]和[36]-[39]中任一項的細胞，其中位點特異性重組酶和位點特異性重組酶識別序列的組合是下列⑴或(ii):(i)位點特異性重組酶是Cre重組酶，且位點特異性重組酶識別序列是IoxP序列；(ii)位點特異性重組酶是FLP重組酶，且位點特異性重組酶識別序列是FRT序列。[45] [32]至[44]中任一項的細胞，其中包含期望的氨基酸序列的多肽包含抗體
恒定區的氨基酸序列和期望的氨基酸序列。[46] [45]的方法，其中期望的氨基酸序列是抗體可變區的氨基酸序列。[47] [32]至[44]中任一項的細胞，其中包含期望的氨基酸序列的多肽是抗體重鏈或輕鏈。[48]包含[32]至[47]中任一項的細胞的試劑盒。[49] 一種包含DNA構建體的基因打靶載體，所述構建體包含(I)在所述細胞中執彳丁功能的啟動子DNA ；(2)包含克隆位點的DNA ;和(3)如下所述的DNA :其能夠從DNA構建體中被去除，并抑制由插入到⑵的DNA中的DNA編碼的、包含期望的氨基酸序列的多肽的產生；其中所述基因打靶載體用于同源重組所述DNA構建體與抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域。[50] [49]的載體，其中(3)的DNA是如下所述的DNA :其能夠通過位點特異性重組酶從所述DNA構建體中被去除，并抑制由插入到(2)的DNA中的DNA編碼的、包含期望的氨基酸序列的多肽的產生，且其位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間，并包含在細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因。[51] [49]或[50]的載體，其中編碼期望的氨基酸序列的DNA被插入到克隆位點中。[52] [49]-[51]中任一項的載體，其中包含期望的氨基酸序列的多肽包含抗體恒定區的氨基酸序列和期望的氨基酸序列。[53] [52]的載體，其中期望的氨基酸序列是抗體可變區的氨基酸序列。[54] [49]-[51]中任一項的載體，其中包含期望的氨基酸序列的多肽是抗體重鏈或輕鏈。[55]包含[49]-[54]中任一項的打靶載體的細胞。[56]包含[49]_[54]中任一項的打靶載體的試劑盒。[57]包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列的DNA。[58]包含[57]的DNA的載體。[59]包含[57]的DNA或[58]的載體的細胞。發明的有益效果本發明提供了用于將編碼期望的氨基酸序列的DNA導入抗體生產細胞的抗體可變區基因座中的打靶載體。
根據本發明，可以通過將編碼包含期望的氨基酸序列的多肽的DNA導入抗體生產細胞的抗體可變區基因座中，在特定條件下產生期望的多肽。此外，可以利用抗體生產細胞導入突變的能力來產生導入了突變的多肽。本發明可用于多肽的功能性修飾。
附圖簡介圖I :圖I展示了導入外源抗體可變區基因和可變區被取代了的嵌合抗體的示意圖。A顯示了抗體基因座和用于導入外源抗 體可變 區基因的方法的示意圖。通過基因打靶，用外源抗體可變區基因取代雞抗體可變區基因來修飾DT40細胞基因組的抗體基因座，使得細胞表達包含外源抗體可變區和雞抗體恒定區的嵌合抗體。B顯示了可變區被取代了的嵌合抗體的示意圖。由于可變區基因的取代，抗體被表達為外源抗體可變區和雞抗體恒定區的嵌合體。圖2 :圖2展示了產生包含外源抗體可變區和雞抗體恒定區的嵌合抗體的DT40的制備方法的示意圖。A顯示了打靶載體的結構。B顯示了打靶后細胞的抗體基因座結構。C顯示了在通過Cre重組酶去除藥物抗性基因后的抗體基因座結構，所述Cre重組酶在打靶后用4-羥泰米芬處理細胞而激活。D顯示了制備導入了外源抗體可變區基因的DT40細胞的示例性示意圖。圖3 :圖3顯示了抗體重鏈可變區基因的限制性酶切圖。用星號(*)標記的限制性位點源自ADASH II。圖4:圖4展示了 VH打靶載體I中的限制性位點的位置的示意圖。A顯示了雞抗體重鏈可變區基因的序列，和外源抗體可變區基因所插入的限制性位點的位置。B顯示了向VH打靶載體I中插入外源抗體可變區基因的方法。帶箭頭的虛線分別指示編碼信號肽、VH和JH的區域。垂直的箭頭指示信號肽的切割位點。圖5 :圖5顯示了構建VH打祀載體的示意圖。A顯示來自雞抗體重鏈基因的XbaI-NotI片段，該片段被用于構建VH打靶載體。B至E顯示了用于構建VH打靶載體的示意圖。F顯示了 VH打靶載體2的結構。圖6 :圖6展示了 VH打靶載體2中的限制性位點的位置的示意圖。A顯示了雞抗體重鏈可變區基因的序列，和外源抗體可變區基因所插入的限制性位點的位置。B顯示了向VH打靶載體2中插入外源抗體可變區基因的方法。帶箭頭的虛線分別指示編碼信號肽、VH和JH的區域。垂直的箭頭指示信號肽的切割位點。圖7 :圖7展示了 VL打靶載體I中的限制性位點的位置的示意圖。A顯示了雞抗體輕鏈可變區基因的序列，和外源抗體可變區基因所插入的限制性位點的位置。B顯示了向VL打靶載體I中插入外源抗體可變區基因的方法。帶箭頭的虛線分別指示編碼信號肽、VL和幾的區域。垂直的箭頭指示信號肽的切割位點。圖8 :圖8顯示了構建VL打祀載體的的示意圖。A顯示了在雞抗體輕鏈基因周圍的片段，該片段被用于構建VL打靶載體。B和C顯示了用于構建VL打靶載體I的的示意圖。D顯示了 VL打靶載體2的結構。圖9 :圖9展示了 VL打靶載體2中的限制性位點的位置的示意圖。A顯示了雞抗體輕鏈可變區基因的序列，和外源抗體可變區基因所插入的限制性位點的位置。B顯示了向VL打靶載體2中插入外源抗體可變區基因的方法。帶箭頭的虛線分別指示編碼信號肽、VL和幾的區域。垂直的箭頭指示信號肽的切割位點。

圖10 :圖10展不了小鼠VHT基因打祀的不意圖和照片。A顯不了一種小鼠VHT基因打靶載體的結構，以及在打靶后雞抗體重鏈可變區基因周圍的基因組結構。B顯示了實施驗證打靶后的內源性抗體重鏈基因的PCR結果。VHT是其中小鼠VHT基因被打靶的克隆，發現在該克隆中缺少對應于重排鏈的條帶。SW指沒有打靶的DT40-SW。C顯示了為驗證打靶后的內源性抗體重鏈基因的結構而實施的Southern印跡結果。SW是沒有打靶的DT40-SW，而C2和C3是通過PCR發現缺少對應于重排鏈的條帶的克隆。左側的C2和C3對顯示了在4-羥泰米芬處理前的結果，而右側的對顯示了在4-羥泰米芬處理后的結果。圖11 :圖11展示了圖表， 該圖表顯示在小鼠VHT基因被打靶的細胞中的抗體表達。A顯示了細胞表面上的IgM抗體表達的流式細胞術分析結果。在小鼠VHT基因成功被打靶的VHT細胞中，細胞表面的抗體表達缺失。B顯示了在4-羥泰米芬處理后的IgM抗體表達的流式細胞術分析結果。4-羥泰米芬處理恢復了 A的細胞中的細胞表面抗體表達。C顯示了 VHT表達的流式細胞術分析結果。如B所示的恢復了抗體表達的細胞表達了導入的小鼠抗體基因(VHT)。D顯示了在4-羥泰米芬處理后，在克隆的細胞(C2和C3)中的抗體表達的流式細胞術分析結果。在4-羥泰米芬處理后，在克隆的細胞中也觀察到了穩定的抗體表達。圖12A:圖12A顯示了誘變后的突變分析的結果。該結果是通過對DT40-SW進行突變分析獲得的。餅圖表示克隆總數和突變克隆數。圖12B :圖12B顯示了誘變后的突變分析的結果。該結果是通過對C2進行突變分析獲得的。下劃線表示VHT的CDR結構域。餅圖表示具有突變的克隆數。表格顯示了突變的核苷酸。圖12C:圖12C顯示了誘變后的突變分析的結果。該結果是通過對C3進行突變分析獲得的。下劃線表示VHT的CDR結構域。餅圖表示具有突變的克隆數。表格顯示了突變的核苷酸。圖13 :圖13用展不了小鼠λ I基因打祀的不意圖和照片。A顯不了一種小鼠λ基因打靶載體的結構，以及在打靶后雞抗體輕鏈可變區基因周圍的基因組結構。B顯示了為了驗證打靶后的內源性抗體輕鏈基因的結構而實施的PCR的結果。VHT-λ I-Β4是一個基因被打靶的克隆。SW指沒有打靶的DT40-SW。C顯示為了驗證打靶載體插入到雞抗體輕鏈基因中而實施的PCR的結果。圖14 :圖14顯示了小鼠VHT和λ I基因被打靶、且改變了抗體表達的細胞的制備流程圖。圖15 :圖15的示意圖顯示了在小鼠VHT和λ I基因被打靶的細胞中的嵌合抗體表達。顯示抗體在小鼠VHT和λ I基因被打靶的細胞(VHT-λ I克隆Β4)中有表達。VHT-λ I克隆B4、DT40-SW細胞(陰性對照)和QM小鼠脾細胞(陽性對照)在用或不用抗小鼠VHT的抗體(α-Id)或抗小鼠λ輕鏈的抗體(α-λ1、2、3)染色之后，通過流式細胞術進行分析。圖16 :圖16顯示為了評估在小鼠VHT和λ I基因被打靶的細胞(VHT-λ 1Β4)中的抗體輕鏈基因表達而實施的PCR的示意圖和照片。
圖17 :圖17顯示為了評估在小鼠VHT和λ I基因被打靶的細胞(VHT-λ 1Β4)中的抗體表達而實施的ELISA的結果。A顯示了對IgM抗體表達水平的評估。B顯示了對抗體特異性的評估。圖18 :圖18顯示了在小鼠λ I基因被打靶的細胞中，小鼠λ I抗體中導入的突變
的頻率。圖19 :圖19顯示了抗體重鏈可變區的上游區域一個片段的序列(SEQ ID Ν0:4)。該示意圖顯示了通過DNA步行方法鑒別的抗體重鏈可變區基因上游區域的序列。該序列只包括新鑒別出的部分。圖20 :圖20顯示了在DT40的抗體重鏈可變區基因周圍的核苷酸序列(SEQ IDNO:7)。該序列包括圖3中顯示了限制性酶切圖譜的抗體重鏈可變區基因的完整核苷酸序列。下劃線(第1-3120位和第3882-7891位)顯示了新鑒別的核苷酸序列。第1-3223位 5’上游區；第3224-3269和3453-3463位編碼信號肽的序列(第3270-3452位的序列是內含子，通過剪接去除；第3224-3269和3453-3463位的序列連接在一起形成信號肽序列);第3464-3839位抗體重鏈可變區基因的區域，不包括信號肽；第3840-7931位3’下游區。實施例中描述的VH打靶載體是使用第1829-3223位(從BamHI位點至緊鄰在起始密碼子之前的核苷酸)和第3869-6548位(從緊鄰在JH編碼區之后的SacII位點至XhoI位點)的序列作為臂，以及第3224-3463位的序列作為信號肽制備的。圖21 :圖21顯示了 VH打靶載體I的核苷酸序列(SEQ ID NO: 10)。該序列包括圖5Ε中顯示的結構的完整核苷酸序列，但不包括載體骨架部分。單下劃線指示信號肽序列，雙下劃線指示IoxP序列。圖22 :圖22顯示了 VH打靶載體2的核苷酸序列(SEQ ID NO: 13)。該序列包括圖5F中顯示的結構的完整核苷酸序列，但不包括載體骨架部分。下劃線指示信號肽序列，雙下劃線指示IoxP序列。圖23 :圖23顯示了 VL打靶載體I的核苷酸序列(SEQ ID NO: 18)。該序列包括圖SC中顯示的結構的完整核苷酸序列，但不包括載體骨架部分。下劃線(第1869-1914和2040-2056位)指示信號肽序列，雙下劃線指示IoxP序列。與雞抗體輕鏈基因周圍的序列同源的臂區域位于第1-1868(不包括信號肽序列)和第5011-6870位。圖24 :圖24顯示了 VL打靶載體2的核苷酸序列(SEQ ID NO: 20)。該序列包括圖8D中顯示的結構的完整核苷酸序列，但不包括載體骨架部分。下劃線(第1869-1914和2040-2056位)指示信號肽序列，雙下劃線指示IoxP序列。與雞抗體輕鏈基因周圍的序列同源的臂區域位于第1-1868(不包括信號肽序列)和第5002-6861位。圖25 :圖25顯示了一種突變雌激素受體的他莫昔芬結合位點的序列(SEQIDN0:40)。突變位點用下劃線表示。由于G變為C的核苷酸取代，密碼子編碼的氨基酸從甘氨酸(G)變為精氨酸(R)。圖26 :圖26顯示了被用作AID表達盒的雞AID cDNA核苷酸序列。下劃線部分(第6-597位)顯示了編碼蛋白質的區域。圖27 :圖27顯示了用于與突變雌激素受體融合的修飾的Cre重組酶基因的核苷酸序列。融合蛋白中消除了末端的終止密碼子。下劃線部分(第4-21位)顯示了源自SV40大T抗原的核轉位信號。
圖28 :圖28展示了雞VL基因打靶的示意圖和照片。A顯示了雞VL基因打靶載體的結構，和打靶后雞抗體輕鏈可變區基因周圍的基因組結構。B顯示為了評估打靶后的內源性抗體輕鏈基因的結構而實施的PCR的結果。CVL-C4是打靶的克隆。C顯示為了評估打靶載體在雞抗體輕鏈基因中的插入而實施的PCR的結果。圖29 :圖29展示了靶向雞VL基因表達的位移圖解。圖30 :圖30顯示了導入到打靶的雞VL基因中的突變頻率。實施方案的說明本發明涉及將DNA構建體與抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域同源重組的方法,包括將包含DNA構建體的打靶載體導入抗體生產細胞中的步驟，所述DNA構建體包含(I)在所述細胞中執彳丁功能的啟動子DNA ； (2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的DNA。在本文中，打靶載體也被稱為“基因打靶載體”。將DNA構建體與抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域同源重組的方法也被稱為“用于向抗體生產細胞的抗體可變區基因的基因座中導入編碼期望的氨基酸序列的DNA的方法”。抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域也可以稱為“抗體基因的基因座中的DNA”、“編碼抗體可變區的DNA周圍的區域”、“包含編碼抗體可變區的DNA和位于其5’側的啟動子區的區域”、“包含編碼抗體可變區的DNA和在其5’側的DNA的區域”、“包含編碼抗體可變區的DNA和其3’側的DNA的區域”、“包含編碼抗體可變區的DNA和位于所述DNA的5，和3，側翼的DNA”等等。本發明的打靶載體除上述(I)至(3)的DNA以外，還可以包含與抗體基因的基因座中的DNA同源的DNA。與抗體基因的基因座中的DNA同源的DNA也可以稱為“包含與抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA的周圍的區域同源的核苷酸序列的DNA”、“包含與位于抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA 5’側的啟動子區的5’側的區域同源的核苷酸序列的DNA”、“包含與編碼抗體可變區的DNA的3’側的區域同源的核苷酸序列的DNA”、“與編碼抗體可變區的DNA的5’側的DNA同源的DNA”、“與編碼抗體可變區的DNA的3’側的DNA同源的DNA”、“包含與抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA的5’和3’側側翼的DNA區域同源的核苷酸序列的DNA”等等。在本文中，“5，側的DNA”也可以稱為“5，側上游區域的DNA”，而“3，側的DNA”也可以稱為“3’側下游區域的DNA”。當本發明的載體被導入到抗體生產細胞中時，在包含與編碼抗體可變區的DNA周圍的區域同源的核苷酸序列的DNA與抗體生產細胞的基因組中的編碼抗體可變區的DNA周圍的區域之間發生同源重組。其結果是，抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域被包含上述⑴至⑶的DNA的DNA構建體取代。當上述(I)的DNA是位于抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA的5’側的啟動子時，上述(I)的DNA也可以稱為“包含與抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA周圍的區域同源的核苷酸序列的DNA”。此外，包含與編碼抗體可變區的DNA周圍的區域同源的核苷酸序列的DNA也可以稱為“包含與編碼抗體可變區的DNA的5’和3’側側翼的DNA區域同源的核苷酸序列的DNA”。在此情況下，本發明的方法也可以將DNA構建體與抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域同源重組的方法，包括將包含DNA構建體的打靶載體導入抗體生產細胞中的步驟，所述DNA構建體包含(I)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(2)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的DNA。“包含與抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA周圍的DNA區域同源的核苷酸序列的DNA”也可以被稱為“載體臂”或“臂”。特別地，“與抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA的5’側的DNA同源的DNA”也可以稱為“上游臂”、“5’側臂”或“左臂”。此外，“與抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA的3’側的DNA同源的DNA”也可以稱為“下游臂”、“3’側臂”或“右臂”。一般認為較長的臂是優選的；但是，臂僅需要具有基因打靶通常使用的長度(A. Joyner, 〃Gene Targeting" , IRL Press Practical Approach series, OxfordUniv. Press)。例如而非限制，右臂和左臂的長度可以是Ikb或更長，總長度可以是3kb或更長。同時，載體的全長優選是12kbp或更短，但并不限于此(J.-M. Buesrstedde和S. Takeda 編著，Subcellular Biochemistry 第 40 卷Reviews and Protocols in DT40Research, Springer(2006))。在本發明中，“與抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA的5’側的DNA同源的DNA”包括具有位于抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA的5’側的啟動子的DNA和不具有所述啟動子的DNA。當“與抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA的5’側的DNA同源的DNA”不具有位于抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA的5’側的啟動子時，所述DNA也可以稱為“包含與位于抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA的5’側的啟動子區的5’側區域同源的核苷酸序列的DNA”。在本發明中，“與抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA的3 ’側的DNA同源的DNA”包括具有抗體生產細胞的抗體恒定區編碼DNA的DNA和不具有所述編碼DNA的DNA。在本發明中，臂或載體臂的核苷酸序列不必與抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA周圍的DNA區域完全同源(相同)，只需要具有允許同源重組的一定程度的相似性。可以根據抗體生產細胞的類型，恰當地選擇在抗體生產細胞中發揮功能的功能性啟動子DNA。在抗體生產細胞中發揮功能的啟動子DNA包括但不限于雞β肌動蛋白啟動子和人延伸因子 la (EF-Ia)啟動子(Yang, S. Y.等人，J. Exp. Med. 203:2919-2928 (2006)) 病毒啟動子DNA的實例包括但不限于巨細胞病毒(CMV)啟動子(Kanayama，N.等人，NucleicAcids Res. 34, elO (2006))和勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子(Arakawa, H.等人，NucleicAcids Res. 36，el(2008))。在抗體生產細胞中發揮功能的啟動子DNA包括源自抗體生產細胞的啟動子和位于編碼抗體可變區的DNA的5’側的抗體基因啟動子DNA。在本文中，“編碼期望的氨基酸序列的DNA”也可以稱為“編碼人工氨基酸序列的DNA”或“編碼目的氨基酸序列的DNA”。、
期望的氨基酸序列包括但不限于抗體可變區的氨基酸序列(抗體重鏈可變區和抗體輕鏈可變區)、酶的氨基酸序列、受體的氨基酸序列和人工肽序列。當編碼期望的氨基酸序列的DNA不含信號肽編碼DNA時，可以將編碼信號肽的DNA插入到基因打靶載體中編碼期望的氨基酸序列的DNA的5’側，以便增強由編碼期望的氨基酸序列的DNA編碼的多肽的細胞表面表達或分泌。信號肽編碼DNA可以插入到這樣的位點，所述位點使得在從信號肽編碼DNA和編碼期望的氨基酸序列的DNA轉錄的mRNA中兩個肽編碼區合框相連。例如，可以在信號肽編碼DNA和編碼期望的氨基酸序列的DNA之間插入內含子。或者，如下所述，上述⑶的DNA可以插入到信號肽編碼DNA和編碼期望的氨基酸序列的DNA之間。對信號肽編碼DNA沒有限制，只要它具有在抗體生產細胞的表面上表達多肽或從抗體生產細胞分泌多肽的能力。信號肽編碼DNA包括源自抗體生產細胞的和編碼位于抗體可變區的5’側的信號肽的DNA。此類信號肽包括但不限于雞抗體重鏈或輕鏈的信號肽、哺乳動物(例如人和小鼠)的抗體重鏈或輕鏈的信號肽，和鳥類或哺乳動物的分泌到細胞外的細胞因子或生長因子的信號肽。 編碼期望的氨基酸序列的DNA可以來自任何物種。DNA可以源自與抗體生產細胞來源相同的物種，或者源自不同的物種。此外，DNA可以是編碼人為修飾的多肽，例如嵌合多肽的DNA。“包含期望的氨基酸序列的多肽”包括但不限于包含期望的氨基酸序列與抗體恒定區的氨基酸序列的多肽。“包含期望的氨基酸序列的多肽”包括但不限于包含下列氨基酸序列的多肽(嵌合多肽)抗體可變區(抗體重鏈可變區或抗體輕鏈可變區)的氨基酸序列和抗體恒定區(抗體重鏈恒定區或抗體輕鏈恒定區)的氨基酸序列；酶的氨基酸序列和抗體恒定區的氨基酸序列(抗體重鏈恒定區或抗體輕鏈恒定區)；或受體的氨基酸序列和抗體恒定區的氨基酸序列(抗體重鏈恒定區和抗體輕鏈恒定區)。在本文中，“抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生的DNA”指通過在存在所述DNA的條件下阻斷任何下列步驟，來抑制包含期望的氨基酸序列的多肽的正常產生的DNA 編碼包含期望的氨基酸序列的多肽的DNA的轉錄；含有編碼包含期望的氨基酸序列的多肽的區域的mRNA的剪接；mRNA的翻譯；和包含期望的氨基酸序列的多肽的加工(例如，折疊)。上述(3)的DNA也可以稱為“抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生并位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA，所述DNA包括在細胞內執行功能的啟動子DNA和標記基因，并能夠通過位點特異性重組酶從所述DNA構建體中被去除”。本發明的標記基因優選在其3’末端含有多聚A(腺苷酸)附加序列。多聚A附加序列終止標記基因的轉錄。本領域技術人員可以想到各種啟動子，并選擇恰當的啟動子。此類啟動子包括但不限于例如肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、巨細胞病毒啟動子、CAG啟動子和EFla啟動子。選擇標記基因包括但不限于抗生素抗性基因，例如新霉素磷酸轉移酶基因、滅瘟素S脫氨酶基因、嘌呤霉素N乙酰轉移酶基因、組氨醇脫氫酶基因、潮霉素B磷酸轉移酶基因和黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因；突光蛋白基因，例如GFP和DsRed ;以及生色酶的基因，例如β -半乳糖苷酶(IacZ)和β -內酰胺酶。優選的將啟動子和標記基因可操作地連接在一起，使得標記基因可以通過啟動子表達。在本文中，“可操作地連接”意指標記基因與在抗體生產細胞中執行功能的啟動子DNA連接，使得轉錄因子與啟動子DNA的結合誘導標記基因的表達。因而，當標記基因與另 一個基因連接并形成與它的基因產物的融合蛋白時，由于轉錄因子與標記基因的啟動子區域結合，融合蛋白的表達被誘導，這也包括在“可操作地連接”的含義中。位點特異性重組酶和位點特異性重組酶識別序列的組合包括Cre重組酶和IoxP的組合，以及FLP重組酶和FRT的組合，但不限于此。在本發明中，位點特異性的重組酶識別序列可以是突變序列，只要它被位點特異性的重組酶識別。對于IoxP序列，參見下列文件Hoess 等人，Pl site-specific recombination:nucleotide sequence of therecombining sites.Proc Natl Acad Sci USA(1982)79 卷(11)第 3398-402 頁Hoess和 Abremski, Interaction of the bacteriophage Pl recombinase Crewith the recombining site IoxP. Proc Natl Acad Sci USA (1984)第 81 卷⑷第 1026-9頁對于FLP重組酶的序列，參見下列文件Hartley 和 Donelson, Nucleotide sequence of the yeast plasmid.Nature (1980)第 286 卷(5776)第 860-865 頁對于FRT序列，參見下列文件Hartley 和 Donelson, Nucleotide sequence of the yeast plasmid.Nature (1980)第 286 卷(5776)第 860-865 頁Andrews 等人，The FLP recombinase of the 2 micron circle DNA ofyeast: interaction with its target sequences. Cell(1985)第 40 卷(4)第 795-803 頁Gronostajski 和 Sadowski, Determination of DNA sequences essential forFLP-mediated recombination by a novel method. J Biol Chem(1985)第 260 卷(22)第12320-7 頁Senecoff 等人，The FLP recombinase of the yeast 2-micronplasmid:characterization of its recombination site. Proc Natl Acad Sci USA (1985)第 82 卷(21)第 7270-4 頁。對本發明的基因打靶載體沒有限制，只要它們允許在上述的DNA構建體與抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間的同源重組。本發明的基因打靶載體包括例如下文⑷和⑶的載體。⑷用于將DNA構建體與抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域同源重組的基因打靶載體，其中該載體包含所述DNA構建體，該DNA構建體從載體DNA鏈的5’端至3’端包含下文(I)至(3)的DNA (I)在抗體生產細胞中執行功能的啟動子DNA ；(2)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的DNA ;和(3)編碼期望的氨基酸序列的DNA。
(A)的載體可在編碼期望的氨基酸序列的DNA的5’側具有編碼信號肽的DNA。在此情況下，載體可以在⑵的DNA和(3)的DNA之間具有信號肽編碼DNA。或者，載體可以在(I)的DNA和⑵的DNA之間具有信號肽編碼DNA。但是，載體不限于該實例。(B)用于將DNA構建體與抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域同源重組的基因打靶載體，其中該載體包含所述DNA構建體，該DNA構建體包含，從載體DNA鏈的5’端至3’端，下文⑴至(3)的DNA:(I)在抗體生產細胞中執行功能的啟動子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的DNA。(B)的載體還可在編碼期望的氨基酸序列的DNA的5’側具有編碼信號肽的DNA。在此情況下，載體可以在(I)的DNA和(2)的DNA之間具有信號肽編碼DNA。但是，載體不限于該實例。(A)的載體還可以描述為用于將DNA構建體與抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域同源重組的基因打靶載體，其中載體包含DNA構建體，該構建體包含，從載體DNA鏈的5’至3’端，下述⑴至(iii)的DNA:(i)包含與抗體生產細胞基因組DNA中的編碼抗體可變區的DNA的5’側區域同源的 DNA 的 DNA ；(ii)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(iii)包含與抗體生產細胞基因組DNA中的編碼抗體可變區的DNA的3’側區域同源的DNA的DNA，其中⑴的DNA從載體DNA鏈的5’至3’端包含下列(α )和(β ):(α)在抗體生廣細胞中執彳丁功能的啟動子DNA ;和( β )抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的DNA。上述基因打靶載體可在(ii)的DNA的5’側(更上游)具有編碼信號肽的DNA。更具體而言，基因打靶載體可在U)的DNA和(β)的DNA之間，或者在(β)的DNA和(ii)的DNA之間具有信號肽編碼DNA。但是，載體不限于這些實例。(iii)的DNA可具有編碼抗體恒定區的DNA。(i)的同源DNA可以與抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA的5’側的DNA重組。當基因打靶載體的靶標是重鏈可變區時，5’側的DNA包括但不限于，例如這樣的DNA片段其起自雞抗體重鏈基因座中編碼抗體重鏈可變區的信號肽的DNA的5’末端核苷酸，并延伸直到位于起始點上游(5’側)DNA區域的第一個BamHI，或第一個XhoI，或第一個XbaI位點。或者，當基因打靶載體的靶是輕鏈可變區時，5’側的DNA包括但不限于，例如這樣的DNA片段其起自雞抗體輕鏈基因座中編碼抗體輕鏈可變區的信號肽的DNA的5’末端核苷酸，并延伸直到位于起始點上游(5，側)DNA區域的第一個SacI或第一個BamHI位點。當使用編碼抗體可變區的信號肽的DNA作為起點制備5’側的DNA時，抗體基因啟動子已包括在5’側的DNA內。在此情況下,不必向載體中插入啟動子DNA。此外，(iii)的同源DNA可以與抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA的3’側的DNA重組。當基因打靶載體的靶標是重鏈可變區時，3’側的DNA包括但不限于，例如這樣的DNA片段其起自雞重鏈抗體基因座中編碼抗體重鏈可變區的DNA的3’末端核苷酸，并延 伸直到位于起始點下游(3’側)DNA區域的第一個XhoI或第一個ClaI位點。或者，當基因打靶載體的靶標是輕鏈可變區時，3’側的DNA包括但不限于，例如這樣的DNA片段其起自雞輕鏈抗體基因座中編碼抗體輕鏈可變區的DNA的3’末端核苷酸，并延伸直到位于起始點下游(3’側)DNA區域的第一個ClaI或第一個EcoRI位點。上述(A)的基因打靶載體還可以描述為用于將DNA構建體和抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域同源重組的基因打靶載體，所述載體包含DNA構建體，該DNA構建體從載體DNA鏈的5’至3’端包含下述⑴至(V)的DNA (i)與抗體生產細胞基因組DNA中的編碼抗體可變區的DNA的5’側區域同源的DNA ；(ii)在抗體生產細胞中執行功能的啟動子DNA ；(iii)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的DNA ；(iv)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(V)與抗體生產細胞基因組DNA中的編碼抗體可變區的DNA的3’側區域同源的DNA。上述基因打靶載體可在(iv)的DNA的5’側具有編碼信號肽的DNA。(V)的DNA可具有編碼抗體恒定區的DNA。本發明的靶向重鏈可變區的基因打靶載體可以基于下面列舉的DNA片段來設計，其中每個片段都含有雞抗體重鏈基因的基因座周圍的區域。但是，基因打靶載體不限于這些實例。BamHI-XhoI 片段BamHI-ClaI 片段XhoI-XhoI 片段XhoI-ClaI 片段XbaI-XhoI 片段XbaI-ClaI 片段本發明的靶向輕鏈可變區的基因打靶載體可以基于下面列舉的DNA片段設計，其中每個片段都含有雞抗體輕鏈基因的基因座周圍的區域。但是，基因打靶載體不限于這些實例。SacI-ClaI 片段BamHI-EcoRI 片段SacI-ClaI 片段BamHI-EcoRI 片段在本發明中，限制性位點不限于天然存在于雞抗體基因的基因座中的位點。可以
使用添加有期望的限制性位點的引物，通過PCR擴增獲得含有限制性位點的DNA片段。本發明的限制性位點還包括因此產生的位點。本發明的靶向重鏈可變區的基因打靶載體也可以描述為包含這樣的DNA構建體的基因打靶載體，所述DNA構建體包含包含從抗體可變區的編碼區的5’側的BamHI位點至緊鄰于雞重鏈抗體基因座中的起始密碼子之前的核苷酸的核苷酸序列(SEQ ID NO:44)的DNA片段；在抗體可變區的編碼區的3’側包含SacII-XhoI片段(SEQ ID NO:45)的DNA片段；和包含上述(ii)的DNA的DNA片段。包含SEQ ID NO:44的DNA片段包括但不限于包含更多的5’側區域的DNA片段。包含SEQ ID NO:45的DNA片段包括但不限于包含更多的3’側區域的DNA片段。本發明的靶向輕鏈可變區的基因打靶載體也可以描述為包含這樣的DNA構建體的基因打靶載體，所述DNA構建體包含包含從SacI位點至緊鄰于雞輕鏈抗體基因座中的起始密碼子之前的核苷酸核苷酸序列(SEQ ID NO:46)的DNA片段；包含SEQ ID NO:47的核苷酸序列的DNA片段；和包含上述(ii)的DNA的DNA片段。包含SEQ ID NO:46的DNA片段包括但不限于包含更多的5’側區域的DNA片段。包含SEQ ID NO:47的DNA片段包括但不限于包含更多的3’側區域的DNA片段。本發明的基因打靶載體可具有所有的上述特征。上述(A)的本發明的基因打靶載體可以描述為靶向重鏈可變區的基因打靶載體，具體而言是用于將DNA構建體和抗體生產細胞的包含編碼抗體重鏈可變區的DNA的區域同源重組的基因打靶載體，其中載體包含DNA構建體，該DNA構建體包含，從載體DNA鏈的5’至3’端，下述⑴至(iii)的DNA (i)包含與抗體生產細胞基因組DNA中的編碼抗體重鏈可變區的DNA的5’側同源的 DNA 的 DNA ；(ii)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(iii)包含與抗體生產細胞基因組DNA中的編碼抗體重鏈可變區的DNA的3’側同源的DNA的DNA，其中⑴的DNA從載體DNA鏈的5’至3’端包括下列(α )和(β ):( α )在抗體生產細胞中執行功能的啟動子DNA ;和( β )抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的DNA ；上述(A)的本發明的基因打靶載體可以描述為靶向輕鏈可變區的基因打靶載體，具體而言是用于將DNA構建體和抗體生產細胞的包含編碼抗體輕鏈可變區的DNA的區域的同源重組基因打靶載體，其中載體包含DNA構建體，該構建體從載體DNA鏈的5’至3’端包含下述⑴至(iii)的DNA (i)包含與抗體生產細胞基因組DNA中的編碼抗體輕鏈可變區的DNA的5’側同源的 DNA 的 DNA ；(ii)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(iii)包含與抗體生產細胞基因組DNA中的編碼抗體輕鏈可變區的DNA的3’側同源的DNA的DNA，其中⑴的DNA從載體DNA鏈的5’至3’端包括下列(α )和(β ):(α)在抗體生廣細胞中執彳丁功能的啟動子DNA ;和
( β )抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的DNA。上述靶向重鏈或輕鏈可變區的基因打靶載體可在(ii)的DNA的5’側具有編碼信號肽的DNA。更具體而言，載體可在(α)的DNA和(β)的DNA之間，或者可以在(β)的DNA與(ii)的DNA之間具有信號肽編碼DNA。但是，載體不限于這些實例。(iii)的DNA可具有編碼抗體恒定區的DNA。上述(B)的基因打靶載體也可以稱為用于將DNA構建體和抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域同源重組的基因打靶載體，其中載體包含DNA構建體，所述DNA構建體從載體DNA鏈的5’至3’端包含下文⑴至(iii)的DNA (i)包含與抗體生產細胞基因組DNA中的編碼抗體可變區的DNA的5’側同源的DNA 的 DNA ；(ii)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(iii)包含與抗體生產細胞基因組DNA中的編碼抗體可變區的DNA的3’側同源的DNA 的 DNA，其中⑴的DNA包含(α )在抗體生產細胞中執行功能的啟動子DNA ;和(iii)的DNA包含(β )抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的DNA ;和 ( α )的DNA與(ii)的DNA可操作地連接。⑴和(iii)的同源DNA如上所述。上述基因打靶載體可在(ii)的DNA的5’側具有編碼信號肽的DNA。更具體而言，基因打靶載體可在(α)的DNA和(ii)的DNA之間具有信號肽編碼DNA。但是，載體不限于這些實例。(iii)的DNA可具有編碼抗體恒定區的DNA。上述(B)的基因打靶載體也可以稱為用于將DNA構建體與抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域同源重組的基因打靶載體，其中載體包含DNA構建體，所述DNA構建體從載體DNA鏈的5’至3’端包含下文⑴至(V)的DNA (i)與抗體生產細胞基因組DNA中的編碼抗體可變區的DNA的5’側同源的DNA ；(ii)在抗體生產細胞中執行功能的啟動子DNA ；(iii)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和
(iv)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的DNA ;和(V)與抗體生產細胞基因組DNA中的編碼抗體可變區的DNA的3’側同源的DNA。上述基因打靶載體可在(iii)的DNA的5’側具有編碼信號肽的DNA。(V)的DNA可具有編碼抗體恒定區的DNA。在上述⑶中描述的基因打靶載體也可以稱為靶向重鏈可變區的基因打靶載體，具體而言，稱為用于將DNA構建體與抗體生產細胞的包含編碼抗體重鏈可變區的DNA的區域同源重組的基因打靶載體，其中載體包含DNA構建體，所述DNA構建體從載體DNA鏈的5 ’至3’端包含下文⑴至(iii)的DNA ⑴包含與抗體生產細胞基因組DNA中的編碼抗體重鏈可變區的DNA的5’側同源的 DNA 的 DNA ；(ii)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(iii)包含與抗體生產細胞基因組DNA中的編碼抗體重鏈可變區的DNA的3’側同源的DNA的DNA。其中，⑴的DNA包含(α )在抗體生產細胞中執行功能的啟動子DNA ;和(iii)的DNA包含(β )抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的DNA ;和( α )的DNA與(ii)的DNA可操作地連接。在上述(B)中描述的基因打靶載體也可以稱為靶向輕鏈可變區的基因打靶載體，具體而言，稱為用于將DNA構建體和抗體生產細胞的包含編碼抗體輕鏈可變區的DNA的區域同源重組的基因打靶載體，其中載體包含DNA構建體，所述DNA構建體從載體DNA鏈的5 ’至3’端包含下文⑴至(iii)的DNA (i)包含與抗體生產細胞基因組DNA中的編碼抗體輕鏈可變區的DNA的5’側同源的 DNA 的 DNA ；(ii)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(iii)包含與抗體生產細胞基因組DNA中的編碼抗體輕鏈可變區的DNA的3’側同源的DNA的DNA。其中，⑴的DNA包含(α )在抗體生產細胞中執行功能的啟動子DNA ;和(iii)的DNA包括(β )抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的DNA ;和( α )的DNA與(ii)的DNA可操作地連接。上述靶向重鏈或輕鏈可變區的基因打靶載體可在(ii)的DNA的5’側具有信號肽。更具體而言，所述載體可在U)的DNA和(ii)的DNA之間具有編碼信號肽的DNA。但是，所述載體不限于該實例。(iii)的DNA可具有編碼抗體恒定區的DNA。
、
上述(B)的載體可額外地在編碼期望的氨基酸序列的DNA的3’側包含剪接供體共有序列。此類剪接供體共有序列包括但不限于“AG GTRAGT”(R _旨A或G :下劃線部分是內含子序列)。當剪接供體共有序列與編碼期望的氨基酸序列的DNA連接時，需要在剪接供體共有序列之前恰當地添加或刪除核苷酸，以使得編碼期望的氨基酸序列的區域與編碼抗體恒定區的區域在剪接后的mRNA中合框連接。在上述(B)的載體中，編碼期望的氨基酸序列的DNA((ii)的DNA)優選盡可能地靠近抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生、且能夠從DNA構建體中被去除的DNA (( β )的DNA)。此外，當(β )的DNA包括標記基因時，優選在標記基因的3’側具有多聚A附加序列。本發明提供了上述基因打靶載體。本發明還提供了在上述打靶載體中具有克隆位點代替編碼期望的氨基酸序列的DNA的打靶載體。更具體而言，本發明提供了用于將DNA構建體與抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域同源重組的基因打靶載體，其 中該載體包含這樣的DNA構建體，所述DNA構建體包含(I)在所述細胞中執行功能的啟動子DNA ；(2)包含克隆位點的DNA ;和(3)抑制由插入到⑵的DNA中的DNA編碼的、包含期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從DNA構建體中被去除的DNA。(3)的DNA還可以被描述為能夠通過位點特異性重組酶從所述DNA構建體中被去除，并抑制由插入到(2)的DNA中的DNA編碼的、包含期望的氨基酸序列的多肽的產生的DNA,該DNA位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間，并包含在細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因。標記基因可以在其3’側具有多聚A序列。編碼期望的氨基酸序列的DNA可以插入到本發明的基因打靶載體的克隆位點中。此類克隆位點包括但不限于多克隆位點。下文顯示了上述⑶的載體中編碼期望的氨基酸序列的DNA被克隆位點取代的載體實例。但是，本發明的載體不限于這些實例。SEQ ID Ν0:10(圖21)是本發明的靶向重鏈可變區的基因打靶載體的核苷酸序列的實例。具體而言，本發明提供了包括這樣的DNA構建體的打靶載體，所述DNA構建體包含SEQ ID NO: 10 (特別是第1-7277位的核苷酸序列)。在圖21 (SEQ ID NO: 10)中，第1-1395位的核苷酸對應于與位于抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA的5’側的DNA同源的DNA序列(到編碼抗體可變區的DNA的起始密碼子緊鄰前方為止的含有啟動子的序列)；第1396-1441位的核苷酸對應于編碼抗體可變區的信號肽的DNA ；第1442-1624位的核苷酸對應于內含子DNA ；第1625-1635位的核苷酸對應于編碼抗體可變區的信號肽的DNA ；第1671-1704 位的核苷酸對應于 loxP_RE 的 DNA 序列(TACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT(SEQ ID NO :37))；第1711-2697位的核苷酸對應于包含標記物的多聚A附加序列的DNA ；第2720-3142位的核苷酸對應于標記基因的DNA序列；第3186-4527位的核苷酸對應于標記基因的啟動子序列；第4555-4588 位的核苷酸對應于 loxP_LE 的 DNA 序列(ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTA(SEQ ID NO :38))；
以及第4598-7277位的核苷酸對應于與位于抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA的3’側的DNA同源的DNA序列；第1442-1624位的核苷酸(內含子DNA)通過剪接被去除，由此第1397-1441位的核苷酸與第1625-1635的核苷酸相連而形成信號肽序列。作為實例，上述打靶載體使用突變的IoxP序列(Albert H.，等人，PlantJ. 7:649(1995) ；Araki K·,等人，Nucleic Acids Res. 25:868 (1997))。本發明使用用于DT40的標記基因(Arakawa H. , BMC Biotechnol. 1:7 (2001))。用于DT40的標記基因描述如上。在上述載體中，編碼期望的氨基酸序列的DNA被插入編碼信號肽的DNA和loxP_RE的DNA序列之間。此外，本發明的靶向重鏈可變區的基因打靶載體的核苷酸序列的一個實例顯示在 SEQ ID N0:13(圖22)中。具體而言，本發明提供了包含這樣的DNA構建體的打靶載體，所述DNA構建體包含SEQ ID NO: 13 (特別是第5-7266位的核苷酸序列)。在圖22(SEQ ID NO: 13)中，第5-1399位的核苷酸對應于與位于抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA的5’側的DNA同源的DNA序列(到編碼抗體可變區的DNA的起始密碼子緊鄰前方為止的含有啟動子的序列)；第1400-1445位的核苷酸對應于編碼抗體可變區的信號肽的DNA ；第1446-1628位的核苷酸對應于內含子DNA ；第1629-1639位的核苷酸對應于編碼抗體可變區的信號肽的DNA ；第1660-1693 位的核苷酸對應于 loxP_RE 的 DNA 序列(TACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT(SEQ ID NO :37))；第1700-2686位的核苷酸對應于包含標記基因的多聚A附加序列的DNA ；第2709-3131位的核苷酸對應于標記基因序列的DNA序列；第3175-4516位的核苷酸對應于標記基因的啟動子序列；第4544-4577 位的核苷酸對應于 loxP_LE 的 DNA 序列(ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTA(SEQ ID NO :38))以及第4587-7266位的核苷酸對應于與位于抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA的3’側的DNA同源的DNA序列。第1446-1628位的核苷酸(內含子DNA)通過剪接被去除，因而第1400-1445位的核苷酸與第1629-1639位的核苷酸相連形成信號肽序列。在上述載體中，編碼期望的氨基酸序列的DNA插入編碼信號肽的DNA和loxP_RE的DNA序列之間。此外，本發明的靶向輕鏈可變區的基因打靶載體的核苷酸序列的實例顯示在SEQID N0:18(圖23)中。具體而言，本發明提供了包含這樣的DNA構建體的打靶載體，所述DNA構建體包含SEQ ID NO: 18 (特別是第1-6870位的核苷酸序列)。在圖23 (SEQ ID NO: 18)中，第1-1868位的核苷酸對應于與位于抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA的5’側的DNA同源的DNA序列(到編碼抗體可變區的DNA的起始密碼子緊鄰前方為止的含有啟動子的序列)；第1869-1914位的核苷酸對應于編碼抗體可變區的信號肽的DNA ；第1915-2039位的核苷酸對應于內含子DNA ；第2040-2056位的核苷酸對應于編碼抗體可變區的信號肽的DNA ；第2085-2118位的核苷酸對應于loxP_LE的DNA 第2146-3487位的核苷酸對應于標記基因的啟動子序列；第3531-3953位的核苷酸對應于標記基因的DNA ；第3976-4962位的核苷酸對應于包含標記基因的多聚A附加序列的DNA ； 第4969-5002位的核苷酸對應于loxP_RE的DNA序列；以及第5011-6870位的核苷酸對應于與位于抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA的3’側的DNA同源的DNA序列。第1915-2039位的核苷酸(內含子DNA)通過剪接被去除，因而第1869-1914位的核苷酸與第2040-2056位的核苷酸連接形成信號肽序列。在上述載體中，編碼期望的氨基酸序列的DNA被插入編碼信號肽的DNA和loxP_LE的DNA序列之間。此外，本發明的靶向輕鏈可變區的基因打靶載體的核苷酸序列的一個實例顯示在SEQ ID N0:20(圖24)中。具體而言，本發明提供了包含這樣的DNA構建體的打靶載體，所述DNA構建體包含SEQ ID NO: 20 (特別是第1-6861位的核苷酸序列)。在圖24(SEQ ID NO:20)中，第1-1868位的核苷酸對應于與位于抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA的5’側的DNA同源的DNA序列(到編碼抗體可變區的DNA的起始密碼子緊鄰前方為止的含有啟動子的序列)；第1869-1914位的核苷酸對應于編碼抗體可變區的信號肽的DNA ；第1915-2039位的核苷酸對應于內含子DNA ；第2040-2056位的核苷酸對應于編碼抗體可變區的信號肽的DNA ；第2076-2109位的核苷酸對應于loxP_LE的DNA序列第2137-3478位的核苷酸對應于標記基因的啟動子序列；第3522-3944位的核苷酸對應于標記基因的DNA序列；第3967-4953位的核苷酸對應于標記基因的多聚A附加序列的DNA序列；第4960-4993位的核苷酸對應于loxP_RE的DNA序列以及第5002-6861位的核苷酸對應于與位于抗體生產細胞的編碼抗體可變區的DNA的3’側的DNA同源的DNA序列。第1915-2039位的核苷酸(內含子DNA)通過剪接被去除，因而第1869-1914位的核苷酸與第2040-2056位的核苷酸相連形成信號肽序列。在上述載體中，編碼期望的氨基酸序列的DNA被插入編碼信號肽的DNA和loxP_LE的DNA序列之間。對用于將本發明的打靶載體導入細胞中的方法沒有任何特別的限制。本領域技術人員可以根據所選擇的抗體生產細胞選擇恰當的基因轉移方法。當抗體生產細胞是例如哺乳動物細胞時，方法的實例包括但不限于例如磷酸鈣沉淀方法、核微注射、原生質體融合、DEAE-葡聚糖方法、細胞融合、Lipofectamine (GIBCO BRL)方法、脂質體轉染方法、使用FuGENE6 試劑(Boehringer-Mannheim)的方法，和電穿孔。本發明的抗體生產細胞可以是任何細胞類型和源自任何動物物種，只要其可以產生抗體。可以使用例如源自人、小鼠、綿羊、大鼠、兔和雞，及其細胞系和突變細胞系的抗體生產細胞。抗體生產細胞還包括但不限于B細胞、人伯基特氏淋巴瘤細胞系(Ramos、BL2等)、小鼠前B細胞系18-81，和小鼠未成熟B細胞系WEHI-231。抗體生產細胞優選包括源自雞的B細胞，例如源自雞抗體生產細胞的DT40和DT40-SW細胞系。DT40細胞系是源自B淋巴瘤的細胞系，其特征是2號染色體三體性(Bab a, T. ff. , Giroir, B. P.和Humphries, E.H. ,Virology 144:139-151,1985)。此外，可以使用野生型DT40細胞系或由本發明人建立的DT40-SW細胞系，后者的抗體突變特征可以通過可逆地開啟和關閉控制突變特征的AID基因的表達來調控(開和關)(細節描述在Kanayama, N. , Todo, K. , Reth, M. , Ohmori, H.Biochem. Biophys. Res. Commn. 327:70-75(2005)和 JP-A(Kokai)2006-109711 中)。本發明的抗體生產細胞還包括通過基因操作而被人為賦予抗體生產能力的細胞。此類具有人為賦予的抗體生產能力的細胞不必能夠生產完整的抗體分子。細胞可以具有產生包含抗原結合必需的抗體可變區的抗體片段的能力。細胞可以生產嵌合抗體、人源化抗體或能夠結合抗原的非天然分子，或所述分子的片段。 本發明的抗體生產細胞可具有下述特征。本發明還涉及選擇如下所述的細胞的方法，在所述細胞中DNA構建體和抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間已經發生了同源重組，其中所述DNA構建體包含(I)在所述細胞中執行功能的啟動子DNA ；(2)編碼的期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的DNA。可以通過上述方法實現同源重組。發生了重組的細胞可以例如使用標記基因表達作為指標來加以選擇。或者，可以利用抗體生產細胞中內源性抗體表達的缺失作為指標來選擇細胞。可選的，可以通過組合上述兩種指標來選擇細胞。但是，選擇方法不限于上述實例。在DNA構建體與抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間發生了同源重組的細胞變得不能產生內源性抗體。因此，可以使用細胞表面有無內源性抗體表達作為指標來選擇發生了同源重組的細胞。在本發明中，上述(3)的DNA的存在抑制了包含期望的氨基酸序列的多肽的產生。更具體而言，上述(3)的DNA的存在抑制了包含期望的氨基酸序列和抗體恒定區氨基酸序列的多肽的產生。出于該理由，即使當信號肽與包含期望的氨基酸序列的多肽連接以將多肽展示在細胞表面時，只要存在上述(3)的DNA，則包含多肽和抗體恒定區的多肽不會被展示在細胞表面。因此，可以以細胞表面上的抗體分子的有無作為指標，使用抗抗體恒定區的抗體進行檢測，來高效地選擇發生了同源重組的細胞。利用細胞表面上的抗體分子的有無作為指標的細胞選擇可以通過例如流式細胞儀、固定有抗體的磁珠(該抗體特異性結合抗體生產細胞所生產的抗體)等來實施。但是選擇方法不限于這些實例。
上述(3)的DNA優選包括藥物抗性基因作為標記基因來對細胞生長施加選擇壓力。此類藥物抗性基因包括但不限于，例如抗生素抗性基因，如新霉素磷酸轉移酶基因、滅瘟素S脫氨酶基因、嘌呤霉素N乙酰轉移酶基因、組氨醇脫氫酶基因、潮霉素B磷酸轉移酶基因和黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因。本發明還涉及用于制備產生多肽的抗體生產細胞的方法。可以通過使用本文描述的方法獲得重組細胞，并使用下文所述方法從細胞的基因組DNA中去除下述DNA來制備生產多肽的抗體生產細胞。必要時，所述方法可包括選擇已去除了下文所述DNA的細胞的步驟。可以使用多肽的產生作為指標選擇已去除了下文所述DNA的細胞。在本文中，將被去除的DNA是 抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的DNA ;更具體而言，抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA，該DNA包含在細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因，并能夠通過位點特異性重組酶從所述DNA構建體中被去除。本發明還涉及用于制備產生多肽的抗體生產細胞的方法，包括下述步驟(a)通過向抗體生產細胞中導入包含DNA構建體的打靶載體，允許DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域同源重組，所述DNA構建體包含(I)在所述細胞中執行功能的啟動子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA,該DNA包含在所述細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因，并且能夠通過位點特異性重組酶從該DNA構建體中被去除；(b)選擇其中在所述DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間已發生同源重組的細胞；和(C)通過使位點特異性重組酶在所述細胞的基因組中的位點特異性重組酶識別序列處反應而從步驟(b)中選擇的細胞的基因組DNA中去除位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA。在本發明的用于制備產生多肽的抗體生產細胞的方法中，位點特異性重組酶與抗體生產細胞的基因組中的位點特異性重組酶識別序列反應，由此，從抗體生產細胞的基因組DNA中去除位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA。位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA抑制編碼期望的氨基酸序列的DNA和編碼抗體恒定區的DNA兩者或其中一種的轉錄，從而抑制編碼包含期望的氨基酸序列的多肽的DNA的轉錄物的正常產生。或者，位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA抑制編碼包含期望的氨基酸序列的多肽的DNA的正常轉錄剪接，或者抑制所述翻譯產物的翻譯或加工(例如，折疊)，從而抑制編碼包含期望的氨基酸序列的多肽的DNA的轉錄物的正常產生。因此，通過去除位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA，恢復包含期望的氨基酸序列的多肽的產生。當包含期望的氨基酸序列的多肽連接于信號肽時，該多肽被展示在細胞表面或分泌到細胞夕卜。在此情況下，基于細胞表面展示的多肽的有無，評估位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA是否已經被去除。此外，可以通過細胞表面上展示多肽的存在來評估對編碼抗體可變區的區域的成功打靶。在本發明的用于制備產生多肽的抗體生產細胞的方法中，當信號肽被連接于多肽或初始存在于多肽中時，肽被展示在細胞表面或分泌到細胞外。在本發明的方法中，(i)可以將包含編碼抗體重鏈可變區氨基酸序列作為期望的氨基酸序列的DNA的基因打靶載體導入到抗體生產細胞中。此外，(ii)可以將包含編碼抗體輕鏈可變區氨基酸序列作為期望的氨基酸序列的DNA的基因打靶載體導入到抗體生產細胞中。在本發明的方法中，當將(i)的載體導入到抗體生產細胞中時，細胞生產這樣的抗體，所述抗體包含內源性抗體輕鏈以及具有內源性抗體重鏈恒定區和插入到載體中的外源性抗體重鏈可變區的氨基酸序列的抗體重鏈。
或者，當將(ii)的載體導入到抗體生產細胞中時,細胞生產這樣的抗體,所述抗體包含內源性抗體重鏈和具有內源性抗體輕鏈恒定區及插入到載體中的外源性抗體輕鏈可變區的氨基酸序列的抗體重鏈。或者，當將⑴和(ii)的載體導入到抗體生產細胞中時，細胞生產這樣的抗體，其包含抗體重鏈和抗體輕鏈，所述抗體重鏈具有內源性抗體重鏈恒定區的氨基酸序列和插入到(i)的載體中的外源性抗體重鏈可變區的氨基酸序列，所述抗體輕鏈具有內源性抗體輕鏈恒定區的氨基酸序列和插入到(ii)的載體中的外源性抗體輕鏈可變區的氨基酸序列。本發明涉及用于制備產生上述抗體的抗體生產細胞的方法。本發明還提供了用于制備產生導入了突變的多肽的抗體生產細胞的方法，包括下述步驟(a)通過向表達AID基因的抗體生產細胞中導入包含DNA構建體的打靶載體，允許DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域同源重組，所述DNA構建體包含(I)在所述細胞中執彳丁功能的啟動子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并且能夠從該DNA構建體中被去除的DNA ；(b)選擇其中在所述DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間已發生同源重組的細胞；和(c)從步驟(b)中選擇的細胞的基因組DNA中去除(3)的DNA。必要時，本發明的方法可進一步包括下述步驟(d)選擇已去除了(3)的DNA的細胞。已去除了(3)的DNA的細胞可以使用多肽的產生作為指標來選擇。本發明的打靶載體除上述(I)至(3)的DNA以外，還可包括與抗體基因座的DNA同源的DNA。此外，當編碼期望的氨基酸序列的DNA沒有信號肽編碼DNA時，可以在基因打靶載體中編碼期望的多肽的DNA的5’側插入編碼信號肽的DNA，以增強由該DNA編碼的多肽的細胞表面表達或分泌。
“導入了突變的多肽”也可以稱為“修飾的多肽”。突變包括取代、插入、缺失、添加，及其組合。在本發明的方法中，(i)可以將包含編碼抗體重鏈可變區的氨基酸序列作為期望的氨基酸序列的DNA的基因打靶載體導入到抗體生產細胞中。此外，(ii)可以將包含編碼抗體輕鏈可變區的氨基酸序列作為期望的氨基酸序列的DNA的基因打靶載體導入到抗體生產細胞中。在本發明的方法中，當(i)的載體被導入到抗體生產細胞中時，細胞產生這樣的抗體，所述抗體包含內源性抗體輕鏈，以及具有內源性抗體重鏈恒定區的氨基酸序列和插入到載體中的外源性抗體重鏈可變區的氨基酸序列的抗體重鏈。 或者，當(ii)的載體被導入到抗體生產細胞中時,細胞產生這樣的抗體,所述抗體包含內源性抗體重鏈，以及具有內源性抗體輕鏈恒定區的氨基酸序列和插入到載體中的外源性抗體輕鏈可變區的氨基酸序列的抗體輕鏈。或者，當⑴和(ii)的載體被導入到抗體生產細胞中時，細胞產生這樣的抗體，所述抗體包含抗體重鏈和抗體輕鏈，所述抗體重鏈具有內源性抗體重鏈恒定區的氨基酸序列和插入到(i)的載體中的外源性抗體重鏈可變區的氨基酸序列，所述抗體輕鏈具有內源性抗體輕鏈恒定區的氨基酸序列和插入到(ii)的載體中的外源性抗體輕鏈可變區的氨基酸序列。作為AID基因表達的結果，突變以一定的頻率不僅導入到編碼內源性抗體可變區氨基酸序列的DNA中，而且還導入到插入到(i)的載體中的編碼抗體重鏈可變區氨基酸序列的DNA中，以及插入到(ii)的載體中的編碼抗體輕鏈可變區氨基酸序列的DNA中。因此，細胞生成在期望的抗體可變區中導入了突變的抗體。本發明涉及用于制備產生導入了突變的抗體的抗體生產細胞的方法。在上述用于制備產生導入了突變的多肽的抗體生產細胞的方法中，步驟(a)中(3)的DNA還可以被描述為這樣的DNA :其抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間，包含在所述細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因，并且能夠通過位點特異性重組酶從該DNA構建體中被去除。此外，步驟(C)還可以被描述為通過使位點特異性重組酶在細胞的基因組中的位點特異性重組酶識別序列處反應而從步驟(b)中選擇的細胞的基因組DNA中去除位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA。在本發明中，表達AID基因的細胞包括具有內源性AID基因并可以表達該基因的細胞。更具體而言，此類細胞包括雞B細胞系DT40、人伯基特氏淋巴瘤細胞系(Ramos、BL2等)、小鼠前B細胞系18-81，和小鼠未成熟B細胞系WEHI-231，但不限于此。當細胞表達內源性AID基因時，通過重組向抗體可變區基因座中插入的編碼期望的氨基酸序列的DNA中導入突變。本發明還提供了用于制備產生導入了突變的多肽的抗體生產細胞的方法，包括下述步驟(a)通過向抗體生產細胞中導入包含DNA構建體的打靶載體，允許DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域同源重組，所述DNA構建體包含(I)在所述細胞中執行功能的啟動子DNA ；
(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并且能夠從該DNA構建體中被去除的DNA，其中，在抗體生產細胞中，AID基因表達可以人為地開啟和關閉；(b)選擇其中在所述DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間已發生同源重組的細胞；(c)從步驟(b)中選擇的細胞的基因組DNA中去除(3)的DNA ；(d)開啟和關閉AID基因表達；和(e)選擇表達AID基因的細胞。 在上述用于制備產生導入了突變的多肽的抗體生產細胞的方法中，步驟(d)還可以被描述為選擇細胞表面不展示內源性抗體的細胞的步驟，選擇表達標記基因的細胞的步驟，或者選擇表達標記基因并在細胞表面不展示內源性抗體的細胞的步驟。本發明還涉及用于制備產生導入了突變的多肽的抗體生產細胞的方法，包括下述步驟(a)通過向抗體生產細胞中導入包含DNA構建體的打靶載體，允許DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域同源重組，所述DNA構建體包含(I)在所述細胞中執行功能的啟動子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA,該DNA包含在所述細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因，并且能夠通過位點特異性重組酶從該DNA構建體中被去除；其中抗體生產細胞中的內源性AID基因被功能性破壞，且抗體生產細胞包含這樣的DNA構建體，所述DNA構建體包含在所述細胞中執打功能的啟動子DNA ;和位于兩個按相反方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間，并且包含外源性AID基因，而且能夠被位點特異性重組酶倒位的DNA ；(b)選擇其中在所述DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間已發生同源重組的細胞；(c)通過使位點特異性重組酶在所述細胞的基因組中的位點特異性重組酶識別序列處反應而從步驟(b)中選擇的細胞的基因組DNA中去除位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA ；(d)通過使位點特異性重組酶在步驟(b)選擇的細胞的基因組中的位點特異性重組酶識別序列處反應，使位于兩個按相反方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA倒位，以開啟和關閉AID基因表達；和(e)選擇表達AID基因的細胞。本發明還涉及用于制備產生導入了突變的多肽的抗體生產細胞的方法，包括下述步驟(a)通過向抗體生產細胞中導入包含DNA構建體的打靶載體，允許DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域同源重組，所述DNA構建體包含
(I)在所述細胞中執行功能的啟動子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA,該DNA包含在所述細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因，并且能夠從該DNA構建體中被去除；其中抗體生產細胞中的內源性AID基因被功能性破壞，且抗體生產細胞包含DNA構建體，其包含在所述細胞中執行功能的啟動子DNA ;和位于兩個按相反方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間、并能夠被位點同一 性重組酶倒位、而且包含外源性AID基因的DNA ;和包含在細胞中執行功能的啟動子DNA和編碼位點特異性重組酶的DNA的DNA構建體，其中在抗體生產細胞中，位點特異性重組酶在存在胞外刺激的條件下被活化，而在缺少胞外刺激的條件下不活化；(b)選擇其中在所述DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間已發生同源重組的細胞；(c)通過對細胞施加胞外刺激，活化位點特異性重組酶的活性，使位點特異性重組酶在細胞的基因組中的位點特異性重組酶識別序列處反應，從而從步驟(b)中選擇的細胞的基因組DNA中去除位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA ；(d)通過應用胞外刺激于細胞，活化位點特異性重組酶的活性，使位點特異性重組酶在步驟(b)選擇的細胞的基因組中的位點特異性重組酶識別序列反應，使位于兩個按相反方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA倒位，開啟和關閉AID基因表達；和(e)選擇表達AID基因的細胞。在本發明的用于制備產生導入了突變的多肽的抗體生產細胞的方法中，當信號肽連接于或初始存在于多肽中時，肽被展示在細胞表面或分泌到細胞外。在本發明的抗體生產細胞中，可以通過使位點特異性重組酶在細胞的基因組中的位點特異性重組酶識別序列處反應，調控AID基因表達的有無(可開啟和關閉AID基因表達)。因此，可以開始或終止向編碼期望的氨基酸序列的DNA中導入突變。當AID基因表達被開啟時，導入突變的功能活化，誘變在編碼期望的氨基酸序列的DNA中以持續的方式發生。另一方面，當AID基因表達被關閉時，DNA誘變保持被阻斷的狀態。S卩，一旦關閉表達，突變的DNA在關閉后不能進一步突變，因此突變得以維持。有時，在啟動AID基因表達后，突變導入到DNA中需要時間。如果在開始AID基因表達后不立即開始DNA誘變，則優選培養細胞一定時間(例如，一個月)。培養條件可以是“40°C，在存在5%C02的條件下”，但不限于此。通過開/關AID基因表達作為調控基因突變的機制，可以將突變導入到編碼期望的氨基酸序列的靶DNA中。或者，可以在已經導入某些數量的突變后，阻止DNA中發生進一步的突變事件。通過使位點特異性重組酶與抗體生產細胞反應，位于位點特異性重組酶識別序列之間的DNA被去除，由此恢復包含期望的氨基酸序列的多肽的產生。通過選擇已發生上述過程的細胞，可以獲得生產包含期望的氨基酸序列的多肽的抗體生產細胞。此外，通過選擇此類細胞，可以獲得包含期望的氨基酸序列的多肽和編碼所述多肽的DNA。必要時，可以將與位點特異性重組酶反應的細胞培養一定時間，直到細胞產生導入了突變的多肽為止。同時，本發明的表達AID基因的抗體生產細胞可以是這樣的細胞，其中的AID基因表達的有無可以人為調控。此類細胞包括但不限于通過將外源性AID基因導入到不具有內源性AID基因的抗體生產細胞中而制備的細胞，和通過將外源性AID基因導入到具有失活的AID基因的抗體生產細胞中而制備的細胞。可以通過向抗體生產細胞中導入包含AID基因與在細胞內有功能的啟動子可操作地連接的DNA的載體，獲得導入了外源性AID基因的細胞。本領域技術人員能夠想到各種啟動子并選擇合適的啟動子。此類啟動子包括但不限于，例如P -肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、巨細胞病毒啟動子、CAG啟動子和EFla啟動子。此外，本發明的抗體生產細胞包括這樣的細胞，其內源性AID基因被功能性破壞，并包含DNA構建體，所述DNA構建體包含 在所述細胞中執行功能的啟動子DNA ;和包含外源性AID基因，并位于兩個按相反方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA，其中位于位點特異性重組酶識別序列之間的DNA可以通過位點特異性重組酶倒位。在本文中，DNA構建體有時被稱為“外源性AID基因構建體”。“被功能性破壞的基因”也可以稱為“失活的基因”、“被刪除的基因”或“被敲除的基因”。基因失活包括基因表達的完全和部分的抑制。在本文中，基因失活意指基因表達被基因的核苷酸序列中的部分缺失、取代、插入、添加等抑制。“抑制基因表達”還包括表達基因但所廣生的蛋白質不具有正常功能的情況。在本發明中，因為兩個等位基因中僅一個是失活的，故可以實現AID基因的雜合敲除(JP 2006-109711 ;Biochem. Biophys. Res. Commun. 327:70(2005))。可以通過例如使用基因打靶載體進行同源重組，來實現AID基因敲除。同源重組是通過使染色體中的基因和外源DNA同源重組來修飾目的基因的方法。基因打靶載體可攜帶選擇標記作為插入物，來鑒別已發生同源重組的細胞。此類選擇標記基因包括但不限于抗生素抗性基因如新霉素磷酸轉移酶基因、滅瘟素S脫氨酶基因、嘌呤霉素N-乙酰轉移酶基因、組氨醇脫氫酶基因、潮霉素B磷酸轉移酶基因和黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因；熒光蛋白基因，例如GFP和DsRed;以及生色酶的基因，例如￠-半乳糖苷酶(IacZ)和P -內酰胺酶。可以將多聚A附接于標記基因的3’偵U。本發明的外源性AID基因構建體優選整合到抗體生產細胞的基因組中。對外源性AID基因構建體在基因組中的整合位置沒有特殊限定。但是，構建體可以整合到例如內源基因座的一個等位基因中的位置上(JP 2006-109711 ；Biochem. Biophys. Res.Commun. 327:70 (2005))。在此情況下，基于例如JP2006-109711的圖3中的信息，構建包括這樣的DNA構建體的AID基因打靶載體，所述DNA構建體包含這樣的DNA，其中在抗體生產細胞中執行功能的啟動子DNA與位于兩個按相反方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的外源AID基因(例如，SEQ ID NO: 50 ( 26)，GeneBank登錄號XM 416483)可操作地連接。將該載體導入到細胞中。結果在上述DNA構建體和抗體生產細胞的內源性AID基因之間發生同源重組。由此能夠獲得基因組中整合了外源性AID基因構建體的抗體生產細胞。啟動子包括但不限于上述啟動子。位于位點特異性重組酶識別序列之間的外源AID基因可以通過位點特異性重組酶的反應倒位。當外源AID基因與啟動子DNA按相同的方向放置時，因為啟動子DNA與外源AID基因是可操作地連接的，AID基因表達。同時，當外源AID基因相對于啟動子DNA按相反的方向放置時，AID基因不表達。如果內源性AID基因是無活性的，但細胞中存在外源性AID基因構建體，并使位點特異性重組酶與細胞反應，重組酶識別細胞中的位點特異性重組酶識別序列，并使位于兩個位點特異性重組酶識別序列之間的區域倒位(即，AID基因相對于啟動子的方向由相反的方向變為相同的方向，或由相同的方向變為相反的方向)。
因此，當AID基因相對于啟動子的方向由相反的方向變為相同的方向時，AID基因表達從關閉變為開啟。相反的，當AID基因相對于啟動子的方向由相同的方向變為相反的方向時，AID基因表達從開啟變為關閉。更具體而言，當細胞含有外源性AID基因構建體，且啟動子和AID基因在構建體中按相同的方向排列時，通過位點特異性重組酶與細胞的反應，將外源性AID基因的方向反轉為相對于啟動子相反的方向。這終止AID基因表達，因此停止向由已整合到抗體生產細胞基因組中的、編碼期望的氨基酸序列的DNA表達的多肽中導入突變。如果即使當位點特異性重組酶與細胞反應時，外源性AID基因構建體的外源性AID基因方向也沒有反轉，則由于AID基因與基因的啟動子按相同方向排列，啟動子將驅動AID基因構建體表達。根據本發明，可以通過在位點特異性重組酶與細胞的反應后，選擇啟動子與AID基因按相同方向排列的細胞，獲得產生包含期望的氨基酸序列的多肽的抗體生產細胞。本發明還允許產生包含期望的氨基酸序列的多肽和編碼所述多肽的DNA。或者，當細胞含有外源性AID基因構建體，且啟動子和AID基因在構建體中按相反的方向排列時，通過使位點特異性重組酶與細胞反應，將外源性AID基因的方向反轉為相對于啟動子相同的方向。這啟動AID基因表達，由此向由已整合到抗體生產細胞基因組中的、編碼期望的氨基酸序列的DNA表達的多肽中導入突變。如果即使當使位點特異性重組酶與細胞反應時，外源性AID基因構建體的外源性AID基因方向也沒有反轉，則AID基因仍然維持相對于基因啟動子相反的方向排列，啟動子介導的AID基因表達仍然終止。根據本發明，可以通過在位點特異性重組酶與細胞的反應后，選擇啟動子與AID基因按相同方向排列的細胞，獲得產生修飾的多肽的抗體生產細胞。本發明還允許產生編碼所述修飾的多肽的DNA。有利的是，設計含有兩個標記基因的外源性AID基因構建體，所述標記基因之一與AID基因方向相同，另一個以相對于AID基因相反的方向插入，因為這允許使用標記基因之一進行選擇，不論AID基因相對于啟動子放置的方向是相同還是相反的。此類構建體包括具有下列特征的外源性AID基因構建體
包含從5’至3’端含有下列序列的DNA序列的外源性AID基因構建體第一位點特異性重組酶識別序列，正向的第一標記基因，反向的第二標記基因，
反向的AID基因，和第二位點特異性重組酶識別序列。必須設計構建體使得任一標記基因僅當與啟動子排列方向相同時才表達。例如，當使用GFP基因作為上述構建體中的第二標記基因時，優選在第二標記基因和AID基因之間插入IRES序列，以獲得高水平的GFP基因表達。例如，可以使用從5’至3’端含有下列序列的DNA構建體正向的啟動子，第一位點特異性重組酶識別序列，正向的第一標記基因，正向的多聚A附加序列，反向的多聚A附加序列，反向的第二標記基因，反向的IRES序列，反向的AID基因，和相對于第一位點特異性重組酶識別序列方向相反的第二位點特異性重組酶識別序列。 在備選的實施方案中，可以使用導入了 DNA構建體的細胞，所述構建體中的AID基因位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間。在此情況下，通過位點特異性重組酶的作用切出AID基因，從而該細胞成為不可逆的AID缺陷。為了再次開啟細胞中的AID基因表達，需要將AID基因重新導入細胞內，可以使用該方法，因其能夠以100%的效率完全關閉AID基因。外源性AID基因構建體可具有多種類型的標記基因，以高效地選擇AID基因按特定方向排列的克隆。此類選擇標記基因包括但不限于抗生素抗性基因，例如新霉素磷酸轉移酶基因、滅瘟素S脫氨酶基因、嘌呤霉素N乙酰轉移酶基因、組氨醇脫氫酶基因、潮霉素B磷酸轉移酶基因和黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因；熒光蛋白基因，例如GFP和DsRed ;以及生色酶的基因，例如^ -半乳糖苷酶(IacZ)和P -內酰胺酶。當在抗體生產細胞中執行功能的啟動子和AID基因在外源性AID基因構建體中按相同方向排列，因而AID基因處于可表達的形式時，設計DNA構建體，將標記基因放置在與AID基因相同的方向，使得標記基因也可以表達。在此情況下，表達標記基因的抗體生廣細胞也可以表達AID基因。因此，可以使用標記基因的表達作為指標(基于表型)選擇表達AID基因的細胞。另一方面，當在抗體生產細胞中執行功能的啟動子和AID基因在外源性AID基因構建體中按相反方向排列，因而AID基因處于不可表達的狀態時，設計DNA構建體，將標記基因放置在與AID基因相反的方向(將標記基因放置在與啟動子相同的方向)，使得標記基因可以表達。在此情況下，表達標記基因的抗體生產細胞不表達AID基因。因此，可以使用標記基因的表達作為指標(基于表型)選擇沒有AID基因表達的細胞。
在本發明中，不論AID基因表達是處于開或者關的狀態，都能夠選出產生導入了突變的多肽的細胞。從分離的細胞中分離導入了期望的突變的多肽或者編碼所述多肽的DNA,并測試看是否為期望的多肽或編碼所述多肽的DNA。如果分離的多肽或DNA不是導入了期望的突變的多肽或者編碼所述多肽的DNA，而細胞內AID基因表達處于開的狀態，則可以進一步培養細胞。隨著細胞培養更長的時間，多肽中積累更多的突變。因此，可以從進一步培養的細胞中分離多肽或者編碼多肽的DNA，并測試其是否為導入了期望的突變的多肽或編碼所述多肽的DNA。另一方面，如果分離的多肽或DNA不是導入了期望的突變的多肽或者編碼所述多肽的DNA，而細胞內AID基因表達處于關的狀態，則開啟細胞內的AID基因表達。這導致細胞產生進一步導入突變的多肽。可以從細胞中分離導入了突變的多肽或者編碼所述多肽的DNA,并測試其是否為導入了期望的突變的多肽或編碼所述多肽的DNA。本發明的方法的實例描述如下。但是，方法不限于該實例。 (I)例如，將本發明的基因打靶載體導入到不表達AID基因的抗體生產細胞中(AID基因表達關閉了的抗體生產細胞)。成功導入了載體的細胞不表達內源性抗體分子。即使將本發明的基因打靶載體導入到表達AID基因的抗體生產細胞中(AID基因表達開啟了的抗體生產細胞)，成功導入了載體的細胞也不表達內源性抗體分子。(2)選擇不表達內源性抗體分子的細胞。(3)然后，使位點特異性重組酶與導入了載體的細胞的基因組中的位點特異性重組酶識別序列反應。通過重組酶去除位于位點特異性重組酶識別序列之間的DNA，使細胞表達多肽(包含期望的氨基酸序列和抗體恒定區氨基酸序列的嵌合蛋白)。此外，與細胞反應的位點特異性重組酶反轉了 AID基因在外源性AID基因構建體中的方向。AID基因的倒位導致基因表達(開啟AID基因表達)。但是，在一些情況下，可能不發生AID基因的倒 位。這導致AID基因的表達開啟和關閉的細胞的混合物。(4)之后，選擇生產多肽(包含期望的氨基酸序列和抗體恒定區氨基酸序列的嵌合蛋白)和表達AID基因的細胞。或者，選擇產生多肽(包含期望的氨基酸序列和抗體恒定區氨基酸序列的嵌合蛋白)但不表達AID基因的細胞。當選擇后一種細胞時，使位點特異性重組酶與細胞進一步反應。選擇通過該處理開啟了 AID基因表達的細胞。(5)之后，從所選擇的表達AID基因和多肽(包含期望的氨基酸序列和抗體恒定區氨基酸序列的嵌合蛋白)的細胞中分離產生具有期望的性質的多肽的細胞。或者，培養所選細胞一定時間，然后從培養細胞中選擇產生具有期望的性質的多肽的細胞。可以在分離細胞之前或之后，通過位點特異性重組酶與細胞的反應，關閉AID基因表達。(6)當沒有獲得產生具有期望的性質的多肽(包含期望的氨基酸序列和抗體恒定區氨基酸序列的嵌合蛋白)的細胞時，可以在培養細胞一定時間后重復步驟(5)。如果AID基因表達在(5)中關閉，則在培養之前再次開啟表達。(7)可以從分離的細胞中分離DNA，以驗證導入到DNA中的突變的存在。可以使用下文描述的方法分離導入了突變的多肽或編碼所述多肽的DNA。可以通過確定導入了突變的多肽的活性或者多肽編碼DNA的核苷酸序列，評估導入了突變的多肽或編碼所述多肽的DNA是否是感興趣的。或者，當導入了突變的多肽是抗體、細胞因子或其他時，與抗原或配體的結合活性(特異性、親和力等)可用作指標，或者當多肽是酶等時，可以使用酶活性作為指標，來測試導入了突變的多肽或編碼所述多肽的DNA是否是感興趣的。使用上述方法，可以從制備得到的細胞群中分離出產生導入了突變的多肽的克隆。此外，可以通過在所獲得的克隆中開啟AID基因表達和重復進行誘變，獲得產生導入了更多期望的突變的多肽的克隆。通過使用在所生產的多肽中期望的性質的有無作為指標來篩選，可以選擇產生具有期望的性質的多肽的克隆。此類篩選可以在從細胞中分離多肽后進行，或者使用沒有分離多肽的細胞進行。在本文中，可以將編碼信號肽的DNA插入到在抗體生產細胞中執行功能的DNA和編碼期望的氨基酸序列的DNA之間，使得多肽展示在細胞表面或分泌到細胞外。當多肽分泌到細胞外時，可以使用培養上清液實施篩選。在如上所述選擇細胞后，可以從細胞中分離DNA，來確定導入到核苷酸序列中的突變。在本發明中，位點特異性重組酶可以通過例如下述方法與細胞反應。但是，方法不限于這些實例。 (I)將四環素、強力霉素等添加到含有這樣的DNA構建體的細胞中，所述構建體中，連接有(或包含)核轉位信號的編碼位點特異性重組酶的DNA被置于受四環素、強力霉素等調控的啟動子3’偵U。*Gossen, M. Bujard, H. (1992) Tight control of gene expression inmammalian cells by tetracycline responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci.USA89:5547-5551.*Gossen, M. , Freundl ieb, S. , Bende r, G. , Muller, G. , Hi I len, ff. Bujard, H.(1995)Transcriptional activation by tetracycline in mammalian cells. Science268:1766-1769.*Url inger, S. , Baron, U. , Thel lmann, M. , Hasan, M. T. , Bujard, H. Hi I len, ff.(2000)Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptionalactivators:Novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 97(14) :7963-7968.(2)將用于表達位點特異性重組酶的載體瞬時轉染到細胞內。(3)將連接(或包含)核轉位信號的位點特異性重組酶導入到細胞內。(4)向含有DNA構建體的細胞應用胞外刺激(例如，4_羥泰米芬)，所述構建體包含編碼位點特異性重組酶的DNA，所述位點特異性重組酶在存在胞外刺激的條件下活化，而在缺少刺激的條件下不活化。本發明的抗體生產細胞可含有包含這樣的DNA的DNA構建體，所述DNA中，在細胞內有功能的啟動子DNA與編碼位點特異性重組酶的DNA可操作地連接。在下文中，該DNA構建體有時被稱為“位點特異性重組酶基因構建體”。如上所述,在抗體生產細胞中執行功能的啟動子包括但不限于￠-肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、巨細胞病毒啟動子、CAG啟動子和EFl a啟動子。位點特異性重組酶可以是處于這樣的形式在存在胞外刺激的條件下活化，而在缺少刺激的條件下不活化。此類位點特異性重組酶包括，但不限于位點特異性重組酶與雌激素受體或包含其雌激素結合結構域的多肽的融合蛋白。
在本發明的位點特異性重組酶基因構建體中，可將核轉位信號插入到位點特異性重組酶的N末端。此外，優選將多聚A附加序列置于編碼位點特異性重組酶、或者編碼位點特異性重組酶與包含雌激素結合結構域的多肽的融合蛋白的DNA的3’端。同時，本發明的位點特異性重組酶基因構建體可包括選擇標記基因。此類選擇標記基因包括但不限于抗生素抗性基因，例如新霉素磷酸轉移酶基因、滅瘟素S脫氨酶基因、嘌呤霉素N乙酰轉移酶基因、組氨醇脫氫酶基因、潮霉素B磷酸轉移酶基因和黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因；突光蛋白基因，例如GFP和DsRed ;以及生色酶例如@ -半乳糖苷酶(IacZ)和￠-內酰胺酶的基因。多聚A可以附接到標記 基因的3’端。只要本發明的雌激素受體具有配體結合活性，則對其沒有限制。雌激素受體包括野生型(例如，SEQ ID NO: 52和53)和突變的雌激素受體。突變的雌激素受體包括只應答4-羥泰米芬而不應答真正的配體一雌二醇的受體。更具體而言，突變的雌激素受體包括但不限于在第525位包含甘氨酸的氨基酸取代的突變雌激素受體。當雌激素作為抗體生產細胞來源的物種的性激素時，或者當抗體生產細胞對雌激素具有響應性時，優選使用雌激素結合活性受損的突變雌激素受體。當使用融合蛋白形式的受體時，可以將它的配體結合結構域與位點特異性重組酶融合。本領域技術人員可以制備突變雌激素受體，例如根據下文所示文件(I)中描述的方法(該文件描述了多種類型的變體的制備)。同時，文件(2)報告了一種在其氨基酸序列的第525位包含精氨酸取代甘氨酸的突變雌激素受體只應答4-羥泰米芬而不應答真正的配體雌二醇。此外，文件(3)和(4)公開了以融合蛋白的形式使用突變雌激素受體的他莫昔芬結合結構域。本領域技術人員可以通過恰當地參考這些文件，制備位點特異性重組酶基因構建體。在本文描述的實施例中，使用Cre重組酶(例如，SEQ ID N0:51(圖27))與突變雌激素受體的他莫昔芬結合結構域(SEQ ID NO:40和41 (圖25))融合的突變雌激素受體。用于實施例中的突變雌激素受體描述在文件(4)(例如，圖I)中。(I)Fawell 等人，Characterization and colocalization of steroid bindingand dimerization activities in the mouse estrogen receptor. Cell (1990)vol. 60 (6)pp.95-362(2) Danielian 等人，Identification of residues in the estrogenreceptor that confer differential sensitivity to estrogen and 輕泰米芬.MolEndocrinol(1993)vol. 7(2)pp. 232-40(3) Littlewood 等人，A modified oestrogen receptor ligand-binding domainas an improved switch for the regulation of heterologous proteins. Nucleic AcidsRes (1995) vol. 23(10)pp. 1686(4) Zhang 等人，Inducible site-directed recombination in mouse embryonicstem cells. Nucleic Acids Res(1996)vol. 24(4)pp. 543-8本發明的位點特異性重組酶基因構建體包括但不限于具有下文所述結構的構建體(對應于上述文件(4)的圖I中示例的構建體)。包含下列(I)和⑵的DNA的構建體，其中(I)的DNA與⑵的DNA可操作地連接(上述文件(4)的圖Ia中被稱為“pANCreMer”的構建體)(I)在抗體生產細胞中執行功能的啟動子DNA ；
(2)其中下列⑴和(ii)的DNA合框連接的DNA ；(i)編碼位點特異性重組酶的DNA，其包含緊鄰于起始密碼子之后的編碼核轉位信號的DNA片段；和(ii)編碼雌激素受體或包含其雌激素結合結構域的多肽的DNA。包含下列(I)和(2)的DNA的構建體，其中(I)的DNA與(2)的DNA可操作地連接(上述文件(4)的圖Ib中被稱為“pANMerCreMer”的構建體)(I)在抗體生產細胞中執行功能的啟動子DNA ；(2)下列⑴和(ii)的DNA按(ii) - (i) - (ii)的順序從載體DNA鏈的5’至3’端合框連接的DNA ； (i)編碼位點特異性重組酶的DNA，其包含緊鄰于起始密碼子之后的編碼核轉位信號的DNA片段；和(ii)編碼雌激素受體或包含其雌激素結合結構域的多肽的DNA。優選的是，編碼位點特異性重組酶的DNA在其3’端包含多聚A附加序列。可以通過使用本領域技術人員已知的方法，將制備的位點特異性重組酶基因構建體導入到抗體生產細胞中，獲得含有此類位點特異性重組酶基因構建體的細胞。優選地，導A的位點特異性重組酶基因構建體整合到基因組中。位點特異性重組酶在存在胞外刺激的條件下活化，而在缺少刺激的條件下不活化。在本文中，“在存在胞外刺激的條件下活化”意指通過刺激，位點特異性重組酶表達成能夠轉位到細胞核中的活性形式，或者所表達的位點特異性重組酶轉位到細胞核中。換言之，意味著位點特異性重組酶變為能夠與細胞基因組中的位點特異性重組酶識別序列反應并特異性切割所述識別序列的狀態。因此，位點特異性重組酶可以是任何形式，只要編碼位點特異性重組酶的DNA響應于刺激而表達或者所述位點特異性重組酶響應于刺激而活化。本領域技術人員可以想到各種用于刺激-響應性表達或激活的調控系統，和從中選擇恰當的系統。位點特異性重組酶構建體包括例如這樣的DNA構建體，所述構建體中編碼雌激素受體或包括其雌激素結合結構域的多肽的基因與位點特異性重組酶cDNA合框連接，使得位點特異性重組酶可以作為與雌激素受體或包含其雌激素結合結構域的多肽的融合蛋白表達(詳細內容參見JP-A(Kokai) 2006-109711的實施例)。在此情況下，當將胞外刺激施加于細胞時，位點特異性重組酶活化。因此，只有在施加時，位點特異性重組酶才活化(意味著上述融合蛋白轉位到細胞核中，因此位點特異性重組酶可以與位點特異性重組酶識別序列反應)，從而使含有AID基因且位于位點特異性重組酶識別序列之間的區域倒位。與此同時，位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的含有啟動子DNA和標記基因的DNA被去除。胞外刺激包括但不限于對雌激素受體或其雌激素結合結構域的刺激。“對雌激素受體或其雌激素結合結構域的刺激”包括但不限于用雌激素(例如，雌二醇)及其衍生物(例如雌激素激動劑4-羥泰米芬)的刺激。本發明的抗體生產細胞可具有下列(a)和(b)的特征。(a)在抗體生產細胞中，XRCC3基因的兩個等位基因中僅有一個是失活的。(b)相比具有兩個XRCC3基因的等位基因的細胞，導入點突變的頻率升高。
對于編碼源自抗體生產細胞的蛋白質的DNA，其AID基因介導的誘變主要通過被稱為基因轉變(conversion)的機制發生。也會發生由單核苷酸取代造成的點突變，但頻率很低。同時，已報道了在基因轉化突變占主導地位的DT40細胞中轉變突變模式的方法，從基因轉變(conversion)變為點突變。已知可以通過僅失活兩個XRCC3等位基因之一而在細胞中誘導點突變(X射線修復互補缺陷修復，中華倉鼠細胞3中)(JP-A(Kokai) 2009-60850)。因此，本發明還包括兩個XRCC3等位基因中僅一個失活的抗體生產細胞。XRCC3是維持染色體穩定性和修復受損DNA的基因，并參與細胞內的同源重組。雞XRCC3基因具有8個外顯子。雞XRCC3基因的核苷酸序列顯示于SEQ ID N0:39。SEQ IDNO:39中8個外顯子的位置顯示如下外顯子1，第I至215位；外顯子2，第216至284位；
外顯子3，第285至422位；外顯子4,第423至635位；外顯子5,第636至790位；外顯子6，第791至1003位；外顯子7，第1004至1050位；和外顯子8,第1051至1935位。在本發明的抗體生產細胞中，存在于細胞的同源染色體中的兩個XRCC3等位基因中僅一個可以被失活。基因的失活如上所述。可以通過例如本領域技術人員已知的方法，如使用上述打靶載體的同源重組方法，來制備基因失活的細胞。在本發明中，可以分隔雞XRCC3基因的8個外顯子中的任一個。可以分割多個外顯子。優選分割第6個外顯子。用于本發明中的抗體生產細胞包括但不限于B細胞、人伯基特氏淋巴瘤細胞系(Ramos、BL2等)、小鼠前B細胞系18-81，和小鼠未成熟B細胞系WEHI-231。抗體生產細胞優選包括源自雞的B細胞，例如源自雞抗體生產細胞的DT40和DT40-SW細胞系。本發明還涉及產生編碼多肽或導入了突變的多肽的DNA的方法，包括下述步驟(a)通過本文所述的制備抗體生產細胞的方法，制備產生多肽或導入了突變的多肽的抗體生產細胞；和(b)從步驟(a)的抗體生產細胞中分離編碼多肽或導入了突變的多肽的DNA。可以通過本領域技術人員已知的方法分離DNA。本發明的產生多肽或導入了突變的多肽的抗體生產細胞包括在細胞表面展示多肽或導入了突變的多肽的抗體生產細胞；將多肽或導入了突變的多肽分泌到細胞外的抗體生產細胞；和在細胞質中含有多肽或導入了突變的多肽的抗體生產細胞。本發明還涉及用于產生多肽或導入了突變的多肽的方法，包括下述步驟(a)通過本文所述的制備抗體生產細胞的方法，制備產生多肽或導入了突變的多肽的抗體生產細胞；和(b)從步驟(a)的抗體生產細胞或其分泌材料中分離多肽或導入了突變的多肽。
當抗體生產細胞在細胞表面展示多肽或導入了突變的多肽時，可以通過在溶解膜級分后進行親和層析來分離多肽。或者，當抗體生產細胞將多肽或導入了突變的多肽分泌到細胞外時，可以在濃縮培養上清液后進行親和層析來分離多肽。或者，當抗體生產細胞的細胞質中含有多肽或導入了突變的多肽時，可以在制備無細胞提取物后通過親和層析純化等來分離多肽。
本發明還涉及用于產生編碼多肽或導入了突變的多肽的DNA的方法，包括下述步驟(a)通過上述生產編碼多肽或導入了突變的多肽的DNA的方法，產生編碼多肽或導入了突變的多肽的DNA ;和(b)收集由步驟(a)生產的DNA編碼的多肽。一旦獲得了編碼期望的多肽的DNA，本領域技術人員可以通過公知的方法從DNA制備多肽。此類方法包括但不限于例如這樣的方法將攜帶DNA作為插入物的基因表達載體導入細胞中，以收集細胞分泌的多肽。本發明還提供了抗體生產細胞，所述細胞中在包含編碼抗體可變區的DNA的區域和DNA構建體之間已經發生了同源重組，其中所述DNA構建體包含(I)在所述細胞中執彳丁功能的啟動子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的DNA。包含在本發明的細胞中的DNA構建體描述如上。本發明的細胞可具有本文描述的所有特征。此類細胞包括但不限于下述細胞。包含下列(a)至(C)或(a)至(d)的DNA構建體的抗體生產細胞，所述細胞中在包含編碼抗體可變區的DNA的區域和下列(a)的DNA構建體之間已經發生了同源重組，且所述細胞的內源性AID基因被功能性破壞(a) DNA構建體，包括(I)在所述細胞中執行功能的啟動子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ；(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA,該DNA包含在所述細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因，并且能夠通過位點特異性重組酶從該DNA構建體中被去除；(b) DNA構建體，包含在所述細胞中執彳丁功能的啟動子DNA ;和位于兩個按相反方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA，且其能夠通過位點特異性重組酶轉位，并包含外源性AID基因；(C)DNA構建體，包含在細胞中執行功能的啟動子DNA和編碼位點特異性重組酶的DNA，其中所述位點特異性重組酶在存在胞外刺激的條件下活化，而在缺少刺激的條件下不活化；和(d)包括這樣的XRCC3基因的DNA構建體，其中所述基因的兩個等位基因之一中的第6個外顯子是失活的。(c)的DNA構建體還可以被描述為這樣的DNA構建體，其包含在細胞中執行功能的啟動子DNA，和編碼位點特異性重組酶與雌激素受體或包含其雌激素結合結構域的蛋白質的融合蛋白的DNA。可以通過上述方法制備此類細胞。含有上述(a)至(C)的DNA構建體的細胞包括但不限于DT40-SW細胞。本發明還涉及包含本文中描述的細胞的試劑盒。 所述試劑盒可用于例如將編碼期望的氨基酸序列的DNA插入到抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域中。或者，所述試劑盒可用于制備產生導入了突變的多肽的抗體生產細胞。本發明的試劑盒除本文描述的細胞外，還可包含本文描述的打靶載體。本發明還提供了本文描述的打靶載體。本發明還提供了包含本發明的打靶載體的細胞。本發明的細胞可用于例如制備產生導入了突變的多肽的細胞。此類細胞包括但不限于下文所述的細胞。本發明還提供了包含本發明的打靶載體的試劑盒。本發明的試劑盒可用于讓包含編碼抗體生產細胞的抗體可變區的DNA的區域與DNA構建體之間同源重組，所述DNA構建體包含(I)在所述細胞中執彳丁功能的啟動子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ；(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的DNA。本發明的試劑盒可包括本文中描述的抗體生產細胞。本發明還提供了包含SEQ ID NO: 7的核苷酸序列的DNA。此類DNA可用作構建本發明的基因打靶載體的材料，并可以從雞來源的抗體生產細胞中分離，例如通過實施例中描述的方法。本發明中新鑒別的序列是SEQ ID N0:7的核苷酸序列中的第1-3120位和第3882-7891位的核苷酸。本發明還提供了插入了本發明的DNA的載體。例如，當使用大腸桿菌作為宿主時，對所述載體沒有特殊的限制，只要本發明的載體具有供大腸桿菌中復制用的“起點(ori) ” (例如，JM109、DH5 a、HBlOl和XLlBlue)以允許在大腸桿菌等中大規模擴增和制備該載體，并且進一步具有用于選擇轉化的大腸桿菌的基因(例如，允許使用試劑(如青霉素、四環素、卡那霉素和氯霉素)區分的藥物抗性基因)即可。此類載體包括例如M13載體、pUC載體、pBR322、pBluescript和pCR-Script。對于cDNA亞克隆和切出，除上述載體外，可以使用例如PGEM-T、pDIRECT和pT7。當使用載體產生由本發明的DNA編碼的多肽時，表達載體是特別有效的。例如，當目標是在大腸桿菌中表達時，表達載體需要具有上述用于在大腸桿菌中擴增的性質。此外，當使用大腸桿菌(例如，JM109、DH5 a、HBlOl和XLl-Blue)作為宿主時，載體需要具有用于在大腸桿菌中高效表達的啟動子，例如，IacZ啟動子(Ward 等人，Nature 341，544-546，1989 ；FASEB J. 6，2422-2427，1992)、araB 啟動子(Better等人，Science240, 1041-1043, 1988)或17啟動子。除上述載體外，此類載體包括PGEX-5X-1 (Pharmacia)、“QIAexpress 系統”(QIAGEN)、pEGFP 和 pET。
此外，載體可含有用于多肽分泌的信號序列。當產生多肽到大腸桿菌的周質空間中時，可使用PelB信號序列(Lei, S. P.等人，J. Bacteriol. 169，4379，1987)作為用于多肽分泌的信號序列。可以通過例如氯化鈣方法或電穿孔方法將載體導入到宿主細胞中。除大腸桿菌載體外，用于表達本發明的DNA的載體包括例如源自哺乳動物(例如，pcDNA3(Invitrogen)、pEGF-BOS(Nucleic Acids Res. 18(17)，5322，1990)、pEF 和 pCDM8)、昆蟲細胞(例如，“Bac-to-BAC桿狀病毒表達系統”(GIBC0-BRL)和pBacPAK8)、植物(例如，pMHl和pMH2)、動物病毒(例如，pHSV、pMV和pAdexLcw)、逆轉錄病毒(例如，pZIPneo)、酵母(例如，“畢赤酵母表達試劑盒”(Invitrogen)、pNVll和SP-Q01)和枯草芽孢桿菌(例如，PPL608和pKTH50)的表達載體。為了在動物細胞(例如CHO、COS和NIH3T3細胞)中表達，載體需要具有在此類細胞中表達必需的啟動子，例如SV40啟動子(Mulligan等人，(1979)Nature 277:108)、MMLV-LTR 啟動子、EFl a 啟動子(Mizushima 等人，(1990)Nucleic Acids Res. 18:5322)或CMV啟動子。更優選的，載體具有用于選擇轉化子的基因(例如，允許使用藥物(例如，新霉素和G418)區分的藥物抗性基因)。具有此類性質的載體包括例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV 和 p0P13。可以通過本領域技術人員已知的方法，例如電穿孔方法,將本發明的DNA導入到細胞中。本發明還提供了導入了本發明的DNA或載體的細胞。對導入了本發明的載體的宿主細胞沒有特殊的限制。可以使用例如大腸桿菌和各種類型的動物細胞。本發明的宿主細胞可用作例如用于生產和表達本發明多肽的生產系統。多肽生產細胞包括體外和體內系統。此類體外生產系統包括使用真核細胞或原核細胞的系統。真核細胞，例如動物細胞、植物細胞和真菌細胞，可用作宿主。已知的動物細胞包括例如哺乳動物細胞，例如CHO (J. Exp. Med. (1995) 108:945)、C0S、3T3、骨髓瘤、BHK (幼倉鼠腎)、HeLa和Vero ;兩棲動物細胞，例如非洲爪蟾卵母細胞(Valle等人，(1981)Nature291，358-340);和昆蟲細胞，例如Sf9, Sf21和Tn5。特別是對于CHO細胞，優選使用DHFR基因缺陷的 dhfr-CHO(Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1980) 77:4216-4220)和 CHO K-I (Proc.Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60:1275)。在動物細胞中，CHO優選用于大規模表達。可以將載體導入到宿主細胞中，例如通過磷酸鈣方法、DEAE-葡聚糖方法、使用陽離子脂質體DOTAP (Boehringer-Mannheim)的方法、電穿孔方法、脂質體轉染方法等。植物細胞包括例如煙草來源的細胞，已知作為多肽生產細胞。可以使用來自這些細胞的愈傷組織培養物。已知的真菌細胞包括酵母細胞，例如酵母屬，如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),和絲狀真菌,如曲霉屬，包括黑曲霉(Aspergillus niger)。使用原核細胞的生產細胞包括使用細菌細胞的系統。已知的細菌細胞包括大腸桿菌(例如，JM109、DH5alpha 和 HB101)和枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)。本說明書引用的所有現有技術文件都通過引用整合到本文中。
實施例在下文中，將參照實施例具體描述本發明，但本發明的技術范圍不應視為局限于此。、
本發明人和其他研究小組證實了當目標基因整合到DT40或Ramos細胞的抗體基因的基因座中時，目標基因被突變(Wang，L.等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 101, 16745-16749(2004) ；Kanayama, N.等人，Nucleic Acids Res. 34，elO (2006);Arakawa, H.等人，Nucleic Acids Res. 36，el (2008))。基于上述事實，本發明人認為如果建立用于導入外源基因到具有下列特征的DT40中的系統，可以使用基于DT40的抗體生產系統實現有效的外源抗體親和力成熟。(I)在導入的抗體基因中發生突變。(2)由導入基因編碼的抗體表達并展示在細胞表面。(3)由導入基因編碼的抗體表達并分泌到培養上清液中。抗體基因的基因座包括啟動子和下游各外顯子，所述各外顯子包括編碼前導肽的外顯子，前導肽含有靶向內質網所需要的信號；編碼可變區的外顯子；和編碼恒定區的 外顯子(圖I)。在重鏈中，恒定區包括多個外顯子。抗體是以分泌的形式還是以膜結合的形式表達取決于外顯子的用法。因此，本發明人認為用于構建具有上述特征的系統的最有效的方法是用外源抗體基因的可變區取代雞抗體基因座中的可變區外顯子(圖1A)。本發明人認為，通過用來源于外源抗體的可變區取代重鏈和輕鏈基因的可變區，可以制備出抓這樣的DT40，其表達具有來源于外源抗體的可變區以及雞來源的恒定區的嵌合抗體(圖2)。生產表達嵌合抗體的DT40要求如下(I)分離和結構解析雞抗體基因；和(2)構建用于取代雞抗體基因座中的可變區外顯子的打靶載體。隨著基因組分析的進展，抗體輕鏈基因區域的核苷酸序列是已知的；但是，重鏈僅有部分信息可用。因此，本發明人分離和測序了未鑒別的抗體重鏈區域。基于所揭示的信息，本發明人構建了各種用于取代抗體可變區基因的打靶載體，并將它們導入DT40-SW細胞內。但是，發現具有目的修飾基因的細胞的獲得效率低于常規的基因敲除。之后，本發明人發現了有效的解決方案，并發現可以只通過本發明的方法建立有效生產嵌合抗體的細胞。此外，本發明人嘗試通過使用所制備的細胞的突變機制將突變導入外源抗體基因中，并成功地以可與野生型DT40-SW導入突變到其內源性抗體基因中相比較的效率，將突變導入到抗體基因中。本發明的實施例詳細示例如下。(I)克隆和分析雞抗體重鏈基因可變區基因上游和下游的基因片段是構建可變區基因打靶載體必需的。對雞抗體重鏈基因已進行了一定程度的分析(Reynaud, C-A.等人，Cell59, 171-183(1989) ；Kitao, H. , Immunol. Lett. 52, 99-104 (1996) ；Kitao, H.等人，Int.Immunol. 12, 959-968 (2000)) 0但是，對于在可變區基因周圍的區域只有極少的信息。抗體重鏈基因被認為是非常不穩定的(Reynaud, C-A.等人，Cell59，171-183 (1989))。但是，原因尚不清楚。在本發明中，雞抗體重鏈可變區基因是從DT40制備的基因組DNA文庫(由東京大學的Shunichi Takeda博士提供)中分離的。為了制備探針，通過DNA步移方法分離在抗體重鏈可變區基因的上游區域。使用KOD-pIus DNA聚合酶(T0Y0B0)在25微升的反應混合物中進行PCR。在第一輪PCR中，使用針對JH下游區域的引物(cJH1R1:5，-GGGGTACCCGGAGGAGACGATGACTTCGG-3’ ；SEQ ID NO: I)作為反義引物，而用不同的序列作為有義引物。使用DT40基因組DNA作為模板，如下進行PCR:進行15個循環的(940C，15秒；68°C (-0. 7°C /循環)，30秒；和68°C，4分)，再進行15個循環的(94°C，15秒；57°C，30秒；和68°C，4分)。第二輪PCR使用5微升的第一輪PCR混合物作為模板，反義引物(cJH-R:5，-CTTCGGTCCCGTGGCCCCATGCGTCGAT-3’ ；SEQ ID NO :2)和與第一輪PCR相同的有義引物。第二輪PCR進行30個循環的(94°C，15秒；62°C，30秒；和68°C，4分)。PCR使用TdT-2 (5’-GGITCAATGTAGTCCAGTCC-3’ ；SEQ ID NO: 3)作為有義引物，產生約 Ikb 的PCR產物。因此，將產品克隆到pCR-Blunt載體(Invitrogen)中。產品的序列分析揭示了它含有雞抗體重鏈VDJ基因序列，以及一段可變區基因上游區域的已知序列((M30319 ；Reynaud, C-A.等人，Cell59，171-183 (1989))，和一段 464bp 的更上游序列(圖 19 ；SEQ ID NO:4) 為了克隆在抗體重鏈可變區周圍的區域中的基因，使用PCR DIG探針合成試劑盒(Roche)與上述基因片段作為模板以及有義引物 (CHCupF-Xba:5，-GTGGCCATTCTAGAATTAATTGCACC-3 ;SEQ ID NO:5)，和反義引物(CHCupR-Bam:5，-GGAGGGATCCGGCTTCGTTAGC-3’ ；SEQ ID NO :6) 一起制備 DIG 標記
的探針。使用上述探針，根據Roche提供的標準規程篩選插入了來自DT40基因組DNA的約20kb片段的ADASH II噬菌體文庫。從噬菌體文庫中獲得了 2個陽性克隆(200，OOOpfu)。將源自兩個克隆之一的約20kb的NotI片段亞克隆到pBluescript II SK中。然后，從亞克隆獲得含有重鏈可變區基因及其上游(約3. 5kb)和下游(約4. Okb)區域的XbaI-NotI片段(共計約8kbp)。針對XbaI-NotI片段構建限制性酶切圖(圖3)，并分析序列。結果顯示片段含有7891bp的雞抗體重鏈基因(圖20 ；SEQ ID NO:7)。發現整個區域，除了可變區基因周圍761bp的區域(其包括Reynaud, C-A等人報道的序列(Cell 59，171-183(1989)))之外，是之前尚未報道過的新序列。使用該序列構建用于重鏈可變區基因的打靶載體。(2)構建用于重鏈可變區的基因打靶載體為了插入外源抗體可變區基因，在信號肽序列周圍和JH下游的內含子中導入了限制性位點(圖4_6、21和22)。構建了兩種打靶載體，它們的導入到信號肽序列中的限制性位點不同。(VH打靶載體I ;圖4、5和21)修飾編碼VH基因的第3和第4個氨基酸的密碼子，構成PvuII位點(圖4A)。這導致所編碼的氨基酸對從蘇氨酸/亮氨酸變為谷氨酰胺/亮氨酸。此外，用小鼠單克隆抗體中相對頻繁使用的谷氨酸取代VH的第I個氨基酸。此外，在JH的下游導入一個SpeI位點。由于PvuII消化產生平末端，將待插入的外源抗體可變區基因的5’端設計為平末端。此外，在JH的3’端附接剪接供體共有序列和SpeI位點(5’-ggtgagtactagt-3’ ；SEQ IDNO:42)(圖4B)。或者，代替SpeI位點，也可以連接AvrII、XbaI或NheI位點到外源抗體可變區基因上，因為用AvrII、XbaI或NheI消化產生與SpeI消化相同的粘性末端。上述設計允許插入多種抗體基因片段。通過寡核苷酸接頭將雞抗體重鏈基因的XbaI-NotI片段插入到pBluescript IISK載體中，所述載體事先用PvuII消化去除多克隆位點(圖5A)。使用雞抗體重鏈基因作為模板，以及靠近BamHI位點的有義引物(CHFup Ik-Bam:5’-GTGGGATCCCTAATTAATGTTGGCG-3’ ；SEQ ID NO:8)和靠近信號肽序列的反義引物(CJH4R-PS S:5’-TATTCCGCGGACTAGTACGTCAGCTGAACCTCCGCCATCAGCCCTGTGGGGA-3’ ；SEQ ID NO:9)一起制備PCR片段，所述片段含有PvuII、SpeI和SacII位點。用該PCR片段取代小鼠抗體重鏈基因的BamHI-SacII部分(圖5B)。相繼去除上游的XbaI-BamHI和下游的XhoI-NotI 部分(圖 5C)。使用接頭(5，-CAGATCTGGC-3，；SEQ ID NO:43)導入 BglII 位點(圖 OT)。
使用BamHI 從 pLoxBsr (Arakawa, H.等人，BMC Biotechnol. 17 (2001))切出含有位于IoxP序列之間的P肌動蛋白啟動子DNA、滅瘟素S抗性基因和多聚A附加序列的DNA片段，并插入到BglII位點(圖5E)。可以使用其他DNA構建體，只要它們含有位于IoxP序列之間的啟動子DNA和標記基因，例如藥物抗性基因。對含有位于IoxP序列之間的啟動子DNA和標記基因的DNA構建體而言，其相對于靶基因的取向沒有限制。對于該實施例中使用的載體，以與抗體重鏈基因的轉錄方向相反的方向插入滅瘟素S抗性基因。VH打靶載體I的序列顯示在圖21(SEQ ID NO: 10)中。(VH打靶載體2 ;圖5、6和22)為了允許在信號肽的緊鄰后方插入外源抗體可變區基因，修飾信號肽的末端核苷酸序列，使其具有SphI位點(圖6A)。JH側的結構與VH打靶載體I的結構相同。當外源抗體基因在不改變結構基因區域的序列的條件下插入到載體中時，在基因的5’端附接上一個SphI位點和一個核苷酸“g”(5’-gcatgcg-3’)，在3’末端附接上一段剪接供體共有序列和一個SphI位點(5，-ggtgagtactagt-3’ ；SEQ ID NO:42)，與VH打祀載體I的情況相同(圖6B)。或者，代替SpeI位點，也可以附接AvrII、XbaI或NheI位點到外源抗體可變區基因上，因為用AvrII、XbaI或NheI消化產生與SpeI消化相同的粘性末端。使用雞抗體重鏈基因作為模板，以及用于上游區域的有義引物(VHupF2:5’ -TTAGAAGGGGACAAATTAATGAGGAAACACGACTTTGG-3’ ；SEQ ID NO:11)和具有SpeI 和 SphI 位點的反義引物(VHupR2:5’ -CGACTAGTCCGCATGCAGCCCTGTGGGGAAGGGCAGAGAGCGCTGAC-3’ ；SEQ ID NO:12)一起制備基因片段。在該片段的SfiI和SpeI位點消化片段，并取代VH打靶載體I的VH打靶載體I的片段(圖5F)。對含有位于IoxP序列之間的啟動子DNA和標記基因的DNA構建體而言，其相對于靶基因的方向沒有限制。對于該實施例中使用的載體，按相對于抗體重鏈基因的轉錄方向相反的方向插入滅瘟素S抗性基因。VH打靶載體2的序列顯示在圖22 (SEQ IDNO: 13)中。(3)構建用于輕鏈可變區的基因打靶載體與抗體重鏈的情況相同，為了插入外源抗體可變區基因，在信號肽序列周圍和JL下游的內含子中導入了限制性位點(圖7-9、23和24)。構建了兩種打靶載體，它們的導入到信號肽序列中的限制性位點不同。
(VL打靶載體I ;圖7、8和23)修飾編碼VL基因的第2和第3個氨基酸的密碼子，構成HpaI位點(圖7A)。這導致所編碼的氨基酸對從亮氨酸/蘇氨酸變為纈氨酸/天冬氨酸。此外，如上關于VH打靶載體所述，在幾的下游導入SpeI位點。由于HpaI消化產生平末端，將待插入的外源抗體可變區基因的5’端設計為平末端。此外，在JL的3’端附接剪接供體共有序列和SpeI位點(5，-ggtgagtactagt-3’ ；SEQ ID N0:42)(圖 7B)。或者,代替 SpeI 位點，也可將 Avrll、XbaI或NheI位點附接到外源抗體可變區基因上，因為用Avrll、XbaI或NheI消化產生與SpeI消化相同的粘性末端。上述設計允許插入多種抗體基因片 段。雞輕鏈基因已經被克隆(Reynaud,C.-A.，等人，Cell 40，283-291 (1985))，且已經通過基因組分析揭示了基因周圍的核苷酸序列(International Chicken GenomeSequencing Consortium, Nature 432, 695-716(2004))(圖 8A)。因此，利用下述引物，使用從DT40細胞提取的基因組DNA作為模板，通過PCR制備基因片段。使用有義引物(IgLU53:5，-ACGACCCTGGCACCAACAGAGACCTGC-3’ ；SEQ ID NO: 14)和具有 HpaI 和 SpeI 位點的反義引物(IgLU32:5’ -ACTAGTTGGTTAACCGCTGCCTGCACCAGGGAACCTGGAG-3’ ；SEQ ID NO: 15)擴增抗體輕鏈可變區基因的5’上游區域。使用具有SpeI和BamHI 位點的有義引物(IgLD53:5，-ACTAGTCTCGGATCCTCTTCCCCCATCGTGAAATTGTGAC-3’ ；SEQ ID NO:16)和反義引物(IgLD34:5，-AGCGGGTGGAGCCATCGATGACCCAATCCACAGTCA-3’ ；SEQ ID NO:17)擴增3’下游區域。將獲得的PCR產物克隆到pCR-Blunt載體(Invitrogen)中。用SacI和SpeI切出5’側片段，并將其作為插入物插入到含有3’側片段的載體中(圖8B)。使用BamHI切出含有位于IoxP序列之間的P肌動蛋白啟動子DNA、滅瘟素S抗性基因和多聚A附加序列的DNA片段，或者含有位于IoxP序列之間的P肌動蛋白啟動子DNA、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因和多聚A附加序列的DNA片段(Arakawa, H.等人，BMC Biotechnol. 17(2001))，并插入到SpeI位點下游的BamHI位點中(圖8C)。可以使用其他DNA構建體，只要它們含有位于IoxP序列之間的啟動子DNA和標記基因，例如藥物抗性基因。對于含有位于IoxP序列之間的啟動子DNA和標記基因的DNA構建體，其相對于靶基因的方向沒有限制。對于該實施例中使用的載體而言，按與抗體重鏈基因的轉錄方向相同的方向插入標記基因。VL打靶載體I的序列顯示在圖23 (SEQ ID NO: 18)中。(VL打靶載體2 ;圖8、9和24)在與VH打靶載體2的情況相同，為了允許在信號肽的緊鄰后方插入外源抗體可變區基因，修飾信號肽的末端核苷酸序列，使其具有SphI位點(圖9A)。JL側的結構與VL打靶載體I的結構相同。當外源抗體基因在不改變結構基因區域的序列的條件下插入到載體中時，一個SphI位點和核苷酸“a”(5’ -gcatgca-3’)被附接到5’端，而一段剪接供體共有序列和SphI位點(5，-ggtgagtactagt-3’ ；SEQ ID NO: 42)被附接到3’端，與VL打靶載體I的情況相同(圖9B)。或者，代替SpeI位點，可以將AvrII、XbaI或NheI位點附接到外源抗體可變區基因，因為用Avrll、XbaI或NheI消化產生與SpeI消化相同的粘性末端。與VL打靶載體I的情況相同，使用DT40的基因組DNA作為模板，以及上述用于5’區域的上游有義引物和具有SpeI和SphI位點的反義引物(IgLU33:5’-GAACTAGTGCTGCATGCACCAGGGAACCTGGAGAGGGAG-3' ；SEQ ID NO: 19) 一起通過 PCR 制備基因片段，然后將其克隆到pCR-Blunt載體中。用SacI和SpeI切出克隆的片段，并用它取代VL打靶載體I的SacI-SpeI片段(圖8D)。對含有位于IoxP序列之間的啟動子DNA和標記基因的DNA構建體而言，其相對于靶基因的方向沒有限制。對于該實施例中使用的載體，按與抗體輕鏈基因的轉錄方向相同的方向插入標記基因。VL打靶載體2的序列顯示在圖24(SEQ ID NO:20)中。(4)導入和突變小鼠單克隆抗體可變區基因作為模型，通過載體將源自小鼠單克隆抗體17. 2. 25 (抗半抗原4_羥基_3_硝基苯基乙酰基(NP))的可變區基因導入到DT40中，評估細胞的抗體表達和突變。(導入小鼠抗體重鏈可變區基因)
使用TRIzol (Invitrogen)從產生抗NP IgM抗體的雜交瘤中提取總RNA (Kanayama, N.,等人，J. Tmmuno 1. 169, 6865-6874 (2002)),所述雜交瘤是從敲入(knock in) 了抗NP單克隆抗體17. 2. 25的抗體重鏈的小鼠的脾細胞制備的(準單克隆小鼠，Cascalho, M.,等人，Science 272, 1649-(1996)) 使用 Superscript II 逆轉錄酶(Invitrogen)和oligo-dT引物從RNA合成cDNA。使用cDNA作為模板，與有義引物(VHTF:5’-GAGGITCAGCTGCAGCAGTCTGGG-3’ ；SEQ ID NO: 21)和具有 SpeI 位點的反義引物(VHT_Spe_S: 5’ -ACTAGTACTCACCTGAGGAGACGGTGACT-3’ ；SEQ ID NO: 22) —起通過 PCR 擴增抗 NP 抗體重鏈可變區(VHT)。用SpeI消化PCR片段，將其插入到用PvuII和SpeI消化的VH打靶載體I中(圖IOA)。使用DT40-SW作為用于導入構建的打靶載體的宿主細胞，DT40-SW是通過修飾DT40雞B細胞系產生的，具有自發導入突變到抗體基因中的能力。DT40-SW具有下列特征。(i)當導入用于在CMV啟動子的控制下表達Cre重組酶/雌激素受體融合蛋白的DNA構建體時,細胞組成型地表達無活性的Cre重組酶/雌激素受體融合蛋白。(ii)內源性AID基因座的兩個等位基因之一是缺陷的，另一個被由CAG啟動子表達的AID基因取代，并位于2個按相反方向排列的IoxP序列之間。(iii)AID基因依次連接于與AID基因的方向相同IRES、GFP基因和多聚A附加序列，以及與AID基因的方向相反的多聚A附加序列和嘌呤霉素抗性基因，并插入在2個IoxP序列之間。(iv)當向細胞添加4-輕泰米芬時，(i)的Cre重組酶活化,并使含有位于IoxP序列之間的AID基因的(ii)或(iii)的DNA構建體倒位。因此，當AID基因按與CAG啟動子相同的方向排列時，AID基因被表達；而當它相對于啟動子排列的方向相反時，該基因不表達。(V)對于表達AID基因的細胞，可以作為表達GFP基因的細胞加以分離，同時，對于不表達AID基因的細胞，可以基于嘌呤霉素抗性基因表達所致的藥物抗性(Kanayama，N.等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 327，70-75 ；JP-A (Kokai) 2006-109711)來加以選擇。通過下列方法將打靶載體轉染到DT40-SW中。通過BamHI消化將15微克載體線性化，與IxlO7個DT40-SW細胞混合。將500微升所獲得的懸浮液置入具有4mm狹縫的電穿杯中。使用Gene Pulser Xcell (Bio-Rad),在550V和25 ii F下進行電穿孔。在電穿孔后，將細胞懸浮在IOml生長培養基(PRMI1640 (Invitrogen), 10%胎牛血清(Invitrogen)和1%雞血清(Sigma))中，培養24小時。然后，向細胞中加入IOml的2x選擇培養基(補充了滅痕素S(Kaken Pharmaceutical Co.)的生長培養基)。滅痕素S的終濃度是20微克/ml。將細胞等分到96孔板中，培養10至14天。使用終濃度為20微克/ml的滅瘟素S選擇獲得16個克隆集落。對形成集落的細胞用藻紅蛋白標記的抗雞IgM小鼠單克隆抗體(Southern Biotechnology)進行染色,并使用FACS Calibur (BD Bioscience)分析。當成功地打靶了基因后，細胞變得不能表達抗體重鏈。因此，選擇5個用抗雞IgM抗體染色為陰性的克隆。為了在基因水平評估這些克隆，在內源性抗體重鏈基因的等位基因中，對于從VDJ重組獲得的等位基因使用有義引物(cVH1F2:5’-GGCGGCTCCGTCAGCGCTCTCT-3’ ；SEQ ID NO:23)和反義引物(cJH_R: 5’-CTTCGGTCCCGTGGCCCCATGCGTCGAT-3’ ；SEQ ID NO:2)進行擴增；而對于胚胎等位基因則使用有義引物CVH1F2 和反義引物(cVHl 內含子-R:5’-ITCACCGCCTTGGGITGCAACGGTGG-3’ ；SEQ ID NO :24)加以擴增(圖10B)。
基于上述結果，選出了 3個不產生與VDJ重組后的內源性重鏈可變區基因對應的條帶的克隆(圖10B)。這提示，由VDJ重組獲得的等位基因被目的基因打靶了。通過基因組Southern印跡分析驗證了打靶效應(圖10C)。從每個克隆分離基因組DNA。在EcoRI消化后，將DNA電泳，并轉化到Hybond N尼龍膜(GE Healthcare)上。然后，使用DIG標記的用于克隆基因座DNA的基因片段作為探針，進行檢測。從分析的3個克隆中，選擇了克隆C2和C3，因為它們明顯顯示出由于插入的標記基因而造成的更長的條帶。通過流式細胞術，確認了所選定的克隆如載體設計所預期的那樣不產生抗體(圖11A)。因此，基于細胞表面缺少抗體表達，可以通過選擇已實現了外源基因打靶的細胞，來高效制備導入了目的外源基因的細胞。(表達小鼠抗體重鏈可變區)當如前所述(Kanayama,N.等人，B i o chem. B i ophy s Re s Commun. 327, 70-75(2005))用50nM 4-羥泰米芬處理這些細胞時，通過流式細胞術發現在細胞表面具有恢復的IgM抗體表達的細胞(圖11B)，且所述細胞缺少藥物抗性。與該結果一致的是，在Southern印跡分析中可見由于缺少藥物抗性基因造成的條帶遷移(圖10D)。用VHT⑶R3-特異性抗獨特型大鼠單克隆抗體(R2. 438 ;由T. Imanishi-Kari博士提供)染色細胞(Kanayama, N.等人，J. Immunol. 169，6865-6874(2002))(圖 11C)。觀察到的染色強度與用作陽性對照的整合了 VHT的小鼠B細胞的強度是可比較的。因此，證實了細胞表達整合到DT40-SW中的VHT基因。在開啟抗體表達后，通過有限稀釋亞克隆C2和C3克隆。還通過流式細胞術分析亞克隆的細胞的細胞表面抗體表達(圖11D)。從每個克隆分離RNA，并從RNA制備cDNA。基因片段使用引物通過PCR擴增。通過測序分析評估可變區基因和恒定區基因之間的剪接。結果證實，附接在可變區基因的3’端的剪接位點如設計地那樣在執行功能，因此可變區基因的外顯子和恒定區基因的外顯子如預期地彼此連接。換言之，證實了通過上述方法導入的外源抗體重鏈可變區基因可以正常地轉錄和翻譯，從而表達為與雞抗體重鏈恒定區的嵌合抗體。雖然驗證了表面的抗體表達，但表達水平略低于野生型。這提示因為輕鏈源自雞抗體，所以嵌合抗體的表達效率降低。可能的解決方案是用對應于外源抗體重鏈的輕鏈取代所述輕鏈。
(向小鼠抗體重鏈可變區中導入突變)為了分析所制備的VHT表達細胞的VHT基因中的突變，通過使用之前報道過的方法(Kanayama, N.等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 327，70-75 (2005))開啟 AID 基因表達，激活細胞的突變機制。在用4-羥泰米芬處理細胞后，通過流式細胞儀以單細胞分離GFP+細胞(即，對突變關鍵性的AID表達被開啟的細胞)，并培養30天。
從培養的細胞中分離基因組DNA。使用引物CVH1F2 (5’ -GGCGGCTCCGTCAGCGCTCTCT-3’ ；SEQ ID N0:25)和CJH1R2(5’-GCCGCAAATGATGGACCGAC-3’ ；SEQ ID NO:26)，通過PCR擴增重鏈可變區，并將其克隆到pCR-Blunt載體中。通過測序分析克隆。在C2和C3克隆中觀察到突變的頻率(圖12B和C)可與野生型DT40-SW中的突變頻率相比較(圖12A)。換言之，驗證了上述方法可用于導入突變，由此對導入到DT40的雞重鏈可變區基因座中的任意外源抗體的可變區基因進行修飾。可以通過使用VH打靶載體2產生相同的效應。(導入小鼠抗體輕鏈可變區基因)從上述生產抗NP IgM抗體的雜交瘤的總RNA中制備cDNA。使用cDNA作為模板，與針對 \ I 輕鏈可變區基因的有義引物 mIgVL51(5’-ACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCT-3’ ；SEQ ID NO:27)和反義引物mIgVL133 (5’ -GTTCTAGACACTCACCTAGGACAGTCAGTTTGGTTCCT-3’ ；SEQ ID NO: 28) 一起，擴增入I可變區基因片段。然后，用XbaI消化片段，并插入到VL打靶載體I的HpaI-SpeI位點中。將15微克載體通過用SacI消化線性化，并通過電穿孔導入到如上所述制備的表達小鼠VHT的克隆C2中。和重鏈的情況一樣，對于來自在滅瘟素S選擇下形成的克隆(45個克隆)的細胞，通過流式細胞術評估細胞表面的抗體表達。通過選擇缺少抗體表達的細胞，獲得了 10個陽性克隆。從這10個克隆中選擇5個克隆，并從細胞中提取基因組DNA。使用下列上游引物IgLU-up(5，-TGCCTGGGGTAAGGGTAGTACTCTGTGC-3’ ；SEQ ID NO:29)和 cJL12(5，-AACGGTAGGGGATCCGAGACTAG-3’ ；SEQ ID NO:30)，和下列下游引物BSR1(5，-GAGAAAGGTAGAAGACCCCAAGGACTITCCTTCAGAATTGC-3’ ；SEQ ID NO:31)和cCL3 (5，-GCAGAGTCAGCACTAGTTCAGTGTCGTGTT-3，；SEQ ID NO:32)，通過PCR評估打靶載體的整合(圖13B)。此外，使用PCR評估針對從VJ重組生成的、并產生的抗體等位基因的打靶，使用引物CVLF6(5，-CAGGAGCTCGCGGGGCCGTCACTGATTGCCG-3’ ；SEQ ID NO:33)和 CVLR3(5，-GCGCAAGCTTCCCCAGCCTGCCGCCAAGTCCAAG-3’ ；SEQ ID NO:34)(圖 13C)。在成功打靶的細胞中觀察到了 PCR產物的特異性擴增(圖13B)。此外，以由于整合到產生抗體的等位基因中而導致的條帶損失作為指標來選擇克隆(圖13C)。結果顯示，在所有的克隆中都實現了用目的基因在期望位置的打靶。此外，證實了細胞表面抗體表達作為篩選目的細胞的指標是非常有效的。(表達抗體輕鏈可變區基因)在導入小鼠X I到具有小鼠VHT的C2中所制備的細胞中，使用了 B4克隆進行下列實驗。和重鏈的情況一樣，當用4-羥泰米芬處理這些細胞時，通過流式細胞術發現在細胞表面具有恢復的IgM抗體表達的細胞，并且所述細胞缺少藥物抗性(圖14)。此外，將抗體表達被開啟的B4進行有限稀釋，并通過流式細胞術評估細胞中的小鼠X I鏈可變區的表達。用預期結合小鼠、鏈可變區的生物素化大鼠單克隆抗體(抗-IgXl、X2和入3輕鏈；克隆R26_46;BD Bioscience)處理細胞，然后用藻紅蛋白標記的鏈霉親和素將其可視化。結果顯示，細胞表達小鼠 ' 鏈可變區(圖15)。用抗獨特型抗體也檢測到了 VHT的表達。因此，可認為導入的小鼠抗體重鏈和輕鏈在細胞表面彼此結合地表達。從每個克隆分離RNA，并從RNA制備cDNA。通過PCR擴增和測序分析所擴增的基因片段，驗證導入的可變區基因和恒定區基因之間的剪接。使用引物mIgVL51和cCL3評估嵌合輕鏈基因的mRNA的生成，而使用引物cVLl和cCL3評估內源性IgL基因的mRNA生成。對克隆B4僅擴增了嵌合的輕鏈cDNA。該結果證實了附接于外源可變區基因的3’端的剪接位點如設計的那樣發揮功能，由此可變區基因和恒定區基因的外顯子如預期的那樣彼此連接(圖16)。使用“actin3”(5’-CTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGCCAGC-3’ ；SEQ ID NO:35)和“actin4”(5，-TTCATGAGGTAGTCCGTCAGGTCACGGCCA-3’ ；SEQ ID NO:36)擴增P -肌動蛋白基因，作為內標。測序分析揭示了在剪接連接處發生了精確的剪接。使用ELISA，測定導入了小鼠VHT/入I的B4克隆的培養上清液中的分泌抗體。用山羊抗雞IgM抗體(Bethyl)包被96孔板。使用HRP-標記的山羊抗雞IgM抗體(Bethyl)，將培養上清液中生產的抗體的量與DT40-SW生產的抗體量比較。結果顯示細胞以可與DT40-SW相比較的水平生產抗體(圖17A)。此外，通過前述方法將NP 與牛血清白蛋白綴合(Kanayama, N.,等人，J. Immunol. 169，6865-6874(2002)),用該綴合物作為抗原包被96孔板。使用HRP-標記的山羊抗雞IgM抗體檢測培養上清液中的抗體的抗原結合。產生VHT/ A I抗體的克隆B4的培養上清液表現出與NP綴合抗原的結合，與陽性對照情況相似(圖17B)，陽性對照使用HRP-標記的山羊抗小鼠IgM抗體(Vector)分析產生小鼠抗NP IgM抗體的雜交瘤的上清液。同時，由DT40-SW生產的抗體不結合NP綴合抗原。因此，證實了克隆B4產生NP特異性抗體。換言之，顯示了通過上述方法導入的外源抗體重鏈可變區基因可以正常地轉錄和翻譯成為與雞抗體輕鏈恒定區的嵌合抗體。此外，本發明人成功的制備了這樣的DT40細胞，其表達保留原始功能的嵌合抗體，其中重鏈和輕鏈可變區都被小鼠來源的外源抗體的相應區域取代。(向小鼠抗體輕鏈可變區中導入突變)用4-羥泰米芬處理表達小鼠VHT/ X I的B4和B7克隆的細胞。然后，通過流式細胞術按單細胞分離GFP+細胞(即，對誘變至關重要的AID的表達被開啟的細胞)，并培養30天。從培養的細胞中分離基因組DNA。使用引物CVLF6(SEQ ID NO: 37)和CVLR3 (SEQ IDNO: 38)，通過PCR擴增輕鏈可變區，將其克隆到pCR-Blunt載體中并測序。在B4和B7克隆中觀察到突變的頻率可與野生型DT40-SW中的突變頻率相比較(圖18)。換言之，驗證了上述方法可用于導入突變，由此對導入到DT40的雞輕鏈可變區基因座中的任意外源抗體的可變區基因進行修飾。可以通過使用VL打靶載體2產生相同的效應。(5)導入雞抗體輕鏈可變區如下所述制備DT40的抗體輕鏈可變區基因。自從未開啟過突變機制的DT40-SW的總RNA中合成cDNA。使用該cDNA作為模板，與有義引物(cVLl: 5’ -ACTCAGCCGTCCTCGGTGTCAGCAAACCCGGGA-3’ ；SEQ ID NO:48)和具有 SpeI 位點的反義引物(c.TLl: 5’-CGAGACTAGTTCAGCGACTCACCTAGGACGGTCAG-3’ ；SEQ ID NO:49) —起通過 PCR擴增雞抗體輕鏈可變區(cVL)。用SpeI消化所獲得的PCR片段，將其插入到VL打靶載體I的HpaI-SpeI位點中(圖28A)。通過SacI消化將載體線性化，通過電穿孔導入到DT40-SW細胞中。在電穿孔后，用終濃度為20微克/ml的滅瘟素S進行選擇。用藻紅蛋白標記的抗雞IgM小鼠單克隆抗體染色形成集落的細胞(54個克隆)，并使用FACS Calibur分析。為了獲得被打靶的細胞，用抗雞IgM抗體染色來選擇變得不能表達抗體重鏈的細胞(3個克隆)。為了在基因水平評估這些克隆，從細胞中提取基因組DNA，并通過使用引物對IgLU-up和cJLl2，以及BSRl和cCL3進行PCR來測試打靶載體的整合(圖28B)。此外，使用引物CVLF6和CVLR3進行PCR來評估針對由于VJ重組而產生的等位基因的打靶(圖28C)。結果顯示，在所有的克隆中均實現了使用目的基因的打靶。從中選擇C2克隆。如上所述，當用4-羥泰米芬處理這些克隆時，通過流式細胞術發現在細胞表面上具有恢復的IgM抗體表達的細胞(圖29)。 此外，從開啟了抗體表達的細胞中，通過流式細胞術按單細胞分離GFP+細胞(即，對誘變至關重要的AID的表達被開啟的細胞)，并培養30天。從培養的細胞中分離基因組DNA。使用引物CVLF6和CVLR3，通過PCR擴增輕鏈可變區，將其克隆到pCR-Blunt載體中并 測序。在導入的雞抗體輕鏈可變區基因中觀察到突變的頻率可與野生型DT40-SW中的突變頻率相比較(圖30)。換言之，驗證了通過上述方法以與野生型基因中可比較的突變頻率向DT40的雞輕鏈可變區基因中導入了突變。工業實用性本發明提供了用于向抗體生產細胞的抗體可變區基因的基因座中導入編碼期望的氨基酸序列的DNA的打靶載體。根據本發明，可以通過將編碼包含期望的氨基酸序列的多肽的DNA導入到抗體生產細胞的抗體可變區基因的基因座中，在特定條件下產生期望的多肽。此外，可以利用抗體生產細胞導入突變的能力來產生導入了突變的多肽。本發明可用于多肽的功能性修飾。
權利要求
1.一種將DNA構建體與抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域同源重組的方法，包括將包含DNA構建體的打靶載體導入抗體生產細胞中的步驟，所述DNA構建體包含 (1)在所述細胞中執打功能的啟動子DNA； (2)編碼期望的氨基酸序列的DNA;和 (3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的 DNA。
2.權利要求I的方法，其中(3)的DNA抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間，且其中⑶的DNA包含在細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因，且(3)的DNA能夠通過位點特異性重組酶從所述DNA構建體中被去除。
3.選擇細胞的方法，包括下述步驟 (a)通過向抗體生產細胞中導入包含DNA構建體的打靶載體而允許DNA構建體與抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間同源重組，所述DNA構建體包含 (1)在所述細胞中執打功能的啟動子DNA； (2)編碼期望的氨基酸序列的DNA;和 (3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的DNA ;和 (b)選擇其中在所述DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間已發生同源重組的細胞。
4.權利要求3的方法，其中(3)的DNA抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間，且其中⑶的DNA包含在細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因，且(3)的DNA能夠通過位點特異性重組酶從DNA構建體中被去除。
5.一種制備產生多肽的抗體生產細胞的方法，包括下述步驟 (a)通過向抗體生產細胞中導入包含DNA構建體的打靶載體而允許DNA構建體與抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間同源重組，所述DNA構建體包含 (1)在所述細胞中執打功能的啟動子DNA； (2)編碼期望的氨基酸序列的DNA;和 (3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的 DNA ； (b)選擇其中在DNA構建體與抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間已發生同源重組的細胞；和 (c)從步驟(b)中選擇的細胞的基因組DNA中去除(3)的DNA。
6.權利要求5的方法，其中(3)的DNA抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間，且其中⑶的DNA包含在細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因，且(3)的DNA能夠通過位點特異性重組酶從所述DNA構建體中被去除。
7.權利要求5的方法，其中步驟(a)至(C)定義如下(a)通過向抗體生產細胞中導入包含DNA構建體的打靶載體而允許DNA構建體與抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間同源重組，所述DNA構建體包含 (1)在所述細胞中執打功能的啟動子DNA； (2)編碼期望的氨基酸序列的DNA;和 (3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA，該DNA包含在所述細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因，并且能夠通過位點特異性重組酶從所述DNA構建體中被去除； (b)選擇其中在所述DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間已發生同源重組的細胞；和 (c)通過使位點特異性重組酶在步驟(b)中選擇的細胞的基因組中的位點特異性重組酶識別序列處反應而從該細胞的基因組DNA中去除所述位于兩個按相同方向排列的位點 特異性重組酶識別序列之間的DNA。
8.權利要求5至7中任一項的方法，其中所產生的多肽被展示在所述細胞的表面上，和/或被分泌到所述細胞外。
9.權利要求4、6和7中任一項的方法，其中利用所述標記基因的表達作為指標來選擇所述細胞。
10.權利要求3、4、6、7和9中任一項的方法，其中利用所述抗體生產細胞中內源性抗體表達的缺失作為指標來選擇所述細胞。
11.一種制備產生導入了突變的多肽的抗體生產細胞的方法，包括下述步驟 (a)通過向表達AID基因的抗體生產細胞中導入包含DNA構建體的打靶載體而允許DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間同源重組，所述DNA構建體包含 (1)在所述細胞中執打功能的啟動子DNA； (2)編碼期望的氨基酸序列的DNA;和 (3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的 DNA ； (b)選擇其中在所述DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間已發生同源重組的細胞；和 (c)從步驟(b)中選擇的細胞的基因組DNA中去除(3)的DNA。
12.權利要求11的方法，其中步驟(a)至(c)定義如下 (a)通過向表達AID基因的抗體生產細胞中導入包含DNA構建體的打靶載體而允許DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間同源重組，所述DNA構建體包含 (1)在所述細胞中執打功能的啟動子DNA； (2)編碼期望的氨基酸序列的DNA;和 (3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA，該DNA包含在所述細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因，并且能夠通過位點特異性重組酶從該DNA構建體中被去除； (b)選擇其中在所述DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間已發生同源重組的細胞；和 (C)通過使位點特異性重組酶在步驟(b)中選擇的細胞的基因組中的位點特異性重組酶識別序列處反應而從該細胞的基因組DNA中去除位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA。
13.一種制備產生導入了突變的多肽的抗體生產細胞的方法，包括下述步驟 (a)通過向抗體生產細胞中導入包含DNA構建體的打靶載體而允許DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間同源重組，所述抗體生產細胞中AID基因表達能夠被人為開啟和關閉，所述DNA構建體包含 (1)在所述細胞中執打功能的啟動子DNA； (2)編碼期望的氨基酸序列的DNA;和 (3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的 DNA ； (b)選擇其中在所述DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間已發生同源重組的細胞；和 (c)從步驟(b)中選擇的細胞的基因組DNA中去除(3)的DNA; (d)開啟和關閉AID基因表達；和 (e)選擇表達AID基因的細胞。
14.權利要求13的方法，其中步驟(a)至(e)定義如下 (a)通過向抗體生產細胞中導入打祀載體而允許DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間同源重組，其中所述打靶載體包含DNA構建體，所述DNA構建體包含 (1)在所述細胞中執打功能的啟動子DNA； (2)編碼期望的氨基酸序列的DNA;和 (3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA，該DNA包含在所述細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因，并且能夠通過位點特異性重組酶從該DNA構建體中被去除，其中該抗體生產細胞中的內源性AID基因被功能性破壞，且抗體生產細胞包含這樣的DNA構建體，所述DNA構建體包含 在所述細胞中執行功能的啟動子DNA, 位于兩個按相反方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA，該DNA能夠通過位點特異性重組酶倒位，并包含外源性AID基因； (b)選擇其中在所述DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間已發生同源重組的細胞； (c)通過使位點特異性重組酶在步驟(b)中選擇的細胞的基因組中的位點特異性重組酶識別序列處反應而從該細胞的基因組DNA中去除所述位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA ； (d)通過使位點特異性重組酶在步驟(b)中選擇的細胞的基因組中的位點特異性重組酶識別序列處反應而使所述位于兩個按相反方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA倒位，以開啟和關閉AID基因表達；和(e)選擇表達AID基因的細胞。
15.權利要求13的方法，其中步驟(a)至(e)定義如下 (a)通過向抗體生產細胞中導入打祀載體而允許DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間同源重組， 其中所述抗體生產細胞中內源性AID基因被功能性破壞，且該抗體生產細胞包含 DNA構建體，其包含 在所述細胞中執打功能的啟動子DNA,和 位于兩個按相反方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA，該DNA能夠通過 位點特異性重組酶倒位，并包含外源性AID基因，和 包含在細胞中執行功能的啟動子DNA和編碼所述位點特異性重組酶的DNA的DNA構建體， 其中在所述抗體生產細胞中，所述位點特異性重組酶在存在胞外刺激的條件下活化，而在沒有該胞外刺激的條件下不活化， 其中所述打靶載體包含DNA構建體，所述DNA構建體包含 (1)在所述細胞中執打功能的啟動子DNA； (2)編碼期望的氨基酸序列的DNA;和 (3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA，該DNA包含在所述細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因，并且能夠通過所述位點特異性重組酶從該DNA構建體中被去除； (b)選擇其中在所述DNA構建體與所述抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域之間已發生同源重組的細胞； (c)通過對步驟(b)中選擇的細胞的胞外刺激活化位點特異性重組酶的活性，使所述位點特異性重組酶在該細胞的基因組中的位點特異性重組酶識別序列處反應，藉此從該細胞的基因組DNA中去除所述位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的 DNA ； (d)通過對步驟(b)選擇中細胞的胞外刺激活化位點特異性重組酶的活性，使所述位點特異性重組酶在該細胞的基因組中的位點特異性重組酶識別序列處反應，藉此使所述位于兩個按相反方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA倒位，以開啟和關閉AID基因表達；和 (e)選擇表達AID基因的細胞。
16.權利要求11至15中任一項的方法，其中所產生的導入了突變的多肽被展示在所述細胞表面上和/或分泌到所述細胞之外。
17.權利要求11至16中任一項的方法，其中在步驟(b)中利用所述標記基因的表達作為指標選擇所述細胞。
18.權利要求11至17中任一項的方法，其中在步驟(b)中利用抗體生產細胞中內源性抗體表達的缺失作為指標選擇所述細胞。
19.權利要求15的方法，其中所述位點特異性重組酶是位點特異性重組酶與雌激素受體或包含其雌激素結合結構域的蛋白質的融合蛋白；且其中由能夠結合雌激素結合結構域的配體充當所述胞外刺激。
20.權利要求19的方法，其中所述雌激素受體或其雌激素結合結構域是小鼠突變型雌激素受體，其中氨基酸第525位的甘氨酸被精氨酸取代；或者是其小鼠突變型雌激素結合結構域；且其中所述能夠結合雌激素結合結構域的配體是4-羥泰米芬。
21.權利要求11至20中任一項的方法，其中所述抗體生產細胞具有下列特性 (a)在該抗體生產細胞中，XRCC3基因的兩個等位基因中僅一個是失活的；和 (b)與具有XRCC3基因的兩個等位基因的細胞相比，導入點突變的頻率是升高的。
22.權利要求21的方法，其中在XRCC3基因的兩個等位基因的任一個中，第6個外顯子是失活的。
23.權利要求11至22中任一項的方法，其中該抗體生產細胞是B細胞。
24.權利要求23的方法，其中所述B細胞源自雞。
25.權利要求2、4、6、7、9、10、12、14和15中任一項的方法，其中所述位點特異性重組酶和位點特異性重組酶識別序列的組合是下列⑴或(ii) (i)所述位點特異性重組酶是Cre重組酶，且所述位點特異性重組酶識別序列是IoxP序列； ( )所述位點特異性重組酶是FLP重組酶，且所述位點特異性重組酶識別序列是FRT序列。
26.權利要求I至25中任一項的方法，其中所述包含期望的氨基酸序列的多肽包含抗體恒定區的氨基酸序列和期望的氨基酸序列。
27.權利要求26的方法，其中所述期望的氨基酸序列是抗體可變區的氨基酸序列。
28.權利要求I至25中任一項的方法，其中所述包含期望的氨基酸序列的多肽是抗體重鏈或輕鏈。
29.一種用于產生編碼多肽或導入了突變的多肽的DNA的方法，包括下述步驟 (a)通過權利要求5-8和11-24中任一項的方法制備產生多肽或導入了突變的多肽的抗體生產細胞；和 (b)從步驟(a)制備的抗體生產細胞中分離編碼所述多肽或導入了突變的多肽的DNA。
30.一種用于產生多肽或導入了突變的多肽的方法，包括下述步驟 (a)通過權利要求5-8和11-24中任一項的方法制備產生多肽或導入了突變的多肽的抗體生產細胞；和 (b)從步驟(a)生產的抗體生產細胞中或從來自所述細胞的分泌產物中分離所述多肽或導入了突變的多肽。
31.產生多肽或導入了突變的多肽的方法，包括下述步驟 (a)通過權利要求29的方法產生編碼多肽或導入了突變的多肽的DNA;和 (b)分離由步驟(a)生產的DNA編碼的多肽。
32.抗體生產細胞，其中包含編碼抗體可變區的DNA的區域與DNA構建體同源重組，所述DNA構建體包含 (1)在所述細胞中執打功能的啟動子DNA； (2)編碼期望的氨基酸序列的DNA;和 (3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并能夠從該DNA構建體中被去除的 DNA。
33.權利要求32的細胞，其中(3)的DNA是這樣的DNA:其抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產生，并位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間，且其包含在細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因，并能夠通過位點特異性重組酶從所述DNA構建體中被去除。
34.權利要求32或33的細胞，其中所述抗體生產細胞表達AID基因。
35.權利要求32或33的細胞，其中所述抗體生產細胞是其中AID基因表達能夠被人為開啟和關閉的細胞。
36.權利要求35的細胞，其中內源性AID基因被功能性破壞，且該細胞包括這樣的DNA構建體，所述DNA構建體包含 在所述細胞中執打功能的啟動子DNA ;和 位于兩個按相反方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間的DNA，該DNA能夠通過 位點特異性重組酶倒位，并且包含外源性AID基因。
37.權利要求36的細胞，其中所述抗體生產細胞還包含如下所述的DNA構建體，該DNA構建體包含在所述細胞中執行功能的啟動子DNA和編碼位點特異性重組酶的DNA，其中該位點特異性重組酶在存在胞外刺激的條件下活化，而在缺少該胞外刺激的條件下不活化。
38.權利要求37的細胞，其中所述位點特異性重組酶是位點特異性重組酶與雌激素受體或包含其雌激素結合結構域的蛋白質的融合蛋白。
39.權利要求38的細胞，其中雌激素受體或其雌激素結合結構域是小鼠突變型雌激素受體，其中氨基酸第525位的甘氨酸被精氨酸取代；或者是其小鼠突變型雌激素結合結構域。
40.權利要求32至39中任一項的細胞，其中所述抗體生產細胞具有下列特性 (a)在所述抗體生產細胞中，XRCC3基因的兩個等位基因中僅一個是失活的；和 (b)與具有XRCC3基因的兩個等位基因的細胞相比，導入點突變的頻率是升高的。
41.權利要求40的細胞，其中在XRCC3基因的兩個等位基因的任一個中，第6個外顯子是失活的。
42.權利要求32至41中任一項的細胞，其中所述抗體生產細胞是B細胞。
43.
44.權利要求33和36-39中任一項的細胞，其中所述位點特異性重組酶和位點特異性重組酶識別序列的組合是下列(i)或(ii): (i)所述位點特異性重組酶是Cre重組酶，且所述位點特異性重組酶識別序列是IoxP序列； (ii)所述位點特異性重組酶是FLP重組酶，且所述位點特異性重組酶識別序列是FRT序列。
45.權利要求32至44中任一項的細胞，其中所述包含期望的氨基酸序列的多肽包含抗體恒定區的氨基酸序列和期望的氨基酸序列。
46.權利要求45的細胞，其中所述期望的氨基酸序列是抗體可變區的氨基酸序列。
47.權利要求32至44中任一項的細胞，其中所述包含期望的氨基酸序列的多肽是抗體重鏈或輕鏈。
48.包含權利要求32至47中任一項的細胞的試劑盒。
49.一種包含DNA構建體的基因打靶載體，所述構建體包含 (1)在所述細胞中執打功能的啟動子DNA； (2)包含克隆位點的DNA;和 (3)如下所述的DNA:其能夠從所述DNA構建體中被去除，并抑制由插入到 (2)的DNA中的DNA編碼的、包含期望的氨基酸序列的多肽的產生； 其中所述基因打靶載體用于將所述DNA構建體與抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域同源重組。
50.權利要求49的載體，其中(3)的DNA是如下所述的DNA:其能夠通過位點特異性重組酶從所述DNA構建體中被去除，并抑制由插入到(2)的DNA中的DNA編碼的、包含期望的 氨基酸序列的多肽的產生，且其位于兩個按相同方向排列的位點特異性重組酶識別序列之間，并包含在細胞中執行功能的啟動子DNA和標記基因。
51.權利要求49或50的載體，其中編碼期望的氨基酸序列的DNA插入到所述克隆位點中。
52.權利要求49-51中任一項的載體，其中所述包含期望的氨基酸序列的多肽包含抗體恒定區的氨基酸序列和期望的氨基酸序列。
53.權利要求52的載體，其中所述期望的氨基酸序列是抗體可變區的氨基酸序列。
54.權利要求49-51中任一項的載體，其中所述包含期望的氨基酸序列的多肽是抗體重鏈或輕鏈。
55.包含權利要求49-54中任一項的打靶載體的細胞。
56.包含權利要求49-54中任一項的打靶載體的試劑盒。
57.包含SEQID NO:7的核苷酸序列的DNA。
58.包含權利要求57的DNA的載體。
59.包含權利要求57的DNA或權利要求58的載體的細胞。
全文摘要
本發明的目標是提供將編碼期望的氨基酸序列的DNA導入到抗體生產細胞的包含編碼抗體可變區的DNA的區域中的方法。本發明人研發了用于將編碼期望的氨基酸序列的DNA高效地導入DT40-SW的抗體可變區基因座的方法，DT40-SW是DT40雞B細胞系的突變株，具有自發導入突變的能力。這允許誘變所導入的DNA，以修飾多肽使其具有更好的功能。特別是，本發明人揭示了DT40細胞系的抗體H鏈可變區基因座的核苷酸序列。基于該發現，本發明人成功地構建了打靶載體，所述打靶載體允許高效地利用編碼期望的多肽的基因取代DT40細胞系的抗體H鏈可變區基因座。
文檔編號C07K19/00GK102762728SQ201080061858
公開日2012年10月31日 申請日期2010年11月18日 優先權日2009年11月19日
發明者大森齊, 藤井忍, 金山直樹 申請人:株式會社免疫工學研究所