疫苗組合物的制作方法

專利名稱：疫苗組合物的制作方法
疫苗組合物本申請要求于2009年12月22日提交的美國臨時申請第61/289，083號的優先權，其通過參考以其整體并入本文。領域本公開內容涉及疫苗組合物，特別是KLH-肽共軛物，以及制造這樣的組合物的方法。本公開內容還涉及使用本文描述的組合物減少異常細胞生長的方法。背景
⑶X-110正被開發用于治療患有多形性成膠質細胞瘤(一種腦癌)的患者。患有該疾病的患者中相當多的一部分在他們的癌細胞表面上表達表皮生長因子受體(EGFR)的變體。這種變體，被稱為EGFRvIII，由在癌細胞表面上導致獨特的肽序列(通常具有13個氨基酸)的接合變異(splice mutation)形成。由于這種變體不在正常細胞上表達，因此EGFRvIII序列是用于抗癌治療的良好的靶標。EGFR是已被充分證實作為癌癥治療的靶標的蛋白。然而，與EGFR不同，EGFRvIII不存在于正常組織中，這表明該靶標將使能夠開發用于癌癥患者的腫瘤特異性的治療。此夕卜，EGFRvIII是可直接促進癌細胞生長的轉化致癌基因(transforming oncogene)。雖然最初發現于最常見的和侵略性的形式的腦癌，多形性成膠質細胞瘤(GBM)，但EGFRvIII的表達還在多種其他癌癥中觀察到，例如乳腺癌、卵巢癌、轉移性前列腺癌、結腸直腸癌和頭頸癌。⑶X-110是通過將EGFRvIII肽共價連接至載體蛋白鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)而形成的共軛疫苗(conjugate vaccine)(參見，例如美國專利號5，401，828、6，224，868 ;和WO2007/056061)，C-端半胱氨酸已被添加至所述EGFRvIII蛋白。KLH還作為免疫刺激物以增強對EGFRvIII肽的免疫響應。EGFRvIII肽與KLH之間的化學鍵通過使用雙官能的連接基，磺基琥珀酰亞胺基4-[N-馬來酰亞胺甲基]環己烷-I-羧酸酯(Sulf0-SMCC)，而實現。先前用于生產⑶X-110及其制劑的工藝對于在商業環境中使用具有一些缺陷。例如，這樣的缺陷包括缺乏連接基(SMCC)的完全的溶解性，導致了難以控制的反應；不可接受的水平的過程中雜質；經不起放大規模的工藝方法的檢驗；對關鍵生物物理學特性缺乏足夠的控制，例如肽KLH載體的比例、尺寸不均勻性、顆粒和凝膠形成和產品不穩定性。KLH是很大的載體蛋白，其先前已被證實非常難以按照高藥物標準來共軛和配制。因此，存在對于提供了解決這樣的缺陷的KLH-肽共軛物的組合物的改進的制造方法和制劑的需求。概要本公開內容的其他特征和優勢將從以下的詳細描述和實施例中變得明顯，這些描述和實施例不應當被理解為限制性的。整個公開內容中引證的所有參考、圖、Genbank項目、專利和公布的專利申請的內容將特別地通過引用整體并入本文。在一方面中，本公開內容提供了一種包含KLH-肽共軛物、磷酸鉀緩沖液、二糖和表面活性劑的組合物。在一個實施方案中，磷酸鉀緩沖液以5mM至30mM的濃度存在，例如5mM 至 20mM、5mM 至 15mM、7mM 至 13mM、8mM 至 12mM、9mM 至 llmM、或 9. 5mM 至 10. 5mM。在另一個實施方案中，磷酸鉀緩沖液以IOmM的濃度存在。在進一步的實施方案中，存在的磷酸鉀緩沖液的濃度為使得在40°C下12周后，在所述組合物中的所述KLH-肽共軛物的濃度，以mg/mL測定，當與原始濃度比較時改變了少于15%。在進一步的實施方案中，在組合物中的二糖是海藻糖。在一個實施方案中，海藻糖以 45mg/mL 至 150mg/mL、70mg/mL 至 120mg/mL、80mg/mL 至 100mg/mL、或 85mg/mL 至 95mg/mL的濃度存在。在另一個實施方案中，海藻糖以90mg/mL的濃度存在。在另一個實施方案中，存在的海藻糖的濃度為使得在40°C下12周后，在所述組合物中的所述KLH-肽共軛物的濃度，以mg/mL測定，當與原始濃度比較時改變了少于15%。在進一步的實施方案中，在組合物中的表面活性劑是聚山梨醇酯80。例如，在一個實施方案中，聚山梨醇酯 80 以 O. 01mg/mL 至 O. 3mg/mL、0. 05mg/mL 至 O. 25mg/mL、 0. lmg/mL至O. 25mg/mL、或O. 15mg/mL至O. 25mg/mL的濃度存在。在一個實施方案中，聚山梨醇酯80以O. 2mg/mL的濃度存在。在進一步的實施方案中，存在的聚山梨醇酯80的濃度為使得在40°C下12周后，在所述組合物中的所述KLH-肽共軛物的濃度，以mg/mL測定，當與原始濃度比較時改變了少于15%。在一方面中，本公開內容提供了如本文所述的任何組合物，其中在所述KLH-肽共軛物中共軛至KLH的肽包括SEQ ID NO :1，主要由SEQ ID NO 1組成或由SEQ ID NO 1組成。在進一步的實施方案中，在所述KLH-肽共軛物中共軛至KLH的肽包括SEQ ID N0:2，主要由SEQ ID NO :2組成或由SEQ ID NO :2組成。在一個實施方案中，所述肽采用Sulfo-SMCC連接基共軛至KLH。在一個實施方案中，本公開內容提供了本文所述的任何KLH-肽組合物，其中表位密度為20至80。例如，在一個實施方案中，表位密度為25至75、25至70、25至65、30至60,30至55,35至50,40至50。在進一步的實施方案中，表位密度為25、26、27、28、29、30、
31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、或 60。在進一步的方面中，本公開內容提供了本文所述的任何組合物，其中以二聚體形式存在的KLH-肽共軛物的量為按質量計所述組合物的總質量的45%至65%，如通過尺寸排阻色譜法測定的。例如，在一個實施方案中，該二聚體形式為按質量計50%至60%、51%至59%、52%至58%、53%至57%、或54%至56%。在進一步的實施方案中，二聚體形式的KLH-肽共軛物的量為按質量計所述組合物的總質量的51 %、52 %、53 %、54 %、55 %、56 %、57%、58%、59%、或60%，如通過尺寸排阻色譜法測定的。在進一步的實施方案中，二聚體形式的KLH-肽共軛物的量為按質量計大于所述組合物的總質量的80%，如通過尺寸排阻色譜法測定的。例如，在一個實施方案中，二聚體形式的量為按質量計大于85%、大于90%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%、或大于99%。在進一步的方面中，本公開內容提供了本文所述的任何組合物，其中當經受尺寸排阻色譜法以及通過UV吸收檢測時，對應于二聚體形式的KLH-肽共軛物的峰為45%至65%的曲線下總面積。例如，在一個實施方案中，對應于二聚體形式的峰為50%至60%、51%至59%、52%至58%、53%至57%、或54%至56%的曲線下總面積。在進一步的實施方案中，對應于二聚體形式的峰為 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、或60%的曲線下總面積。在進一步的實施方案中，對應于二聚體形式的峰為大于80%的曲線下總面積。例如，在一個實施方案中，對應于二聚體形式的峰為大于85%、大于90%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%、或大于99%的曲線下總面積。在進一步的方面中，本公開內容提供了本文所述的任何組合物，其中以單體形式存在的KLH-肽共軛物的量為按質量計所述組合物的總質量的15%至40%，如通過尺寸排阻色譜法測定的。例如，在一個實施方案中，二聚體形式為按質量計20%至35%、21%至34%、22%至33%、23%至32%、24%至31%或25%至30%。在進一步的實施方案中，單體形式的KLH-肽共軛物的量為按質量計所述組合物的總質量的18 %、19 %、20 %、21 %、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、2 9%、或30%，如通過尺寸排阻色譜法測定的。在進一步的實施方案中，單體形式的KLH-肽共軛物的量為按質量計大于所述組合物的總質量的80%，如通過尺寸排阻色譜法測定的。例如在一個實施方案中，單體形式的量為按質量計大于85%、大于90%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%、或大于99%。在進一步的方面中，本公開內容提供了本文所述的任何組合物，其中當經受尺寸排阻色譜法以及通過UV吸收檢測時，對應于單體形式的KLH-肽共軛物的峰為15%至40%的曲線下總面積。例如，在一個實施方案中，對應于單體形式的峰為20 %至35 %、21 %至34%、22%至33%、23%至32%、24%至31%、或25%至30%的曲線下總面積。在進一步的實施方案中，對應于單體形式的峰為18% ,19%,20%,21%,22%,23%,24%,25%,26%,27 %、28 %、29 %、或30 %的曲線下總面積。在進一步的實施方案中，對應于單體形式的峰為大于80%的曲線下總面積。例如，在一個實施方案中，對應于單體形式的峰為大于85%、大于90%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%、或大于99%的曲線下總面積。本公開內容進一步提供了本文所述的任何KLH-肽共軛物組合物，其中所述組合物為含水藥物組合物。在一個實施方案中，所述組合物的pH為6至8。在進一步的實施方案中，組合物的pH為6. 5至7. 5。在進一步的實施方案中，組合物的pH為6. 5、6. 6、6. 7、
6.8,6. 9,7. 0,7. 1,7. 2,7. 3,7. 4或7. 5。在進一步的實施方案中，pH的量為使得在40。。下12周后，在所述組合物中的所述KLH-肽共軛物的濃度，以mg/mL測定，當與原始濃度比較時改變了少于15%。在進一步的方面中，本公開內容提供了包含KLH-肽共軛物、磷酸鉀緩沖液、海藻糖和聚山梨醇酯80的液體組合物，其中共軛至KLH的所述肽包括SEQ ID NO :1或SEQ IDNO :2，主要由 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2 組成，或由 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2 組成；所述KLH-肽共軛物具有30至65的表位密度；所述緩沖液以9mM至IlmM的濃度存在；所述組合物的pH為7. 3至7. 5 ;所述海藻糖以85mg/mL至95mg/mL的濃度存在；所述聚山梨醇酯80以O. lmg/mL至O. 3mg/mL的濃度存在；且進一步地，其中以單體形式存在的KLH-肽共軛物的量為按質量計所述組合物的總質量的18%至35%，而以二聚體形式存在的KLH-肽共軛物的量為按質量計所述組合物的總質量的50%至65%，如通過尺寸排阻色譜法測定的。例如，在一個實施方案中，所述緩沖液以IOmM的濃度存在，所述組合物的pH為7. 4，所述海藻糖以90mg/mL的濃度存在，且聚山梨醇酯80以O. 2mg/mL的濃度存在。進一步地，例如，所述液體組合物通過與水重構凍干的組合物而制備。本公開內容還提供了包含以下、主要由以下組成或由以下組成的凍干的組合物KLH-肽共軛物、磷酸鉀緩沖液、二糖和表面活性劑。在一個實施方案中，所述凍干的組合物，當與水重構時，具有6至9的pH。在一個實施方案中，所述二糖是海藻糖并且所述表面活性劑是聚山梨醇酯80。在進一步的實施方案中，所述海藻糖以80至IlOmg每mg KLH-肽共軛物的量存在；并且聚山梨醇酯80以O. 01至O. 3mg每mg KLH-肽共軛物的量存在。在進一步的實施方案中，所述海藻糖以90mg每mg KLH-肽共軛物的量存在；并且聚山梨醇酯80以O. 2mg每mg KLH-肽共軛物的量存在。在一方面中，本公開內容提供了包含KLH-EGFRvIII共軛物的液體組合物，其中在40°C下12周后，在所述液體組合物中的所述共軛物的濃度，以mg/mL測定，當與原始濃度比較時改變了少于15%、少于13%、少于11%、少于10%、少于8%、或少于5%。在進一步的方面中，本公開內容提供了在需要其的哺乳動物中減少異常細胞生長的方法，包括以下步驟將本文公開的任何組合物施用于所述哺乳動物。在一個實施方案中，所述異常細胞生長是癌性的。在進一步的實施方案中，所述癌是成膠質細胞瘤。在進一步的方面中，本公開內容提供了在需要其的哺乳動物中減少異常細胞生長 的方法，包括以下步驟a)混合本文公開的任何組合物與佐劑；和b)將所得混合物施用于所述哺乳動物。在進一步的方面中，本公開內容提供了在需要其的哺乳動物中減少異常細胞生長的方法，包括將本文公開的任何組合物與至少一種佐劑組合施用。在一個實施方案中，所述佐劑是粒細胞巨噬細胞集落刺激因子。本公開內容還提供了在需要其的哺乳動物中減少異常細胞生長的方法，包括a)提供本文公開的任何凍干的組合物；b)將水添加至該凍干的組合物以提供重構的組合物；和c)將重構的組合物施用于所述哺乳動物。本公開內容還提供了在需要其的哺乳動物中減少異常細胞生長的方法，包括a)提供本文公開的任何凍干的組合物；b)將水添加至該凍干的組合物以提供重構的組合物；
c)混合該重構的組合物與佐劑組合物；和d)將所得混合物施用于所述哺乳動物。在一個實施方案中，所述佐劑是粒細胞巨噬細胞集落刺激因子。本公開內容還提供了本文公開的任何組合物在制造用于治療哺乳動物中的異常細胞生長的藥劑中的用途。本公開內容還提供了用于制備包含KLH-肽共軛物的凍干的組合物的工藝，包括使本文公開的任何液體組合物經受_20°C或更低、-30°C或更低、-40°C或更低、-50°C或更低、或_60°C或更低以及至真空條件的溫度。本公開內容還提供了制備液體組合物的工藝，包括將水添加至本文公開的任何凍干的組合物。本公開內容還提供了用于制備KLH-EGFRvIII共軛物的方法，包括a)使KLH與連接基結合并允許所述KLH和連接基相互作用30至60分鐘、35至55分鐘、40至50分鐘、或45分鐘的時間；和b)將包括SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2的肽、主要由SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2組成的肽或由SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2組成的肽添加至由步驟a)得到的活化的KLH產物以提供所述KLH-EGFRvIII共軛物。在一個實施方案中，步驟b)在切向流過濾系統中進行。在進一步的實施方案中，保留物流速(retentate flow rate)為10至 1000mL/min、例如 50 至 500mL/min、例如 100 至 SOOmT,/miη 且還例如 50mL/min、IOOmL/min、1 50mT,/mi η - 200mT,/mi n - 250mT,/mi n - 300mT,/mi n - 350mT,/mi n - 400mT,/mi n - 450mT,/mi n -或SOOmT ,/mi η n在一個實施方案中，所述連接基與KLH以75 I至325 I的連接基KLH摩爾比結合。例如，在一個實施方案中，所述連接基KLH摩爾比為100 I至300 1,150 I至250 I、或175 : I至225 : I。例如，在一個實施方案中，所述連接基KLH摩爾比為175 1,180 1,185 1,190 1,195 1,200 1,205 1,210 1,215 1,220 I、或 225 I。本公開內容還提供了包含KLH-EGFRvIII共軛物的液體組合物，其中在5°C下26周后，大于或等于 ο μ m的顆粒的數量，如通過USP〈788>測定的，增加了少于1000%、少于750%、少于500%、少于400%、少于300%、少于200%、或少于100%。本公開內容還提供了包含KLH-EGFRvIII共軛物的液體組合物，其中在5°C下26周后，大于或等于25 μ m的顆粒的數量，如通過USP〈788>測定的，增加了少于1000%、少于750%、少于500%、少于400%、少于300%、少于200%、或少于100%。附圖簡述圖I示出實施KLH-肽共軛反應的一個實例的通用工藝示意圖。圖2A示出在各種橫流試驗的活化反應期間使用的關鍵操作參數的概要。圖2B示出在各種橫流試驗中的初始滲濾步驟期間使用的關鍵操作參數的概要。圖2C示出在各種橫流試驗中的共軛步驟期間使用的關鍵操作參數的概要。圖3A、3B、3C和3D示出橫流過濾開發試驗的分析結果的概要。圖4A、4B和4C示出用于各種試驗的反應參數的概要。圖5示出CDX-I lOKLH-EGFRvII I共軛物的代表性的SEC HPLC譜圖，示出了 5個峰的大致保留時間。圖6示出指明Sulfo-SMCC比對表位密度的影響的圖。圖7示出指明活化時間對表位密度的影響的圖。圖8A( 二聚體)和8B (單體)示出指明Sulfo-SMCC比對SEC不均勻性的影響的圖。圖9A( 二聚體)和9B(單體)示出指明活化時間對SEC不均勻性的影響的圖。

圖10示出表位密度與連接基漿料和溶解于DMSO中的連接基的比較。圖IlA(二聚體)和IlB (單體)示出指明DMSO對活化反應的SEC曲線的影響的圖。圖12A和12B示出表位密度的統計分析結果，指明Sulfo-SMCC KLH比例和蛋白濃度的相互作用。圖13A和13B示出二聚體的統計分析結果，指明Sulfo-SMCC KLH比例和蛋白濃度的相互作用。圖14示出用于制備⑶X-110的原始工藝和優化工藝的反應參數的概要。詳細描述本公開內容基于對于KLH-肽共軛物的新穎制劑的發現，該制劑提供了有益的性質，例如減少的顆粒和凝膠形成以及增加的共軛物穩定性。本文所述的制劑還可被凍干和重構，提供了對于運輸和長期儲存的額外的益處。本文更充分地描述了這樣的有益性質以及對本領域技術人員明顯的其他有益性質。此外，根據本公開內容，已開發了改進的工藝用于生產KLH-EGFRvIII肽共軛物疫苗。本文公開的該新工藝提供了優化的反應條件，該優化的反應條件經得起大規模制造方案的檢驗并且導致純度特征以及對關鍵生物物理學屬性的控制的改進，所述關鍵生物物理學屬性例如肽/KLH的比例和尺寸不均勻性。為了使本公開內容可以更容易理解，首先定義某些術語。另外的定義在整個詳細描述中提出。除非在本文中另外定義，否則關于本公開內容使用的科技術語具有本領域普通技術人員所普遍理解的含義。此外，除非由上下文另外要求，否則單數的術語應當包括復數且復數的術語應當包括單數。通常，本文所述的關于以下所述使用的名稱以及以下所述的技術是本領域中眾所周知的和普遍使用的細胞和組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學和蛋白與核酸化學和雜交。本公開內容的方法和技術通常根據本領域眾所周知的方法以及如貫穿本說明·書所引證和討論的各種通用的和更特定的參考資料所描述的來進行，除非另外指明。這樣的參考資料包括，例如，Sambrook 和 Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Approach,Cold Spring Harbor 出版社，Cold Spring Harbor, NY (2001), Ausubel 等人，CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY(2002)以及 Harlow and LaneAntibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory 出版社，Cold SpringHarbor,NY(1990)。酶促反應和純化技術根據制造商的說明書、如本領域通常實現的或如本文所述的來進行。本文所述的關于以下所述使用的名稱以及以下所述的實驗室研究方法和技術是本領域中眾所周知的和普遍使用的分析化學、合成有機化學和藥物化學。標準技術被用于化學合成、化學分析、藥物制備、制劑、和遞送以及患者的治療。如本文使用的，以下術語中的每一個具有與其在此部分相關的含義。冠詞“一(a)”和“一(an)”在本文中用于指一個或多于一個(即，至少一個)該冠詞的語法賓語。作為實例，“一個元素(an element)”是指一個元素或多于一個元素。如本文使用的，20個常規的氨基酸及其縮寫遵照常規的用法。見Immunology-ASynthesis (第 2 版，E. S. Golub 和 D. R. Gren 編輯，Sinauer Associates, Sunderland,Mass.(1991))。如本文使用的，“KLH”是指蛋白鑰孔蟲戚血藍蛋白，一種在鑰孔蟲戚(keyholelimpets)(鑰孔青貝(Megathura crenulata))的血淋巴中發現的多亞單元的、攜帶氧的金屬蛋白或其片段或亞單元。如本文使用的術語“KLH-肽共軛物”是指KLH蛋白或其共價鍵合至與KLH無關的多肽的片段或亞單元。這樣的共價鍵合通常通過使用合適的化學連接基實現。如本文使用的、關于KLH-肽共軛物的術語“表位密度”是指偶聯至每個KLH亞單元的肽的平均數。表位密度可使用本文所述的氨基酸組成分析來確定。如本文使用的術語“二糖”是指在水解后得到兩個單糖分子(例如葡萄糖、果糖、甘露糖等)的化合物。合適的二糖包括，但不限于，蔗糖、乳糖和海藻糖。如本文使用的術語“表面活性劑”是指可改變液體KLH-肽共軛物組合物的表面張力的賦形劑。如本文進一步討論的，表面活性劑的實例包括，但不限于，聚山梨醇酯表面活性劑、泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆18和407)、triton表面活性劑例如Triton X-IOO 、聚山梨醇酯表面活性劑例如Tween 20 和Tween 80 ,以及許多其他本領域技術人員通常已知的。術語“凍干”、“凍干的”和“冷凍-干燥的”是指這樣的方法，通過該方法，待干燥的材料首先被冷凍且然后通過在真空環境中升華而除去冰或冷凍的溶劑。如本文使用的術語“EGFRvIII”是指代表存在于表皮生長因子受體(EGFR)中的變異突變體(variant mutant) III的肽，并通常包括以SEQ ID NO :1或2列出的氨基酸序列或由該序列組成，或至少 包括氨基酸序列“Lys-Lys-Gly-Asn-Tyr”。除非另外指明，否則如本文使用的“異常細胞生長”是指獨立于正常調節機制(例如接觸抑制的喪失)的細胞生長，包括正常細胞的異常生長和異常細胞的生長。這包括但不限于以下的異常生長腫瘤細胞(腫瘤)，例如間皮瘤、肝膽(肝和膽總管)、原發性或繼發性的CNS腫瘤、原發性或繼發性的腦腫瘤、肺癌(NSCLC和SCLC)、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸部癌癥、皮膚或眼內黑素瘤、卵巢癌、結腸癌、直腸癌、肛門區的癌、胃癌、胃腸道(胃、結腸直腸和十二指腸)癌、乳腺癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、何杰金氏病、食管癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織癌、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、睪丸癌、慢性或急性白血病、慢性粒細胞性白血病、淋巴細胞性淋巴瘤(lymphocytic lymphomas)、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)贅生物、原發性CNS淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、脊髓軸腫瘤、腦干膠質瘤、垂體腺瘤、腎上腺皮質癌、膽囊癌、多發性骨髓瘤、膽管癌、纖維肉瘤、神經母細胞瘤、成視網膜細胞瘤或上述癌癥中的一種或多種的組合。如本文使用的術語“治療(treating) ”或“治療(treatment) ”是指治療性的治療和預防疾病的或預防性的措施，其中對象將被防止或減慢(減輕)所靶向的病理狀況。需要治療的對象包括已經患有該狀況的以及易于患有該狀況的或該狀況將被防止的對象。組合物的“治療有效量”是指在必要的劑量和持續時間下，有效獲得所期望的治療結果的量，所述治療結果包括治療或預防性的防止異常細胞生長。應注意，劑量值可隨著待減輕的狀況的嚴重性變化。還應理解，對于任何特定的受治療者，具體的劑量方案應當隨時間根據個體需要和管理或監督組合物施用的人的專業判斷而調整，并且本文提出的劑量范圍僅為示例性的且不意圖限制所要求的組合物的范圍或實踐。同樣，組合物的治療有效量可根據諸如以下的因素而變化個體的年齡、性別和體重、治療的組合物引起個體中所期望的響應的能力、和期望的施用途徑。治療有效量還是其中組合物的任何毒性或不利作用被治療有益效果超過的量。術語“藥物組合物”是指以這樣的形式以便允許活性成分的生物活性有效的制劑。“藥學上可接受的賦形劑”(媒介物、添加劑)是能夠適度地(即安全地)被施用于受治療者以提供所使用的活性成分的有效劑量的那些。如本文使用的術語“賦形劑”或“載體”是指通常被用作藥物的稀釋劑、媒介物、防腐劑、粘合劑或穩定劑的惰性物質。如本文使用的術語“稀釋劑”是指藥學上可接受的(對施用于人類是安全且無毒的)溶劑并可用于本文的液體制劑的配制。示例性的稀釋劑包括，但不限于，無菌水和抑菌性注射用水(BWFI)。除非另外說明，否則本文公開的組合物的各種組分的濃度和pH值是在環境條件下(即，在25°C和大氣壓下)的那些濃度。當濃度和pH范圍在本文列出時，在所描述的明確的范圍中間的這種范圍也預期是本公開內容的一部分。例如，使用任何值的組合作為上限和/或下限的值的范圍預期被包括在內。根據本公開內容已發現，對于KLH-肽共軛物，通過與磷酸鉀緩沖液、諸如海藻糖的二糖和諸如Tween 80的表面活性劑結合成共軛物，顆粒和/或凝膠的形成可被減少并且該共軛物的穩定性可被改善。此外，已發現，當這些組分以某些量使用時，凍干(隨后重構為水溶液)是可能的而同時最小化顆粒與凝膠的形成并維持共軛物的穩定性和生物物理學特性。雖然不希望受限于任何特定的理論，但認為本公開內容的組合物通過減少以下的一種或多種的發生率而有助于改善KLH-肽共軛物的穩定性并減少KLH-肽共軛物的顆粒和/或凝膠的形成KLH-肽聚集、裂解(fragmentation)、氧化、凍/融穩定性、與從一處至另一處的運輸或輸送相關的不穩定性、變色和/或脫酰胺作用。因此，本公開內容提供了與先前公開的組合物相比，具有改善的化學和/或物理穩定性的KLH-肽共軛物組合物。因此，在某些方面中，本公開內容提供了包含KLH-肽共軛物、磷酸鉀緩沖液、二糖和表面活性劑的組合物。還在其他方面中，前述的組合物可包括另外的藥學上可接受的賦形劑，包括但不限于，緩沖液、鹽、抗氧化劑、張度劑(tonicity agent)、表面活性劑及其混合物。因此，本公開內容提供了對于KLH-肽共軛物的新穎的制劑。
KLH-肽共軛物KLH是能夠用作抗原肽的載體的復合的多聚體蛋白。這樣的肽可共軛至KLH，且所得KLH-肽共軛物能夠作為疫苗用于刺激涉及抗原肽的免疫響應。在本公開內容的一個方面中，抗原肽通過化學交聯的方式(通常使用異雙官能交聯劑)共軛至KLH。本領域中已知一些異雙官能交聯劑。在某些實施方案中，異雙官能交聯劑包含能夠與第一附著位點(即與KLH的賴氨酸殘基的側鏈氨基)發生反應的官能團和能夠與優選的第二附著位點(即稠合至抗原肽并任選地還能進行還原反應的半胱氨酸殘基)發生反應的另外的官能團。該程序的第一步驟，通常被稱為衍生化，是KLH與交聯劑的反應。該反應的產物是活化的KLH，還被稱為活化的載體。在第二步驟中，未反應的交聯劑使用標準方法如凝膠過濾或滲析而被除去。在第三步驟中，抗原肽與活化的KLH反應，且該步驟通常被稱為偶聯步驟。未反應的抗原肽可任選地在第四步驟中除去，例如通過滲析。本領域中已知一些異雙官能的交聯劑。這些包括諸如以下的交聯劑SMPH、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA 以及例如來自Pierce Chemical Company (Rockford, IL, USA)且具有對氨基有反應性的一個官能團和對半胱氨酸殘基有反應性的一個官能團的其他可用的交聯劑。以上提及的交聯劑全部導致硫醚鍵的形成。KLH-肽共軛物的一個實例包括被稱為EGFRvIII (SEQ ID NO :1)的、化學共軛至KLH蛋白表面的肽。該EGFRvIII肽包含13個表皮生長因子受體的III型變體形式(EGFRvIII)的氨基酸(參見例如美國專利第5，401，828號)。該EGFRvIII肽可通過在該肽的N-端或C-端上包含Cys殘基(參見例如SEQ ID NO 2或3)并然后使用磺基琥珀酰亞胺基-4_[N-馬來酰亞胺甲基]環己烷-I-羧酸酯(sulfo-SMCC)作為連接基，而被偶聯至KLH表面上的伯胺基團(例如在Lys側鏈上)。因此，典型的偶聯反應可如以下方案I中
所示進行。+一 tc^。
° °馬來酸亞胺活化的KM
Sulfo-SMCC
I------I
權利要求
1.一種包含KLH-肽共軛物、緩沖液、糖和表面活性劑的組合物，其中在所述KLH-肽共軛物中共軛至KLH的肽包括EGFRvIII氨基酸序列。
2.根據權利要求I所述的組合物，其中所述緩沖液包括磷酸鹽緩沖液。
3.根據權利要求2所述的組合物，其中所述緩沖液包括磷酸鉀緩沖液。
4.根據權利要求I至3中任一項所述的組合物，其中所述緩沖液以5mM至30mM的濃度存在。
5.根據權利要求I至3中任一項所述的組合物，其中存在的所述緩沖液的濃度為使得在40°C下12周后，在所述組合物中的所述KLH-肽共軛物的濃度，以mg/mL測定，當與原始濃度比較時改變了少于15%。
6.根據權利要求I所述的組合物，其中所述糖是二糖。
7.根據權利要求6所述的組合物，其中所述二糖是海藻糖，并且以45至150mg/mL的濃度存在或以80至IlOmg每mg KLH-肽共軛物的量存在。
8.根據權利要求6所述的組合物，其中所述二糖是海藻糖并且存在的所述二糖的濃度為使得在40°C下12周后，在所述組合物中的所述KLH-肽共軛物的濃度，以mg/mL測定，當與原始濃度比較時改變了少于15%。
9.根據權利要求I所述的組合物，其中所述表面活性劑是聚山梨醇酯，并且以O.01至O. 3mg/mL的濃度存在或以O. 01至O. 3mg每mg KLH-肽共軛物的量存在。
10.根據權利要求I所述的組合物，其中所述表面活性劑是聚山梨醇酯并且存在的所述表面活性劑的濃度為使得在40°C下12周后，在所述組合物中的所述KLH-肽共軛物的濃度，以mg/mL測定，當與原始濃度比較時改變了少于15%。
11.根據前述權利要求中任一項所述的組合物，其中在所述KLH-肽共軛物中共軛至KLH的肽由SEQ ID NO 1組成。
12.根據前述權利要求中任一項所述的組合物，其中在所述KLH-肽共軛物中共軛至KLH的肽由SEQ ID NO 2組成。
13.根據前述權利要求中任一項所述的組合物，其中所述肽采用Sulfo-SMCC連接基共軛至KLH。
14.根據前述權利要求中任一項所述的組合物，其中所述表位密度為20至80。
15.根據前述權利要求中任一項所述的組合物，其中以二聚體形式存在的KLH-肽共軛物的量為按質量計所述組合物的總質量的45%至65%。如通過尺寸排阻色譜法測定的。
16.根據前述權利要求中任一項所述的組合物，其中以單體形式存在的KLH-肽共軛物的量為按質量計所述組合物的總質量的15%至40%，如通過尺寸排阻色譜法測定的。
17.根據前述權利要求中任一項所述的組合物，其中以單體形式存在的KLH-肽共軛物的量為按質量計所述組合物的總質量的18%至35%，而以二聚體形式存在的KLH-肽共軛物的量為按質量計所述組合物的總質量的50%至65%，如通過尺寸排阻色譜法測定的。
18.根據前述權利要求中任一項所述的組合物，其中所述組合物是含水的藥物組合物，并且所述組合物的pH為6至8。
19.根據前述權利要求中任一項所述的組合物，其中所述組合物是含水的藥物組合物，并且所述組合物的PH的量為使得在40°C下12周后，在所述組合物中的所述KLH-肽共軛物的濃度，以mg/mL測定，當與原始濃度比較時改變了少于15%。
20.—種包含KLH-EGFRvIII肽共軛物、磷酸鉀緩沖液、海藻糖和聚山梨醇酯80的液體組合物，其中共軛至KLH的所述肽包括SEQ ID ΝΟ1 ;所述KLH-EGFRvIII肽共軛物具有30至65的表位密度；所述緩沖液以9mM至IlmM的濃度存在；所述組合物的pH為7. 3至7. 5 ;所述海藻糖以85mg/mL至95mg/mL的濃度存在；所述聚山梨醇酯80以O. lmg/mL至O. 3mg/mL的濃度存在；且進一步地，其中以單體形式存在的KLH-EGFRvIII肽共軛物的量為按質量計所述組合物的總質量的18%至35%，而以二聚體形式存在的KLH-EGFRvIII肽共軛物的量為按質量計所述組合物的總質量的50%至65%，如通過尺寸排阻色譜法測定的。
21.根據權利要求17所述的組合物，其中所述液體組合物通過與水重構凍干的組合物而制備。
22.根據權利要求17或18所述的組合物，其中所述緩沖液以IOmM的濃度存在，所述組合物的PH為7. 4，所述海藻糖以90mg/mL的濃度存在，且聚山梨醇酯80以O. 2mg/mL的濃度存在。
23.一種用于制備KLH-EGFRvIII共軛物的方法，包括a)使KLH與連接基結合并允許所述KLH和連接基相互作用30至60分鐘的時間；和幻將包括SEQ ID NO 1的肽添加至由步驟a)得到的活化的KLH產物以提供所述KLH-EGFRvIII共軛物。
24.根據權利要求20所述的方法，其中所述連接基與KLH以75 I至325 I的連接基KLH摩爾比結合。
25.一種用于制備KLH-EGFRvIII共軛物的方法，包括a)使KLH與連接基結合并允許所述KLH和連接基相互作用；和幻將包括SEQ ID NO: I的肽添加至由步驟a)得到的活化的KLH產物以提供所述KLH-EGFRvIII共軛物，其中所述連接基是被添加到非水溶劑中的Sulfo-SMCC 連接基。
26.如權利要求25所述的方法，其中所述非水溶劑包括DMS0。
27.—種包含KLH-EGFRvIII肽共軛物的組合物，其中以單體形式存在的KLH-EGFRvIII肽共軛物的量為按質量計所述組合物的總質量的18%至35%，而以二聚體形式存在的KLH-EGFRvIII肽共軛物的量為按質量計所述組合物的總質量的50%至65%，如通過尺寸排阻色譜法測定的。
28.—種包含KLH-EGFRvIII肽共軛物的組合物，其中所述組合物是含水藥物組合物，所述含水藥物組合物已經被穩定化使得在40°C下12周后，在所述組合物中的所述KLH-肽共軛物的濃度，以mg/mL測定，當與原始濃度比較時改變了少于15%。
29.—種包含KLH-EGFRvIII肽共軛物的組合物，其中所述共軛物的平均表位密度在約20和80之間。
30.一種包含KLH-EGFRvIII肽共軛物的組合物，其中所述組合物具有以下性質 i)如通過氨基酸組成測定的表位密度為30-70肽/KLH； ii)如通過SECHPLC測定的大小分布特征如下峰 I <2%峰 2 8-17%峰 3 50-60% 峰 4 20-30% 峰 5 1-5% iii)如通過AEX RP-HPLC測定的純度如下 肽二聚體彡5% 連接基或連接基相關的雜質<1% 總肽-連接基雜質彡10%。
31.根據權利要求27至30中任一項所述的組合物，其包括緩沖液。
32.根據權利要求31所述的組合物，其中所述緩沖液包括磷酸鹽緩沖液。
33.根據權利要求32所述的組合物，其中所述緩沖液包括磷酸鉀緩沖液。
34.根據權利要求27至33中任一項所述的組合物，其包括冷凍保護劑或凍干保護劑。
35.根據權利要求27至33中任一項所述的組合物，其包括糖。
36.根據權利要求35所述的組合物，其中所述糖是二糖。
37.根據權利要求36所述的組合物，其中所述二糖是海藻糖。
38.根據權利要求27至37中任一項所述的組合物，其包括表面活性劑。
39.根據權利要求38所述的組合物，其中所述表面活性劑是聚山梨醇酯、泊洛沙姆或triton表面活性劑。
40.根據權利要求39所述的組合物，其中所述表面活性劑是聚山梨醇酯80。
41.根據權利要求27至40中任一項所述的組合物，其中在5°C下26周后，大于或等于25μ m的顆粒的數量，如通過USP〈788>測定的，增加了少于1000%。
全文摘要
本公開內容涉及疫苗組合物，特別是KLH-肽共軛物，以及制造這樣的組合物的方法。本公開內容還涉及使用本文描述的組合物減少異常細胞生長的方法。
文檔編號C07K19/00GK102762224SQ201080058432
公開日2012年10月31日 申請日期2010年12月8日 優先權日2009年12月22日
發明者B·R·奧斯伯爾內, F·扎曼, J·J·巴克利三世, J·M·索恩, L·M·勒維斯, S·S·阿梅德, S·辛哈 申請人:塞爾德克斯醫療公司