用于識別具有結合配體能力的異源多聚體修飾的泛素蛋白質的方法

專利名稱：用于識別具有結合配體能力的異源多聚體修飾的泛素蛋白質的方法
技術領域：
本發明涉及識別具有結合配體能力的異源多聚體泛素的方法。此外，本發明提供編碼所述異源多聚體泛素蛋白群的DNA庫和由所述DNA庫的表達獲得的蛋白質庫、包含所述DNA或蛋白質的細胞和噬菌體、編碼所述融合蛋白的多聚核苷酸和包括所述多聚核苷酸的載體。進一步提供能夠以高親和力特異性地結合到所選擇的配體上的以異源多聚體泛素為基礎的新的結合蛋白質(binding protein)。
背景技術：
對于由氨基酸組成的，但不是免疫球蛋白的結合分子的需求日益增加。迄今為止，雖然抗體代表確定的最好的結合分子，但是因為免疫球蛋白分子具有較大的缺陷，為了以高親和力和高特異性靶向配體，仍然需要新的結合分子。盡管它們能很容易地制造且它們 可指向幾乎任何一個靶，它們仍然具有相當復雜的分子結構。仍然需要能夠易于操作的更小的分子取代抗體。這些可替換的結合劑能有利地用于，例如診斷、預防和疾病的治療的醫療領域。蛋白具有相對確定的通常被稱為蛋白質骨架的三維結構，且可作為用于設計所述可替換的結合劑的起始材料。這些骨架通常包含一個或多個區域，這些區域受特異的或隨機的序列變化作用，且經常發生這種序列隨機化，以制造蛋白質文庫，從蛋白質文庫中可選出特異的結合分子。預期具有比抗體更小的尺寸，且對靶抗原具有相當、甚者更好的親和力的分子在藥物動力學性能和免疫原性方面超過抗體。先前的許多方法確實使用蛋白質骨架作為結合蛋白的起始材料。例如，在WO99/16873中，開發對某種配體表現出結合活性的脂質運載蛋白(Iipocalin)家族(所謂的Anticalin (一種抗體類似物))的修飾蛋白。利用遺傳工程的方法，通過在其天然配體結合口袋(pocket)進行氨基酸置換，對脂質運載蛋白家族肽的結構進行修飾。類似免疫球蛋白，Anticalin可用于確定或結合分子結構。在某種意義上類似于抗體，柔性環形結構被修飾；這些修飾能夠確定與天然配體不同的配體。WO 01/04144描述在蛋白本身缺少結合位置P片結構中的蛋白表面上人工產生的結合域。通過這種方法重新產生人工的結合域，例如能夠獲得、-晶狀體球蛋白-一種眼睛晶體結構蛋白-的變體，其對配體具有高親和力和特異性。和已經出現且由上述提及的擬抗體的柔性環形結構形成的結合位置的修飾相比，這些結合域重新在P片的表面上產生。然而，W001/04144只描述用于產生新的結合性能的相對大的蛋白的變化。由于它們的尺寸，根據WO 01/04144蛋白僅能在遺傳工程水平上通過需要某些努力的方法來修飾。此夕卜，為了維持蛋白的整體結構，迄今為止公開的蛋白中只有總氨基酸相對小的百分數部分被修飾。因此，只有相對小的蛋白表面的區域是可用的，其能用于產生以前不存在的結合性能。而且，W001/04144只公開對Y-晶狀體球蛋白產生的結合性能。WO 04/106368描述以泛素蛋白為基礎的人工結合蛋白的產生。泛素是小的、單體的、和細胞溶質的蛋白，其序列高度保守且出現在所有已知的從原生動物到脊椎動物的真核細胞中。其在生物體的細胞蛋白的可控降解的調節中充當至關緊要的角色。為了這種目的，用于降解的蛋白在它們通往酶的級聯反應期間共價地連接到泛素或多聚泛素鏈上，且由于這種標簽選擇性地降解蛋白。根據最近的結果，泛素或泛素的蛋白標簽，也分別在其他細胞程序中充當重要的角色，例如幾種蛋白的輸入或其基因調節。除了它的生理機能的闡明之外， 由于它的結構和蛋白化學性質，泛素是主要的研究目標。泛素的多肽鏈由76個在非常緊密的a/0結構(Vijay-Kumar，1987)中折疊的氨基酸組成幾乎87%的多肽鏈涉及通過氫鍵的二級結構元件的形成。主要的二級結構是三個和半個a螺旋轉角和由四股組成的反平行P片。這些元件的特征排列通常被認為是所謂的類泛素折疊基序(ubiquitin-like folding motif)-反平行0片暴露在后側上的蛋白表面，其中a螺旋垂直地堆積在頂上。進一步的結構特征是蛋白內部a螺旋和P片之間標記的疏水區域。因為它的小的尺寸，能通過化學合成和依靠生物科技的方法兩種途徑進行泛素的人工制備。由于有利的折疊性能，能通過遺傳工程利用微生物例如埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli)以相對大的數量在細胞溶質或在外周胞質空間制造泛素。因為外周胞質中占優勢的氧化條件，后面的方法通常專供分泌蛋白的制造之用。由于簡易和有效的細菌制備，泛素能用作其他外源蛋白的融合伴侶，以制備難于生產的產品。依靠融合，能獲得溶解性改善的泛素并因此獲得提高的產量。與抗體或其他可替換的骨架相比，以泛素蛋白(也稱作載脂蛋白擬抗體_)為基礎的人工結合蛋白具有的優勢是小尺寸和高穩定性、高親和力、高特異性、有效的微生物制造成本、和血清半衰期的調整。然而，按照免疫原潛在、快速和預兆的潛伏期發展軌跡和新的治療途徑，仍然需要進一步地開發這些蛋白質。為了獲得人造的結合蛋白，WO 05/05730總體描述了泛素骨架蛋白的用途，為了獲得結合配體如半抗原和抗原更高的和更特定的親和力，例如，蛋白質和肽和它的抗原決定基，沒有提供如何修飾和如何有效地選擇這種修飾的泛素蛋白質的解決辦法。WO 05/05730中描述的方法涉及修飾的泛素蛋白的單體或涉及修飾的泛素的結合蛋白(偶聯蛋白)。結合(偶聯)形式是通過篩選和選擇一個、兩個或更多的修飾的泛素蛋白產生的，且然后通過遺傳的或化學的方法連接它們，以便獲得結合(偶聯)的形式，例如結合(偶聯)形式能夠通過一個結合(偶聯)泛素分子多特異性的結合不同類型的配體。一個實施例中，與單獨修飾的泛素分子相比，為了增加結合親和力，描述了兩種同樣的基于泛素的蛋白質(同型二聚體)的位置定向的結合(偶聯)。本發明的目標是提供如何識別具有配體高結合能力的多聚體泛素蛋白質的方法。本發明的進一步目標是提供識別新的以修飾的泛素為基礎的結合蛋白質的方法且能夠具有高親和力特異性地結合選擇的配體的方法。通過隨附的獨立權利要求的主旨解決上述描述的目標。本發明優選的實施例包括在從屬權利要求中和具體實施方式
、實施例和圖形中。

發明內容
更具體地，本發明提供識別具有結合配體能力的異源多聚體修飾的泛素的方法，其包括下列步驟a)提供來源于單體修飾的泛素蛋白質的異源多聚體修飾的泛素蛋白質的群，所述群包括異源多聚體蛋白質，其包括以頭尾排列連接在一起的兩種或更多不同地修飾的泛素單體或至少一種修飾的泛素單體，其中至少通過位于SEQ ID N0:1的位置2、4、6、8、62、63、64、65、66和68處的至少三個氨基酸中的表面暴露的氨基酸的取代而對每一個所述異源多聚體蛋白質的所述單體的至少兩個進行不同地修飾，所述修飾的單體蛋白與未修飾的泛素蛋白質具有的氨基酸序列同一性為至少80%或至少90%或至少95% ；b)為所述不同修飾的蛋白質的群提供潛在的配體；c)使所述不同地修飾的蛋白質的群與所述配體接觸；d)通過篩選方法識別修飾的異源多聚體蛋白質，其中所述修飾的多聚體蛋白以Kd的范圍是10_7-10_2M的特定的(特異性)結合親和力結合所述配體，且對于所述配體表現出單價的結合活性；和可選地 e)利用所述結合親和力分離所述異源多聚體修飾的泛素蛋白質。用于該申請中重要的術語的定義術語“泛素蛋白質”包括與SEQ ID NO: I—致的泛素和與下列定義一致的它的修飾。真核生物體中的泛素是高度保守的。例如，在所有迄今為止調查的哺乳動物中泛素具有同樣的氨基酸序列。顯著首選的是來自人類、嚙齒動物、豬和靈長類的泛素分子。此外，能利用任何其他真核來源的泛素。例如酵母的泛素與SEQ ID NO: I的序列只有三個氨基酸的不同。通常，由所述術語“泛素蛋白質”包括的泛素蛋白質與SEQ ID NO: I顯示超過70%的氨基酸同一性，優選地超過75%或超過80%的、超過85%、超過90%、超過95%、超過96%或達到97%的序列同一性。為了確定泛素衍生物與SEQ ID N0:1的氨基酸序列同一性的程度，例如，能利用 SIM Local 類似程序(Xiaoquin Huang and Webb Miller, " Advances in AppliedMathematics, vol. 12:337-357，1991)或者 Clustal, W. (Thompson et al. , Nucleic AcidsRes.，22(22) :4673-4680, 1994.)。優選地，相對于SEQ ID NO: I的全部序列，修飾蛋白與SEQ ID NO: I序列同一性的程度是確定的。本說明書中，術語“配體”和“受體”和“結合伴侶”都是同義使用的且能互換。配體是具有此處定義的能夠利用親和力結合異源多聚體修飾的泛素蛋白的任何分子。本發明的“異源多聚體融合蛋白”或“異源多聚體蛋白”被認為是包括一個或更多不同修飾的單體泛素蛋白的蛋白質。因此，本發明的“異源多聚體”被認為是具有兩個相互作用的結合域區域的至少兩個不同修飾的單體泛素蛋白的融合，其中兩個結合域區域為具體的結合伴侶共同提供單價的結合性能。優選的是異源二聚物或異源三聚物。依照本發明，至少兩個不同地修飾的結合到一個配體上的泛素單體利用例如遺傳方法通過首尾融合而彼此連接。不同地修飾的融合的泛素單體以單價的方式結合且如果兩個結合域區域(“BDR”)共同起作用，不同修飾的泛素單體才是有效的。形成異源多聚體蛋白的修飾的和連接的泛素單體通過單個臨近的結合區域結合到相同的抗原決定基上。這種異聚體的臨近區域是由至少兩個模塊的兩個結合決定區域形成的，其中兩個模塊是由至少兩個不同地修飾的泛素單體形成的。“首尾融合”應理解成通過依靠包含在多聚體中的大量單元以N-C-N-C-方向連接在一起的兩個或更多蛋白質的融合。這種首尾融合中，泛素能夠沒有任何連接子而直接地連接。可替換地，能通過連接子完成泛素單體的融合，例如，具有至少氨基酸序列為GIG或具有至少氨基酸序列為SGGGG的連接子或任何其他連接子，例如GIG、SGGGG, SGGGGIG、SGGGGSGGGGIG或SGGGGSGGGG。現有技術中也已知且能夠利用用于兩種泛素單體的遺傳融合的其他連接子。概括地，為了獲得修飾的泛素單體的融合蛋白，由兩個、三個或更多不同地修飾的單體泛素蛋白的融合提供異源多聚體修飾的泛素蛋白。進一步的實施例中，至少一個泛素單體是未修飾的，而其他泛素分子的至少一個是修飾的。術語“群”涉及由異源的核酸編碼的異源的多肽混合的庫。庫由成員組成，該成員具有由核酸序列編碼的單一多肽。庫成員之間的序列差異是形成庫中出現的多樣性的原因。庫可采取多肽或核酸的單一混合的形式，或可采取生物體或細胞的形式，例如細菌、病毒、動物或植物細胞等等，利用核酸的庫進行轉換。優選地，每一個單獨的生物體或細胞只 包含庫的一個成員。有利地，為了容許核酸編碼的多肽的制造，將核酸并入表達載體。因此，優選的方面，庫可采取宿主生物體群的形式，每一個生物體包含一個或更多表達載體的拷貝，表達載體包含核酸形式的庫的單個成員，表達載體能表達以便制造它的相應的多肽成員。因此，宿主生物體的群具有潛在地編碼遺傳上不同的多肽變體的大量全部內容。例如通過遺傳上地融合的各自編碼不同地修飾的單體蛋白的DNA庫，或以可替換的方式，提供所述的異源多聚體泛素蛋白質的群，其中修飾至少一個所述單體泛素蛋白質，將DNA翻譯成異源多聚體融合蛋白，展示所述蛋白質并在修飾的異源多聚體泛素蛋白存在下篩選展示的蛋白質，異源多聚體泛素蛋白包含以首尾排列連接在一起的單體泛素蛋白，其中所述修飾的異源多聚體泛素蛋白質結合所述配體具有的特定的結合親和力Kd的范圍是10_7-10_2M，且對于所述配體表現單價的結合活性。為了獲得異源二聚體泛素蛋白質，融合各自編碼或至少一個編碼不同地修飾的單體蛋白的兩個DNA庫，為了獲得異源三聚體泛素蛋白，融合各自編碼或至少一個編碼不同地修飾的單體蛋白的三個DNA庫，等等。進一步可替換的方式可以用于提供用于篩選的庫。一個實例是蛋白質的化學合成，例如，通過固態技術和在它們的氨基酸成分中引入變體。本領域技術人員可以考慮并且發現其他有用的的選項深思熟慮的。因此，本發明不能理解成是對此處描述的實例的限制。因此，本發明公開了一種方法，通過這種方法，依照由結合配體能力決定的功能性，提供多肽的所有組成成分，并且作為選擇結果獲得的多肽子集依照結合靶配體的能力用于進一步多輪選擇，以便積聚和增加配體的結合親和力。本發明允許本領域的技術人員從選擇的多肽的所有組成成分中，排除那些權利要求中指定的不能具有親和力的結合到靶配體上的多肽。本發明允許本領域的技術人員為有用的且滿足親和力要求的多肽富集多肽的所選的所有組成成分。本發明的最重要的一個關鍵點在于對靶分子具有單價的結合親和力的修飾的異源多聚體泛素蛋白質的選擇和后來的為結合親和力負責的修飾的氨基酸的測定。多聚化、優選二聚化的進一步的優勢在于氨基酸殘基數量的增加，氨基酸殘基能被修飾以便產生新的高親和力結合性能。優勢是即使在更多氨基酸被修飾時，也維持蛋白質化學的完整性，而不減少所述的新形成結合靶分子的蛋白質的骨架的總體穩定性。一方面，為了產生特定的靶標的新的結合位置，能被修飾的殘基的總數是增加的，因為能將修飾的殘基分配到兩個或三個或更多的單體泛素蛋白上。因此對應于修飾的單體泛素分子的數目，修飾的數目能是兩倍或X-倍。總之，基于泛素的結合蛋白質的分子結構允許增加修飾的氨基酸的總數，因為所述修飾的氨基酸包括在兩個或三個或更多的單體泛素分子上的。本方法提供識別具有一個單價特異性(對于一個單獨的抗原決定基)的異源多聚體泛素分子。“單價的”應該理解成修飾的二聚體(可選地三聚體或通常的多聚體)泛素的第一和第二 (和可選地另外的)單體單元中形成的兩種結合區域以協作的和組合的方式一起結合ED-B的能力，即，兩種結合區域共同起作用以便形成單價的結合活性。所述異源二聚體分子中第一和第二修飾的泛素的每一結合區域分別地結合ED-B具有的效率和親和力顯然將低于二聚體分子。兩種結合區域形成單一的(獨特的)結合位點，該結合位點作為異源二聚修飾的泛素蛋白的表面上的氨基酸的臨近區域形成，以致所述修飾的泛素比每一個單體蛋白單獨結合到ED-B更加有效，因此所述修飾的泛素是切實可行的。依照本發明，沒有在已經篩選了最有效的結合泛素分子之后連接兩種單體蛋白而是在有異源二聚體泛素的情況下實施該篩選過程，這是非常重要的。在已經接收最有效的結合泛素分子之上的序列信息之后，可通過其他方法獲得這些分子，例如，通過化學合成或通過遺傳工程方法，例如，通過將兩個已經識別的單體泛素單元連接在一起。應該理解，也可將此處提供的所有二聚體 修飾的泛素蛋白的實例更改成三聚體或通常的多聚體修飾的泛素蛋白。因此，具有用于結合伴侶的共同的結合位點的異源多聚體特別是異源二聚體的使用打開了引入增加的修飾殘基數量的可能性，其中修飾的殘基不能過度地影響最終結合分子的蛋白化學完整性，因為那些修飾殘基的總數分布在兩個或更多形成二或多聚體的單體單元上。所述異源多聚體修飾的泛素蛋白出現在蛋白質的庫中。通過在每一個單體泛素單元中不同地修飾挑選的密碼子而已經建立例如至少兩種不同的用于編碼單體修飾的泛素蛋白質的DNA庫之后，這些庫遺傳融合以獲得編碼異源多聚體修飾的泛素蛋白質的DNA分子。這些庫的DNA翻譯成蛋白質且依照本發明因此獲得的修飾的異源多聚體蛋白與靶分子接觸，以便如果確實存在結合親和力，伴侶能夠彼此結合。優選的修飾的泛素是異源二聚物。本發明至關重要的方面是關于異源-多聚體，例如異源-二聚體的修飾的泛素蛋白質已經進行了接觸和篩選方法(過程)。這個方法能夠對那些提供對靶分子的單價結合活性的泛素蛋白質進行篩選。依照本發明，單體修飾的泛素蛋白質不是在已經通過篩選最有效的結合泛素分子進行選擇之后連接在一起，而是在有異源二聚體泛素的情況下實施篩選過程，這是特別重要的。然而，應該注意，在已經獲得(接收)最有效的異源多聚體泛素結合分子的序列信息之后，也可通過任何其他的方法獲得這些分子，例如，通過化學合成或通過遺傳工程方法，例如，通過將兩個已經識別的不同地修飾的單體泛素單元連接在一起，以便形成異源二聚體結合蛋白質。依照本發明，優選地通過適當的表達和選擇方法，例如噬菌體展示、核糖體展示、TAT噬菌體展示、mRNA展示或細胞表面展示、酵母表面展示或細菌表面展示方法,優選地依靠核糖體或噬菌體展示方法，來進行接觸，。為了完全公開，也可以參考下列參考文獻Hoess, Curr. Opin. Struct. Biol. 3 (1993)，572-579; Wells and Lowmann, Curr.Opin.Struct.Biol. 2(1992), 597-604;25 Kay et al, Phage Display of Peptides andProteins-A Laboratory Manual (1996)，Academic Press。上述提到的方法都是本領域的那些技術人員已知的且依照本發明可以使用，包括其變化/修飾方法。依照本發明優選地通過一個或更多下列方法酶聯免疫吸附實驗(ELISA)、表面等離子共振技術(surface plasmon resonance spectroscopy)、體積排阻色譜法(size exclusion chromatography)、突光各向異性(fluorescence anisotropy)、突光光譜(fluorescence spectroscopy)、FACS、等溫滴定溫量熱儀(isothermal titrationcalorimetry)、和分析超速離心(analytical ultracentrifugation),能確定修飾的蛋白質是否具有對預定的結合伴侶的可定量的結合親和力。通過專家的常識，也能利用本領域中可用的其他方法。“異源多聚體”此處被認作是包括至少兩個不同的單體泛素蛋白質的蛋白質。本發明的“異源二聚體”被認為是兩個不同地修飾的單體泛素蛋白的融合。兩者對特定的結合伴侶均表現組合的單價結合性能。強調的是本發明的修飾的多聚體(例如，二聚體)配體結合泛素蛋白質不是通過分別地篩選每一個單體泛素蛋白然后組合它們中的至少兩個獲得的，而是通過篩選由第一和第二或進一步的單體單元組成的多聚體(可選地二聚體)蛋白質 獲得的，單體單元一起表現所述配體的單價結合活性。每一個所述子單元對配體表現相當有限的結合親和力，而只有組合的多聚體或二聚體修飾的泛素具有本文描述的極好的結合性能，這是期望的。在一個實施例中，所述方法涉及識別修飾的異源二聚體泛素蛋白質，其中兩個單體泛素單元以首尾排列的方式連接在一起，其中通過在SEQ ID N0:1的位置2、4、6、8、62、63、64、65、66和68處至少3個、優選至少6個氨基酸(它們中每一個都是暴露在表面的)的取代，不同地修飾所述二聚體蛋白質的每一個單體，其中所述取代包括(I)第一個單體單元中至少在氨基酸位置6、8、63、64、65和66的取代；和在第二單體單元中至少在氨基酸位置6、8、62、63、64、65、和66的取代；可選地外加在氨基酸位置2的取代，或者(2)第一個單體單元中至少在氨基酸位置2、4、6、62、63、64、65和66的取代；和第二單體單元中至少在氨基酸位置6、8、62、63、64、65和66的取代；可選地外加在氨基酸位置2的取代，和可選地進一步的修飾，優選地其他氨基酸的取代，所述修飾的單體泛素單元與SEQ ID NO: I具有的氨基酸同一性為由80%、至少83%、至少85%、至少83%和至少90%組成的組中的至少之一，所述蛋白質對于配體具有的特定的結合親和力Kd = 10_7-10_2M且所述蛋白質對于所述配體表現單價的結合活性。本發明的進一步實施例中，在每一個單體泛素單元中修飾SEQ ID NO: I的位置2、4、5、6、8、62、63、64、65、66、和68中的6、7、8、9個或所有的氨基酸。應該理解本發明允許在每一個單體單元中(例如，在第一和第二單元中)的這些變體的每一個的組合。例如第一單體單元能包括6處修飾而第二單元包括7或8處修飾，第一單元可包括8處修飾和第二單元包括7處修飾等等。上述列出的每一個氨基酸能在第一和第二單元中選出，然后兩個單元組合。本文下面描述優選的取代。
具體實施方式
修飾的異源多聚體泛素蛋白的展示方法在下文和實施例中描述了適于這個申請的噬菌體和核糖體展示程序。依照本發明，它們被描述作為選擇過程的實施例，以便檢測泛素的變體，其顯示對此處描述的潛在的配體的結合性能。同樣地，例如能利用細菌(細菌表面展示；Daugherty etal. , 1998, Protein Eng. 11 (9) :825-832)或酵母細胞(酵母表面展示；Kieke et al, 1997Protein Eng. 10 (11) : 1303-10)或無細胞選擇體系(cell-free selection systems)例如核糖體展不(Hanes and Pluckthun, 1997 Proc Natl Acad Sci USA. 94 (10) : 4937-4942; Heand Taussig, 1997_Nucleic Acids Res analytical ultracentrifugation, . 25(24):5132-5134)或 cis 展示(Odegrip et al, 2004 Proc Natl Acad Sci USA. 101(9) :2806-2810)或mRNA展示上表現的方法。在后面的情形中，利用核糖體通過將蛋白質變體與適當的mRNA結合(偶聯)獲得基因型和表現型短暫的物理連接。在此處描述的噬菌體展示程序中，泛素的重組變體出現在絲狀噬菌體上，而出現的變體的譯碼DNA同時出現，且以單鏈形式包裝在噬菌體包膜中。因而，在親和力富集的結 構中，能夠從庫中選出具有某些性能的變種且能分別通過適當的細菌感染或增加另外的富集循環擴增它們的遺傳信息。通過遺傳的融合到對氨基末端信號序列上-優選的PelB信號序列-和噬菌體的衣殼或表面蛋白質-優選的是羧基末端融合到衣殼蛋白pill或它的碎片上，獲得噬菌體表面上的突變的泛素的表達。此外，編碼的融合蛋白能包含進一步的功能元件例如，用于通過親和色譜法檢測和/或純化的親和標簽或抗體抗原決定基或在親和富集期間用于融合蛋白的特定斷裂的蛋白酶識別序列。此外，例如能在泛素變體的基因和噬菌體衣殼蛋白的譯碼區域或它的碎片之間出現琥珀終止子，部分地由于一個氨基酸的引入，在適當的抑制基因(suppressor strain)的翻譯期間不能辨別琥拍終止子。在對特定的靶標具有結合性能的泛素變體的分離的背景中，適合于選擇過程(步驟)的且融合蛋白的基因表達盒(gene cassette)插入其中的細菌載體優選是噬菌粒。其中，它包含絲狀噬菌體(例如M13或fl)或它的部分的基因間隔區，在依靠輔助噬菌體例如M13K07攜帶噬菌粒的細菌細胞的雙重感染的情況下，其導致共價的環狀噬菌粒DNA組裝成噬菌體衣殼。以這種方式產生的噬菌體顆粒是通過細菌分泌的，且由于在它們表面上對衣殼蛋白PlII或它的碎片的融合，噬菌體顆粒提供各自在它們表面上編碼的泛素變體。天然的PlII衣殼蛋白出現在噬菌體顆粒中，所以保留它重新感染適當的細菌株的能力，且因此保留擴增的相應的DNA的可能性。因而，確保泛素變體的表現型和它的基因型之間的物理連接，表現型例如，它的潛在的結合性能。根據出現在其上的泛素變體與任何靶分子的結合，例如，ED-B、腫瘤壞死因子、MIA-2、NGF、IgG或其他靶，依靠本領域技術人員已知的方法能選擇獲得的噬菌體顆粒。為了這個目的，出現的泛素變體能短暫地固定在靶物質界限上，例如，微量滴定板上(microtiter plates)且在分離出非結合的變體之后能特定地洗脫。通過基礎溶液優選地實行洗脫，例如IOOmM三乙胺。可替換地，洗脫能在酸性條件下通過蛋白質水解或感染的細菌的直接加入來實行。通過泛素變體選擇和擴增的連續循環，能再次擴增和富集以這種方式獲得的噬菌體顆粒，其中泛素變體具有對例如，ED-B, TNF a、MIA-2、NGF、IgG或任何其他靶分子的結合性能。卩遼菌體展不的變體是Tat卩遼菌體展不技術(Paschke,M. and ff. Hohne (2005). Gene350(1) :79-88; see also EP 1567643)。使用這種方法，由噬菌粒編碼的泛素變體通過雙精氨酸轉運(Tat)系統分泌，雙精氨酸轉運系統輸出折疊的蛋白質，其中已經在細胞質中已經實現這些蛋白質的天然構造(Bruser 2007 Appl Microbiol Biotechnol 76 (I) : 35-45)。分泌的需求是融合到特定的N-末端信號肽上，其指引泛素變體朝向Tat孔。在進入外周胞質空間以后，通過信號肽酶清除N-末端信號肽。在外周胞質空間中，泛素變體然后共價地連接到衣殼蛋白PlII或它的C-末端碎片和其他噬菌體蛋白質上，其中它的C-末端碎片開始通過Sec途徑從細胞 質分泌。通過pill蛋白的N-末端上的Jun亮氨酸拉鏈和泛素變體的C-末端上的Fos亮氨酸拉鏈的高親和力相互作用，實現泛素和pill之間的這種連接。每一個亮氨酸拉鏈的N-和C-末端上外加的半光氨酸能夠在兩種蛋白質之間共價的連接，因此它們也能夠在展示的泛素和它的噬菌體顆粒內的編碼基因產物之間共價的連接。當仍然以噬菌粒的形式，例如，融合到噬菌體上，或以可溶解的蛋白形式相應的基因盒克隆到適當的表達載體上之后，能完成以這種方式獲得的泛素變體的進一步特性。適當的方法是本領域技術人員已知的或著作中描述的。特征能包括例如，DNA序列的測定和因而分離的變體的主要序列。此外,例如,依靠生物化學標準方法例如ELISA或表面等離子共振技術、尺寸篩析色譜法、熒光各向異性、熒光光譜、FACS、等溫滴定量熱法或分析超速離心法，能檢測分離的變體的親和力和特異性。由于穩定性分析，例如與化學或物理伸展有關的分光鏡方法是本領域的那些技術人員已知的。其他已知的方法是CD光譜學、蛋白質熒光光譜和NMR光譜法。本發明的進一步實施例中，在核糖體展示程序中依靠非細胞轉錄/翻譯系統制備泛素變體，且作為具有相應的mRNA和核糖體的復合體出現。為了這種目的，上述描述的DNA庫用作基礎元素，其中變體的基因以與相應的表達和蛋白質生物合成的調整序列的融合的形式出現。由于在基因文庫的3’末端終止密碼子的缺失和由初期的蛋白質組成的三重復合體適當的試驗條件(低溫、高Mg2+濃度),在生物體外轉錄/翻譯期間維持mRNA和核糖體。通過在每一個單體泛素單元中挑選的氨基酸的不同地修飾，已經建立包含異源二聚體修飾的泛素蛋白質的蛋白質庫之后，如果結合親和力確實存在，依照本發明，修飾的二聚體蛋白質與靶分子接觸，以便配體能夠彼此結合。這些蛋白質庫可以以展示方法庫的形式展示，或利用任何其他方法呈現修飾的蛋白質，修飾的蛋白質在一定程度上能夠在修飾的蛋白質和靶蛋白之間接觸，其中所述展示方法可選地是噬菌體展示、核糖體展示、TAT噬菌體展示、細胞表面展示、酵母展示、細菌展示或mRNA展示方法。修飾的異源多聚體泛素蛋白的潛在的配體和靶標(target，靶分子)在下列典型的抗原上已經成功地建立了本發明ED_B、TNF-a、MIA-2, NGF、和IgG0應該理解，僅選擇這些抗原，以便顯示在接收此處提供的信息之后，通過本領域的技術人員沒有過度負擔下能成功地執行目前描述的方法。本發明不限于這些特定的抗原，但是能夠在本領域中已知的所有或至少大多數的配體和靶分子上執行。能夠通過本領域的熟練的工匠在他的常識內選出那些靶分子。下列提供配體和靶分子和抗原和半抗原的一般定義，且也提供選出的進一步潛在的靶分子的實例。依照本發明，通過目前描述的功能比得上抗體的修飾的泛素，抗原將涉及限制物質的能力。用于此處的可替換的術語是“配體”、“結合伴侶”、或“靶分子”。本發明修飾的泛素蛋白提供結合分子，其以相似的方式擔當抗體的作用，且同時避免它的缺陷。術語抗原包括半抗原、肽、蛋白質、糖、DNA等。從Roche Lexikon Medizin(第四版本；Urban&10Fischer/Elsevier GmbH)能獲得下列等義的抗原和半抗原,其也能用于本描述。抗原(AG):通過免疫系統設計用作作為外來物質(非自身的)識別的任何物質。在大多數免疫反應情形中，開始引起免疫性(=“免疫原”)；分別在過敏反應(=“過敏原”)和遺傳性過敏癥(“遺傳過敏原”)的情形中，這種免疫反應是放大的。AG誘導體液(抗原-抗體反應)和/或細胞防衛反應(見下文免疫性)。如果AG是容忍的(免疫耐受性)，經過免疫系統它也被稱作“耐受原”。有效的抗原是主要復合體和更高分子量的物質(蛋白體、多聚糖、核苷和許多合成的復合物)，這些物質具有以化學方法可識別的功能性(決定性的)，這些功能性是造成免疫反應的原因。分類為I)完整的AG，更高分子量的大部分且能夠通過自身發生免疫反應，2)作為低分子質量半抗原(=一半的抗原)，在結合(偶聯)到大的載體分子上之后，其只擔當免疫原的作用。涉及例如作為外來地_、不同的-或同基因的、自體同源的AG ;自體的、異體的、移植、抗癌病毒AG。半抗原簡易的、低分子量的化學化合物，其分別地是造成抗原(AG)特異性的原因，或由于它的結構(決定性的)是造成抗體特異性結合能力的原因，但是與完整的AG相比， 其不能產生過敏反應。在結合到稱為載體的蛋白體上之后，其變成完整的抗原。“配體”或“靶標(靶分子)”或“結合伴侶”是通過目前描述的修飾的異源多聚體泛素蛋白識別的分子。能夠用于本發明的實踐的配體的實例包括，但不限于，用于細胞膜受體的促效劑和拮抗劑、毒素和毒液、病毒抗原決定基、激素、激素受體、多肽、肽、酶、酶底物、輔助因子、毒品(例如麻醉劑、類固醇等)、外源凝集素、糖、核苷酸、核酸、低聚糖、蛋白質、和單克隆抗體。總之，依照本發明，能利用作為結合伴侶的修飾的蛋白質，其提供所有生物學上和醫學上積極的和有關的分子。將在下面以實例的方式描述可能的結合伴侶。然而，應注意，多數其他可能的配體能加入本列。類似于抗體和抗原之間的關系，通過進一步潛在的配體能完成潛在的結合伴侶的列。本發明中，異源二聚體泛素的結合伴侶的實例是纖連蛋白額外域(ED-B)、細胞因子(腫瘤壞死因子a ) (TNF-a )、MIA-2、免疫球蛋白或它的部分，例如完整的抗體，(例如，免疫球蛋白G)，和生長因子(例如，NGF，例如，人類神經生長因子)。下面提供這些配體的簡要描述。然而，強調所有這些配體是多年來本領域所熟知的且是各自技術領域中的專家所熟知的。因此，下列描述只是這些蛋白質的某些重要的參數的概要，因為其氨基酸序列也是已知的。纖連蛋白額外域(ED-B)是小的結構域，其是通過可替換的初級RNA轉錄產物的片段插入到纖維蛋白分子中。已知ED-B涉及癌癥和牛皮癬。顯著地，在幾乎所有人類固體瘤實體的原發損害和新陳代謝位置都檢測到ED-B的高水平表達，包括胸腺癌、直腸癌、非小細胞肺癌、胰腺癌、肝細胞癌、頭和頸和人類皮膚癌、和顱內腦膜瘤、和神經膠母細胞瘤(intracraneal meningioma) (Menrad u. Menssen, 2005)。此外，ED-B 能結合到診斷試劑上且能順利地用作診斷工具。一個實例是它在分子影像中的利用，例如，動脈粥樣硬化斑塊和癌癥的檢測，例如，通過癌癥病人的免疫現象。可能用于許多進一步的診斷。人類纖維蛋白的額外域B (ED-B)的91氨基酸的氨基酸序列在SEQ ID N0:2中示出。為了蛋白質的表達，已加入起始甲硫氨酸。在哺乳動物中ED-B是保守的，例如，在嚙齒動物、牛、靈長類、食肉動物、人類等等中。其中與人類ED-B具有100%序列同一性的動物的實例是褐家鼠(Rattus norvegicus)、牛(Bos taurus)、小家鼠(Mus musculus)、馬(Equus caballus)、稱猴(Macaca mulatta)、家犬(Canis lupus familiaris)、和黑猩猩(Pan troglodytes)。蛋白質MIA (“黑素瘤抑制活性”，也稱作⑶-RAP，“軟骨源性維A酸敏感蛋白”)是在軟骨細胞中表達，且由于它的體外抗增值性能其是最初被分離的。最初它是在黑素瘤細胞的細胞培養上清液(cell culture supernatant)中檢測到的且從那里分離。在蛋白質純化和部分排序之后，在簡并引物(degenerated primers)和RT-PCR (反轉錄聚合酶鏈式反應)的幫助下分離人類MIA cDNA片段。現在已知人類的、小家鼠的、牛的、褐家鼠的和斑馬魚的MIA序列。在EP1410803B1和US-2010/0212037中描述相關蛋白質MIA-2。這些文獻并入此處以供參考。主要通過巨噬細胞制造腫瘤壞死因子- a (TNF-a )，一種多效性細胞因子，但是其他類型的細胞也產生它。證明TNF-a是有益的并具有病理活性。除了具有自我調節外，它具有生長刺激作用和生長抑制兩種性能。TNF-a的有益功能包括通過調節機體的生理周 期性維持動態平衡、對細菌、病毒、真菌和寄生的感染產生免疫反應、通過刺激纖維原細胞生長更替或改變受傷的組織和、如名字所暗示的，殺死某些腫瘤。在多種疾病中，已經暗示TNF-a作為介導媒介(媒介物)。神經生長因子(NGF)是50年前發現的作為促進感覺和交感神經的生存和分化的分子的分泌蛋白質。NGF是已知作為神經營養素的神經營養因子家族的成員。NGF具有高親和力的結合已知作為TrkA的原肌球蛋白受體激酶。NGF也能結合已知的受體p75，腫瘤壞死因子受體超家族的成員，NGF也與其他神經營養素相互作用。NGF的P鏈僅僅負責NGF的神經生長刺激活性。P鏈同源二聚化且并入更大的蛋白復合體中。NGF的結構和功能參考，例如，Sofroniew, M. V. et al. (2001)Annu. Rev. Neurosci. 24:1217-1281;ffeismann, C.and de Vos, A. M. (2001) Cell. MoT Life Sci. 58:748-759;Fahnestock, M. (1991)Curr. Top.Microbiol. Immunol. 165:1—26。IgG抗體是大約150kDa由4條肽鏈組成的大分子。它包括2條大約50kDa的同源重鏈和2條大約25kDa的同源輕鏈，因此是四個一組結構的四聚物。兩條重鏈彼此連接且通過二硫鍵與輕鏈連接。合成的四聚物具有兩個共同形成類Y型的同源部分。分支的每一個末端包含同源的抗原結合位置。IgGs的Fe區域具有高度保守的N-糖基化位點。依附在這個位點上的N-多聚糖是復雜類型的主要的核心巖藻糖化雙觸角結構。此外，少量的這些N-多聚糖的也具有平分的GIcNAc和a_2，6連接的硅鋁酸殘基。用于選擇、富集和特征化所展示的蛋白質的方法能依靠本領域的那些技術人員已知的方法進行異源多聚體修飾的泛素的選擇，這些泛素就它們對于特定的配體的結合活性而言，具有Kd范圍為10_7-10_12M的特定的結合親和力。為了這個目的，出現例如在核糖體的復合體上的泛素變種能分別地短暫地固定在靶物質邊緣上，例如，在微量滴定板上，或能在溶液中結合之后結合在磁性粒子上。在非結合變體的分離之后，具有結合活性的變體的遺傳信息能特定地通過核糖體復合體的破壞以mRNA的形式洗脫。優選地利用EDTA完成洗脫。能分離以這種方式獲得的mRNA且利用適當的方法反轉錄成DNA (反轉錄酶反應)，且能再擴增以這種方式獲得的DNA。
通過體外的轉錄/翻譯、選擇、和擴增的連續循環，能富集對預定的半抗原或抗原具有結合性能的泛素變體。在相應的基因盒克隆到適當的表達載體之后，能以上述詳述的可溶解蛋白質的形式進行以這種方式獲得的泛素變體的進一步表征。適當的方法是本領域的那些技術人員已知的或在文獻中描述的。優選地，在具有對預定的結合伴侶的結合親和力的蛋白質的檢測步驟之后是檢測的蛋白質的分離和/或富集的步驟。在依照本發明修飾的泛素蛋白的表達之后，能通過本身已知的方法進一步純化和富集泛素蛋白質。選擇方法依賴本領域的那些技術人員本身已知的幾種因素，例如，所使用的表達載體、宿主生物體、意欲使用的領域、蛋白質的大小和其他因素。為了簡化純化，依照本發明修飾的蛋白質能融合到具有增加的親和力的其他肽序列上以分離材料。優選地，選擇這種融合，其不能對泛素蛋白的功能性具有有害的影響，或者由于特定蛋白酶斷裂位點的引入能夠在純化之后分離這種融合。這些方法也是本領域的那些技術人員已知的。 作為突變發生的起始點的未修飾的和修飾的泛素蛋白術語“具有結合能力的蛋白質”或“結合蛋白質”涉及包括一個結合域(bindingregion,結合區域)的泛素蛋白質,這個結合域在下面進一步定義。結合域能涉及至少兩個結合決定域(“BDR”)。每一個單體具有至少一個結合決定域；至少兩個單體形成具有至少兩個結合決定域的多聚體，其中至少兩個結合決定域對一個抗原形成一個結合域。任何這種基于泛素的結合蛋白可包括不是結合結構域的附加的蛋白域，例如，多聚化部分(multimerization moieties)、多肽標簽、多肽連接子和/或非蛋白質聚合體分子。非蛋白質聚合體分子的某些實例是輕乙基淀粉(hydroxyethyl starch)、聚乙二醇、聚丙二醇、或聚氧化烯烴(polyoxyalkylene)。例如通過將異源多聚體修飾的泛素蛋白質遺傳翻譯后地融合到具有多聚體化區域的效應分子上(例如，TNF-Q )，也能夠進行異源多聚體修飾的泛素蛋白質的進一步多聚化。仍然進一步的實施例中，通過利用聚乙二醇(PEG)連接子實行進一步的多聚體化。仍然進一步的實施例中，所述多聚體化區域也擔當藥物學上的活性成分；一個實例是擔當多聚體化區域和藥物學成分的TNF-a。修飾的異源多聚體的泛素蛋白術語“修飾的泛素蛋白”涉及泛素蛋白質的修飾，這種修飾是通過氨基酸或它的組合的任何一個取代、插入或缺失實現的，而取代是最優選的修飾，其可通過上述描述的任何一個的修飾來補充。修飾的數目是嚴格地限制為所述修飾的單體泛素單元與SEQ ID NO: I具有的氨基酸同一性為由80%、至少83%、至少85%、至少83%和至少90%構成的組中的至少之一。因此，至多，修飾的氨基酸的總數，優選地在單體單元中的取代限制到相應到80%的氨基酸同一性的15個氨基酸。進一步可替換的是13、12、11、10、9、8、7、6、或5個修飾的氨基酸。二聚體泛素分子中修飾的氨基酸的總數，優選地取代是30個氨基酸，其相當于基于二聚體蛋白質的20%的氨基酸的修飾。進一步可替換的是二聚體泛素分子中28、26、24、22、20、18、16、14、13、12、11、10、9、9、7、6、或 5 個修飾的氨基酸。與由具有 SEQ ID NO: I的基礎單體序列的兩個未修飾的單體泛素蛋白組成的二聚體泛素相比，二聚體修飾的泛素蛋白質的氨基酸同一性是選自由80%、至少83%、至少85%、至少83%和至少90%構成的組中的至少之一。由本發明的方法獲得的修飾的泛素蛋白質是重組設計的蛋白質，其對靶分子或配體或結合分子(其表達可替換地用于此處)具有新的結合親和力。術語“取代”也包括氨基酸的化學修飾，例如通過取代或向最初的氨基酸添加化學基團或殘基。蛋白質的至少一個表面暴露的區域中的氨基酸的取代是至關緊要的，這種表面暴露區域中的氨基酸包括位于P片區域的至少一個P鏈上的氨基酸或放置在臨近3鏈的多達3個氨基酸上的氨基酸。通過本領域已建立的和已知的方法進行修飾。“任意修飾的核苷酸或氨基酸序列”是在許多位置中已經插入、缺失或通過核苷酸或氨基酸取代的核苷酸或氨基酸序列，其本 性是不能預知的。在很多情形中，隨機的核苷酸(氨基酸)或核苷酸(氨基酸)序列的插入將是“完全隨機的”(例如，作為隨機化合成的或PCR-介導的突變發生的結果)。然而，隨機序列也能包含具有共同的功能特征的序列(例如，配體表達產物的反應)或者隨機序列能隨機 的，表現為最終的表達產物具有例如不同氨基酸的平均分配的完全隨機的序列。為了將隨機化的片段恰當地引入載體，依照本發明，按照定點PCR-介導突變的原則隨機核苷酸引入表達載體，這是優選的。然而，對于技術人員其他選項是已知的，和例如將合成的隨機序列庫插入載體，這也是可能的。為了通過融合PCR產生突變體或庫，例如可進行三個PCR反應。進行兩個PCR反應，以便產生部分地重疊的中間片段。進行第三個PCR反應以便融合中間片段。構建庫或突變體變種的方法可包括在期望的限制位點周圍構建第一組引物(限制位點引物)，正向和反向限制引物，和在例如感興趣的密碼子的上游和下游周圍構建第二組弓I物(誘導有機體突變的引物)，正向和反向誘導有機體突變的引物。一個實施例中，直接地在感興趣的密碼子各自的上游和下游構建引物。限制和誘導有機體突變的引物用于構建第一中間片段和第二中間片段。兩個PCR反應產生這些線性中間產物片段。每一個這些線性中間產物片段包含至少一個感興趣的密碼子的突變、側翼核苷酸序列和酶切位點。第三PCR反應使用兩個中間片段和正向和反向限制引物，以便產生融合的線性產物。相反，這里利用限制酶酶切線性產物的獨立末端，以便在線性產物上形成粘性末端。通過DNA連接酶的使用融合線性產物的粘性末端，以便產生環狀產物，例如，環狀多聚核苷酸序列。為了構建中間片段，實行了兩組正向和反向引物的設計和合成，第一組與它的側翼核苷酸序列一起包含限制性酶酶切位點，和第二組包含至少一個感興趣的密碼子的變種(誘導有機體突變的引物)。本領域的那些技術人員將認可，許多變種將依賴許多期望的變種氨基酸的修飾。發明者設想，如果在這個方法中利用其他限制性酶，則可相應地改變這種酶切位點的精確位置和相應的正向和反向引物的序列。本領域可利用其他方法且可代替地使用其他方法。除了依照本發明將表達產物的隨機化片段引入骨架之外，還通過將隨機化的核苷酸序列融合到編碼至少一種融合伴侶的核苷酸序列上來將隨機序列連接到融合伴侶上，這是經常必需的。例如，這種融合伴侶能促進表達和/或純化/分離和/或表達產物的進一步的穩定性。為了純化的目的，融合伴侶能包括純化標簽例如His6標簽、myc標簽、BSP生物素靶序列、BirA、flu標簽、lacZ、和GST。此外，融合伴侶可包括分選信號或靶向序列(targeting sequence) 依照本發明，可利用任何期望的氨基酸進行用于產生對靶分子具有特異性的新的結合結構域的氨基酸的取代，即，為了產生對靶分子的新的結合性能的修飾，并不必須關注氨基酸具有特殊的化學性能或側鏈，其與取代的氨基酸類似，因此任何期望的氨基酸能用于這種目的。依照本發明，優選地通過在遺傳水平上的變異發生，優選地通過隨機的變異發生，即，所選擇的氨基酸的隨機取代，進行所選擇的氨基酸的修飾的步驟。優選地，依靠遺傳工程的方法執行泛素的修飾，這種遺傳工程方法用于屬于各自蛋白質的DNA的改變。優選地，然后在原核或真核生物體中進行泛素蛋白質的表達。特別在0片的四個P鏈的表面暴露的氨基酸中或者在達到3個臨近泛素蛋白的3片鏈的氨基酸的表面暴露氨基酸中進行取代。每一個3鏈通常由5-7個氨基酸組成。對于SEQ ID N0:1，例如，單體泛素的P鏈通常包括氨基酸殘基2-7、12-16、41-45和65-71。額外地和優選地修飾的區域包括臨近P片鏈達到3個氨基酸(例如，1、2或3)的位置。額 外地和優選地修飾的優選區域特別包括氨基酸殘基8-11、62-64和72-75。優選的區域包括連接兩個0鏈的0轉角。例如一個優選的￠-轉角包括例如氨基酸殘基62-64。接近地臨近P鏈的最優選的氨基酸是位置8的氨基酸。另外，氨基酸取代的進一步優選的實例是位置36、44、70、71和/或73。例如，那些可額外地和優選地修飾的區域包括氨基酸62、63和64 (3個氨基酸)，或72、73 (2個氨基酸)，或8 (1個氨基酸)。可添加或缺失的氨基酸的數目限于單體泛素子單元中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14個或更多的氨基酸，和關于異源二聚物泛素蛋白質的1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、24、26或28個氨基酸，通常是單體蛋白質中修飾的數目是X-倍。通常，單體分子中插入的數目包括1-10個氨基酸和/或1-7個氨基酸的缺失。取代的數目是每個單體分子至少6個和最多14個氨基酸的取代。二聚體分子總共包括至少12和最多28個取代，和/或總共至少一個和最多20個插入和/或至少一個和最多14個缺失。本發明能利用在中間的所有數目并涵蓋在本發明中，和缺失、插入和取代數目的所有組合可能提供維持分子的全部結構完整性。本發明的一個實施例中，維持P片結構。可選擇的實施例中，通過氨基酸取代改變氨基酸殘基。然而，也可允許缺失和插入。可添加或缺失的氨基酸數目限于單體泛素子單元中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸，和關于二聚體泛素蛋白相應地1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16個氨基酸。一個實施例中，沒有進行氨基酸的插入。仍然進一步的實施例中，沒有缺失。假如本發明的修飾的泛素蛋白包括權利要求中指定的外加的所述取代和也包括此處說明的缺失和/或一個或更多氨基酸的增加，特定的野生型人類泛素(SEQ ID NO: I)的氨基酸位置必需與修飾的泛素比對，以便彼此分配相應的蛋白質。融合蛋白的情況中(見下文)，以相同的方式完成每一個單體泛素子單元的編號(和比對)，例如，二聚體的比對是在每一個各自的子單元的氨基酸位置I起始的。優選地來自哺乳動物例如人類的單體泛素蛋白中，在P鏈中或在臨近P片鏈達到3個氨基酸的位置至少10%的氨基酸，優選地至少20%，進一步優選地至少25%，能被修飾，優選地被取代。在P鏈中或臨近P片鏈達到3個氨基酸的位置的優選地最多大約50 %的氨基酸，進一步優選地最多大約40 %或大約35 %或高達大約30 %或高達大約25 %是被修飾的，優選地被取代。一個3鏈中，通常一個到四個氨基酸被修飾。一個實施例中，修飾3鏈中六個氨基酸中的兩個，優選地在第一和第四3鏈中，例如，氨基酸殘基2-7或65-71的區域。依照本發明，修飾的單體泛素用作異源多聚物基礎成分，說明了總數達到20%的氨基酸是被修飾的。考慮到這個方面，修飾的泛素蛋白與SEQ ID NO: I的序列同一性至少是80 %。本發明的進一步實施例中，氨基酸水平上的序列同一性是至少83 %、至少85 %、至少87%和更進一步的至少90%、至少92%或至少95%的與SEQ ID N0:1的氨基酸序列的序列同一性。與SEQ ID NO: I的氨基酸序列相比，本發明也包含氨基酸序列同一性超過97%的修飾的泛素蛋白質。本發明的進一步實施例中，已經預修飾的泛素(其中已經修飾位置2、4、6、8、62、63、64、65、66中3或4或5或6或7個氨基酸和/或SEQ ID NO: I的位置68中的氨基酸)被用作進一步修飾的起始位點，以便對靶分子產生結合性能，且可獲得泛素，其中總數達到SEQ ID NO: I的泛素的9、10、11、12、13、14個和最大限度的15個氨基酸被修飾，優選地被取 代。例如，進一步的修飾能包括氨基酸74和75或氨基酸45上的修飾，以便產生更好的穩定性或蛋白質化學性能。依照實例，能以這種方式獲得的作為異源多聚體的蛋白質基礎成分的修飾的單體泛素具有14個取代和缺失。在泛素的氨基酸的總數上這對應大約20%的百分比。這是非常不可思議的且不是預期的，因為通常低得多的百分數已經足夠打亂蛋白質的折置。本發明的一個實施例中，修飾那些氨基酸，以便具有新的結合性能的區域的產生，這些結合性能在蛋白質的表面上形成鄰近區域。以這種方式，能產生鄰近區域，其對目標配體具有結合性能。依照本發明，“鄰近區域”涉及以下由于電荷，立體結構和它們側鏈的疏水性/親水性，氨基酸以相應的方式與它們的環境相互作用。環境可以是溶劑，通常水，或其他分子，例如，空間地接近氨基酸。依靠蛋白質的結構信息和各自軟件，能表征蛋白質的表面。例如，以這種方式能顯現蛋白質的原子和溶劑之間的界面區域，其中這種方式包括如何構成這種界面區域的信息，其表面區域易接近溶劑或在表面上電荷如何分布。例如利用適當的軟件通過這種類型的顯像能顯示鄰近區域。這種方法是本領域那些技術人員已知的。依照本發明，基本上，整個表面暴露區域也能用作表面上的鄰近區域，以便修飾用于新的結合性能的產生。一個實施例中，這種目的的修飾也能包括a-螺旋區域。異源二聚體修飾的泛素蛋白中，結合決定區域包括共同形成的一個鄰近區域的兩個表面暴露區域，一個鄰近區域包括一個結合決定區域的長度的兩倍。在包括0片區域的至少一個P鏈或鄰近P片鏈達到3個氨基酸的位置的蛋白質的至少一個表面暴露的區域中的氨基酸的修飾是至關緊要的。片結構”定義為基本上是片狀的且幾乎是完全伸展的。與由連續的多肽鏈部分形成的a螺旋相比，P片能由不同的多肽鏈區域形成。這種方式中，在主要的結構中進一步分離空開的區域能進入彼此親近區域。3鏈代表性地具有5-10個氨基酸的長度(泛素中通常5-6個殘基)且具有幾乎完全伸長的構造。P鏈彼此如此接近因此一個鏈的C-O基團和另一個鏈的NH基團之間形成氫鍵，反之亦然。P片能由幾條鏈形成且具有片狀結構，其中C a原子的位置交替地在片狀平面的上面或下面之間。氨基酸側鏈沿著這種模式和，因此，可替換地點對著頂端或對著底部。依靠P鏈的方向，片可分為平行和反平行片。依照本發明，兩者都能轉換且用于制備需要的蛋白質。對于0片結構的變異發生，在接近表面的泛素中選擇0鏈區域或鄰近0片鏈達到3個氨基酸的位置。使用相關的有用的X-射線晶體學結構能識別表面暴露的氨基酸。如果晶體學結構是不可用的，依靠計算機分析做出嘗試，以便預知表面暴露的P片區域和關于有用的一級結構的個別氨基酸的可達性或者模擬3d蛋白質結構和用這種方式獲得關于潛在的表面暴露的氨基酸的信息。能進一步結合它的公開，例如，J. Mol. Biol.，1987 Apr5; 194 (3) : 531-44. Vijay-Kumar S，Bugg C. E.，Cook ff. J.。然而，在P片中或鄰近P片鏈達到3個氨基酸的位置實行修飾也是可能的，因為能省略被誘變的氨基酸位置的消耗時間的預選。編碼P片結構或鄰近P片鏈達到3個氨基酸的那些DNA區域是從它們的DNA環境中分離的，這些DNA環境受到隨意的突變發生和然后那些DNA區域再恢復成譯碼蛋白質的DNA，它們是先前從蛋白質中清除的。這之后跟隨的是具有期望的結合性能的突變體的選擇工藝。
本發明的另一個實施例中，P鏈區域或表面附近鄰近P片鏈多達3個氨基酸，像上述解釋過的那樣被選擇，且在這些選擇的區域內識別將被誘變的氨基酸位置。用這種方法選取的氨基酸位置可在DNA的水平被誘變，也通過位置導向的突變，也就是說，一個特定的氨基酸密碼子譯碼被另外一個之前選擇的密碼子編碼氨基酸所代替，或者這種突變在隨機突變的環境下執行，其中，定義即將被取代的氨基酸位置，但它不是新的密碼子編碼，也不是決定的氨基酸。表面暴露的氨基酸是易受周圍溶劑影響的氨基酸。與三態甘氨酸-X-甘氨酸模式中的氨基酸的易受影響性相比，如果蛋白質中的氨基酸的易受影響性超過8%，則氨基酸就被稱為“表面暴露的”。這些蛋白質區域或個別的氨基酸位置也分別是潛在的結合伴侶優選的結合位置，因為結合伴侶的選擇將依照本發明實行。另外，參考Casteret al, 1983 Science, 221，709-713，和 Shrake&Rupley,1973 J Mol Biol. 79(2):351-371,其全部的公開包含在這個申請中以供參考。通過各自序列片段的定向突變，能夠產生泛素變體。這種變體不同于在重新產生的來自于親本蛋白質和來自于各自的蛋白質的人造結合位置區域的氨基酸置換。在此情形下，具有某些性質，例如極性、電荷、溶解性、疏水性或親水性的氨基酸，能分別被具有其他特性的氨基酸代替或取代。除了取代之外，術語“變異發生”與“修飾”和“代替”也包括插入和缺失。依照本領域技術人員所知的方法，也能通過氨基酸側鏈的化學變化完成蛋白質水平上的修飾。泛素變異發生的方法作為各自序列片段突變發生的起始點，例如泛素的cDNA，其能通過利用本領域的那些技術人員已知的方法制備、改變、和擴增。對于相對小的第一序列(大約1-3個氨基酸)的區域中泛素的位置特定的改變，商業上可用的反應物和方法是現有的(“迅速的改變”，Stratagene ;“誘變劑曬菌粒體外變異發生裝置”，Biorad)。例如,對于聚合酶鏈式反應(PCR)的更大區域特定實施例的位置定向的變異發生是本領域那些技術人員可利用的。對于這種在期望的位置上合成具有退火堿基對組成的寡脫氧核苷酸的混合物的目的可被利用，例如用于突變的引入。這也能通過利用堿基對類似物獲得，堿基對類似物不能自然地出現在染色體組DNA中，例如，次黃嘌呤核苷。起始點對于0片區域的一個或更多P鏈或鄰近P片鏈多達3個氨基酸的位置的變異發生可以是例如泛素的cDNA或也能是染色體組DNA。此外，用于泛素蛋白質的基因譯碼也能是合成制備。本發明的一個實施例中，變異發生是通過攜帶氨基酸密碼子NNK的DNA寡核苷酸的裝配來完成的。然而，應該理解，也能利用其他密碼子(三聯密碼)。突變是在P片結構優選地維持的方式中執行的。通常，變異形成發生在暴露在蛋白質表面上的穩定的@片區域的外面上。它包括位置指定變異和隨意變異兩種。位置特定的變異在原始結構中包括相對小的區域(大約3-5個氨基酸),此種變異能利用商業上可用的裝置Stratagene⑩(QuickChange (R))或 Bio-Rad ⑩ Mutagene _ phagemid in vitro mutagenesis kit) (cf.US 5，789，166;US 4，873，192)產生。如果更多的延伸區域隸屬于位置特定的變異，則必需制備DNA盒，其中，誘變的區域是通過包含突變和未改變位置的寡核苷酸的裝配獲得(Nord et al, 1997 Nat.Biotechnol. 8，772-777;McConell and Hoess, 1995 J. Mol. Biol. 250，460-470.)。通過在致突變菌株中DNA的繁殖或通過PCR擴增(易錯PCR)能引起隨機變異的發生(例如，Pannekoek et al., 1993 Genel28, 135 140)。為了這個目的，使用具有增加錯誤率的聚合酶。為了分別增強引入的變異形成的程度或聯合不同的突變，通過DNA改組的方法，組合PCR片段中的突變(Stemmer，1994 Nature 370, 10 389-391 )。這些關于酶的變異形成的策略的評論是在Kuchner和Arnold (1997) TIBTECH15, 523-530的評論中提供的。為了在選擇的DNA區域完成隨機變異形成，也必需構建用于變異形成的DNA盒。已知本質上用于變異發生的不同的程序是用于位置特定的突變發生的方法、用于隨機變異發生的方法、利用PCR或類似的方法的變異。本發明的優選的實施例中，誘變的氨基酸位置是預先確定的。完成要修飾的氨基酸的選擇，以便滿足本權利要求I關于那些必需要修飾的氨基酸的限制。每一個情形中，通常建立不同突變異種的庫，其是利用本質上已知的方法進行篩選的。通常，要修飾的氨基酸的預選能特別容易地執行，因為對于要修飾的泛素蛋白質而言，有足夠的結構信息可用。對于定向變異和更長序列片段變異發生的方法，例如，依靠PCR，通過化學的變異發生或利用細菌突變菌株，屬于以前的技術，依據本發明，這些方法也是可以用的。本發明的一個實施例中，變異發生是通過攜帶氨基酸密碼子NNK的DNA寡核苷酸的裝配來完成的。然而，應該理解，也能利用其他密碼子(三聯密碼)。突變是在P片結構優選地維持的方式中執行的。通常，變異形成發生在暴露在蛋白質表面上的穩定的@片區域的外面上。它包括位置指定變異和隨意變異兩種。位置特定的變異在原始結構中包括相對小的區域(大約3-5個氨基酸),此種變異能利用商業上可用的裝置Stratagene _(QuickChange (R))或 Bio-Rad ⑩ Mutagene _ phagemid in vitro mutagenesis kit) (cf.US 5，789，166;US 4，873，192)產生。如果更多的延伸區域隸屬于位置特定的變異，則必需制備DNA盒，其中，誘變的區域是通過包含突變和未改變位置的寡核苷酸的裝配獲得(Nord et al, 1997 Nat.Biotechnol. 8，772-777;McConell and Hoess, 1995 J. Mol. Biol. 250，460-470.)。通過在致突變菌株中DNA的繁殖或通過PCR擴增(易錯PCR)能引起隨機變異的發生(例如，Pannekoeket al., 1993 Genel28, 135 140)。為了這個目的，使用具有增加錯誤率的聚合酶。為了分別增強引入的變異形成的程度或聯合不同的突變，通過DNA改組的方法，組合PCR片段中的突變(Stemmer, 1994 Nature 370, 10 389-391 )。這些關于酶的變異形成的策略的評論是在Kuchner和Arnold (1997) TIBTECH15, 523-530的評論中提供的。為了在選擇的DNA區域完成隨機變異形成，也必需構建用于變異形成的DNA盒。依照本發明的一個實例，能特別容易地依靠PCR執行在單體泛素的位置2、4、6、8、62、62、64、65、66和/或68上的至少3個，更優的是至少6個氨基酸的隨機取代，因為提及的位置是局部化接近蛋白質的氨基或羧基末端。相應地，要處理的密碼子是在相對應的cDNA鏈的5’和3’端。因而，用作誘變的PCR反應的第一寡核苷酸——遠離要變異的位置 2、4、6、和/或8上的密碼子一與泛素的氨基末端的譯碼鏈的序列一致。因此，第二寡核
苷酸-遠離要變異的位置62、63、64、65、66和/或68的密碼子-至少部分地對應非譯
碼鏈的多肽序列的羧基末端。利用作為模板的編碼單體泛素蛋白的DNA序列，通過兩種寡核苷酸，可完成聚合酶鏈式反應。此外，利用側面寡核苷酸能將獲得的擴增產物添加到另一個聚合酶鏈式反應中，其中寡核苷酸為限制性核酸內切酶引入識別序列。依照本發明，首選的是將獲得的基因盒引入到載體系統，載體系統適用于后來的選擇過程，選擇過程用于對預定的半抗原或抗原具有結合性能的泛素變體的分離。依照本發明，可使用任何例如用于修飾的氨基酸實行氨基酸的取代，其用于對靶分子特定的新的結合區域的產生，以便對靶分子產生新的結合性能，注意氨基酸分別具有具體的化學性能或側鏈，這不是強制性的，這類似于氨基酸的取代酸，因此任何期望的氨基 酸能被用于這種目的。依照本發明，優選地通過遺傳水平上變異發生通過隨機的變異發生，實行選擇的氨基酸的修飾步驟，例如，選擇的氨基酸的隨機取代。優選地，依靠遺傳工程的方法執行泛素的修飾，其中遺傳工程方法用于屬于各自蛋白質的DNA的改變。優選地，然后在原核或真核生物體中執行泛素蛋白的表達。依照本發明，通過化學合成能進一步優選地制備修飾的泛素蛋白質。優選的實施例中，通過氨基酸取代改變氨基酸殘基。然而，也允許缺失和插入。可選地，要插入或缺失的氨基酸的數目是I比10，1比5，2，3或4個氨基酸。一個實施例中，沒有做出氨基酸的插入。一個仍然進一步的實施例中，沒有實行缺失。在做出上述的修飾之后，發明家已發現實施例中描述的氨基酸修飾的泛素序列， 這些泛素序列結合它們的靶分子具有很高的親和力(Kd值達到IO-wMX泛素中要修飾的區域根據它們是否是選擇的結合伴侶有用的和蛋白質的總體結構是否可能忍受修飾，從根本上選擇修飾的區域。除了表面暴露P鏈中的修飾之外，也能在蛋白質的其他表面暴露的區域中進行修飾，優選地在鄰近3鏈高達3個氨基酸的位置中。這些修飾區域都涉及對靶分子重新產生的具有聞未和力的結合。依照本發明另一個優選的實施例，能在單體泛素中修飾泛素、優選地哺乳動物或人類泛素的至少3或4或6個,可選地至少8、10、12個和最大15個表面暴露的氨基酸,其中優選的取代作為修飾。這包括泛素的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15個表面暴露的氨基酸的修飾。這些至少3個和最大15個表面暴露的修飾的氨基酸然后形成對預先確定的結合伴侶具有結合親和力的區域。此處這個區域被定義為“結合域區域”(“BDR”)。這個方面中，至少2個，可選地至少4個，進一步可選地至少6、8、10、12個和最大15個表面暴露的氨基酸是在P片區域中，例如，^片鏈中或分布在幾個P鏈上或鄰近P片鏈高達3個氨基酸的位置上，這是顯著地優選的。所有修飾、優選地取代的氨基酸中的至少3個氨基酸是在初始序列中彼此直接地鄰近，這是進一步優選的。本發明的另一個可選擇的實施例中，蛋白質中四個P鏈的一個或兩個，優選地兩個中的氨基酸或鄰近優選地四個3鏈中的兩個的高達3個氨基酸的位置上的氨基酸進行修飾，以便產生新的結合性能。可選擇的是四個P鏈的三個或四個中的氨基酸或臨近3鏈的三個或四個的高達3個氨基酸的位置的氨基酸的用于產生對選擇的靶分子或配體的結合的修飾。 對氨基末端和羧基末端鏈或者鄰近氨基末端和羧基末端鏈的高達3個氨基酸的位置中的氨基酸進行修飾，優選地取代，以便對配體或靶分子產生新的結合位置，這是顯著地優選的。這個方面中，顯著地優選的是，鄰近羧基末端3片鏈的高達3個氨基酸被修飾，優選地取代，和修飾鄰近氨基末端3片鏈達到I個氨基酸，優選地取代。依照本發明，在它的氨基酸中修飾泛素，優選地通過取代，在哺乳動物泛素的下列位置的至少三個氨基酸中，優選地人類泛素2、4、6、8、62、63、64、65、66、68。這些所述氨基酸的組中的至少三個氨基酸在泛素表面上形成鄰近的表面暴露區域，其中發現泛素顯著地適于具有結合親和力的修飾的蛋白質的產生，對于特定的結合伴侶，例如，ED-B, TNF a，NGF, IgG, MIA-2,或者任何其他靶分子，結合親和力是先前不存在的。必需修飾這些氨基酸殘基中的至少三個。可選地修飾所述氨基酸殘基的3、4、5、6、7、8、9或10位，優選地取代，可選地與附加的氨基酸殘基結合。為了確定泛素衍生物與SEQ ID NO: I的氨基酸序列的序列同一性的程度的目的，例如，能利用 SIM Local 類似地程序(Xiaoquin Huang and Webb Miller, " Advances inApplied Mathematics, 20 vol. 12:337-357，1991)，能自由的使用作者和他們的協會有用的多重聯合分析(Thompson et al. , Nucleic Acids Res.，22 (22) : 4673-4680，1994.)。優選地，相對于SEQ ID NO: I的完整序列，衍生物與SEQ ID NO: I的序列同一性的程度是確定的。決定結合親和力的方法是本身已知的，且能從下列方法中選出ELISA、表面等離子共振技術(SPR)基礎技術、例如通過Biacore⑩提供的、尺寸篩析色譜法、熒光各向異性、熒光光譜和等溫滴定量熱儀(ITC)。仍然進一步方法，本發明涉及包括本發明的異源多聚體結合蛋白的融合蛋白，這種融合蛋白融合到藥學上和/或診斷上的有效部分上；做出參考，例如US 7，838，629，其全部內容包括在此以供參考。本發明的融合蛋白可包括非多肽成分，例如，非肽連接子、非肽配體，例如用于治療學上或診斷上相關的放射性核素。它也可包括小的有機的或非氨基酸基礎的混合物，例如，糖、寡聚或多聚糖、脂肪酸，等等。本發明的一個優選的實施例中，以泛素為基礎的結合分子連接到肽、以氨基酸基礎的連接子或配體或蛋白質上，其中蛋白質具有治療學上或診斷上相關的性能。結合特異性(分離常數)
依照本發明，融合蛋白的結合特異性是如上定義的對于非融合蛋白的Kd定義。依照本發明，術語“Kd”定義特定的結合親和力，其根據本發明在范圍10_7-10_12M之內。10_5M和以下的值能夠被認為是可定量的結合親和力。依照本申請，10_7到10_nM的值優選的用于例如色析法應用，或者10-9到KT12M是用于例如診斷或治療的應用。進一步優選的結合親和力范圍為Kr7到KTiqM,優選地到l(TnM。泛素的多聚化依照本發明，遺傳上通過首尾融合連接的至少兩個不同地修飾的泛素單體結合到靶分子的相同抗原決定基上，例如，ED-B, TNFa、IgG, Mia-2, NGF或者任何其他靶分子上，且只有當兩個結合域區域共同起作用則兩個不同地修飾的泛素單體是有效的。或者換句話說，他們通過單個鄰近的結合區域結合到相同的抗原決定基上，其中單個鄰近的結合區域是由兩個分子的兩個結合區域的共同作用形成的。
單體能直接地連接或通過連接子連接。適當優選的連接子是SEQ ID N0:32的那些，或具有至少序列GIG，或者具有至少序列SGGGG或任何其他連接子，例如GIG、SGGGG,SGGGGIG、SGGGGSGGGGIG或者SGGGGSGGGG。然而，有很多可能用于替代的連接子。庫進一步的方面，本發明涉及在包含編碼上述描述的修飾的單體泛素蛋白的DNA庫，其形成提供本發明的異源多聚體、優選地異源二聚體泛素蛋白質的基礎。本發明仍然進一步的方面中，提供包括DNA的融合庫，其中DNA是通過如上述詳述的兩個庫融合獲得的；為了獲得異源二聚體泛素融合蛋白，每一個庫編碼不同地修飾的單體泛素蛋白單元，它的單體單元以首尾排列連接在一起。所述編碼泛素的異源二聚體的融 合蛋白的庫對特定的靶分子表現單價的結合活性。通過利用任何一個本領域技術人員已知的連接子或者此處描述的連接子實行所述的連接。“不同地修飾”也包括異源二聚體蛋白質中出現的一個可替換的未修飾分子。實施例I略述復合體庫的產物。然而，必需當心關于這種庫的質量。骨架技術中庫的質量是首先依靠它的復雜性(單獨變體的數目)和功能性(合成的候選物的結構和蛋白質化學整體性)。然而，兩種特征可彼此表現負面影響通過骨架上修飾的位置的數目的增加增強庫的復雜性，可導致變體的蛋白質化學特征的退化。這可能導致減少的溶解性、聚集和/或低產量。這樣的原因是天然的骨架更大的反常，天然的骨架具有積極地有利的蛋白 質包裝。因此，原始序列中引入盡可能多的變體以便為靶分子最優化它，另一方面，盡可能保存原始的最初序列以便避免蛋白質化學的負面效果，在這兩者之間適當地構建這種骨架庫，這是平衡操作。異源二聚泛素蛋白中特定的修飾依照本發明，泛素的異源二聚體對配體結合具有的Kd = 10_7_10_12M，且關于所述配體表現單價的結合活性，從下列兩個可替換方案中選出泛素的異源二聚體(I)第一單體單元中至少在氨基酸位置6、8、63、64、65、和、66的取代；和在第二單體單元中至少在氨基酸位置6、8、62、63、64、65、和66的取代；可選地另加在位置2的取代，和(2)第一單體單元中至少在氨基酸位置2、4、6、62、63、64、65和66的取代；和
第二單體單元中至少在氨基酸位置6、8、62、63、64、65和66，可選地另加位置2的取代。一個實施例中，融合蛋白是所述泛素蛋白質的遺傳上的融合二聚物，其中泛素蛋白在第一泛素單體的位置6、8、63-66的氨基酸取代和在第二泛素單體的位置6、8、62-66、和可選地位置2的氨基酸殘基取代，優選地-第一泛素單體中的取代位置6上的賴氨酸(K)到色氨酸(W)或苯丙氨酸(F)，位置8上的亮氨酸(L)到色氨酸或苯丙氨酸(W，F)，位置63，25上的賴氨酸(K)到精氨酸(R)或組氨酸(H)， 位置64上的谷氨酸(E)到賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)，位置65上的絲氨酸(S)到苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)和位置66中的蘇氨酸(T)脯氨酸(P);-第二泛素單體中，優選的取代是位置6上的賴氨酸(K)到蘇氨酸(T)、天冬酰胺(N)、絲氨酸(S)或谷酰胺(Q)，位置8上的亮氨酸(L)到谷酰胺(Q)或蘇氨酸(T)或天冬酰胺(N)或絲氨酸(S)，位置62上的谷酰胺(Q)到色氨酸(W)或苯丙氨酸(F)，位置63上的賴氨酸(K)到絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、天冬酰胺(N)或谷酰胺(Q)，位置64上的谷氨酸(E)到天冬酰胺(N)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、或谷酰胺(Q)，位置65上的絲氨酸(S)到苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)，和位置66上的蘇氨酸(T)到谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，和位置2上可選地谷氨酰胺(Q)到精氨酸(R)、組氨酸(H)或賴氨酸(K)。這些每個單體中可替換的取代能彼此沒有任何限制的結合，假設合成的修飾的泛素異源二聚體對所述配體顯示特定的結合親和力Kd = 10_7-10_12M，且關于所述配體表現單價的結合活性，條件是沒有破壞或妨礙泛素蛋白的結構穩定性。最優選的是下列取代(I)第一單體單元中至少 K6W、L8W、K63R、E64K、S65F、和 T66P ；和第二單體單元中至少1(61\180、0621、1(635、￡64隊565、和166￡；可選地另加Q2R，或者(2)第一單體單元中至少 Q2T、F4W、K6H、Q62N、K63F、E64K、S65L、和 T66S ；和第二單體單元至少位置6、8、62、63、64、65、和66中的修飾，進一步可選地第二單體單元中至少K6X、L8X、Q62X、K63X、E64X、S65X、和 T66X ;可選地另加 Q2X，
其中X能是任何氨基酸。顯著地優選的是下列第一泛素單體中的取代，以便產生對ED-B的結合蛋白2 :Q — T、4 F — W、6 K — H、62 Q — N、63 K — F、64 E — K、65 S — L、66 T — S。沒有使用連接子或能使用任何連接子來連接兩個單體的首尾。優選地連接子是SEQ ID NO: 32的那些或者序列GIG或者SGGGGIG或者SGGGGSGGGGIG。一個優選的實施例中，具有兩個共同起作用的結合決定區域的、結合配體ED-B的泛素異源二聚物包括SEQ ID NO: 33或34的氨基酸序列。本發明優選的包括作為藥學上有效部分的TNF-a的融合蛋白具有SEQ ID N0:35或36的序列。另一個實施例中，具有兩個共同起作用的結合決定區域的、結合配體ED-B的泛素異源二聚物包括圖11的氨基酸序列，與 SEQ ID NO:XX 對應。由下列序列提供進一步優選的蛋白質，其中XXXX可以是任何氨基酸(SEQ IDN0:47)。MTIWVHTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNINFKLSLHLVLRLRGGSGGGGSGGGGIGMQTFVXTXTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNTXXXXXLHLVLRLRGG圖11中示出具有這些序列的蛋白質的實例。作為連接子，SGGGGSGGGGIG用于此處應該理解，其他類型的連接子或沒有連接子也是切實可行的可替換方案。本發明的多聚核苷酸、宿主細胞載體本發明進一步的方面中，本發明也包括多聚核苷酸，其編碼之前描述的蛋白質或融合蛋白質。此外，本發明包含包括所述多聚核苷酸的載體。本發明的另外的方面中，宿主細胞包括此處描述的蛋白質或融合蛋白質和/或編碼所述重組蛋白的多聚核苷酸或本發明的融合蛋白或包含所述多聚核苷酸的載體。修飾的異源多聚體的泛素分子的用途本發明具有以高親和力結合配體的能力的修飾的泛素蛋白用于例如制備用于體內或體外使用的診斷工具和治療工具。依照本發明，例如，蛋白質能用作直接的效應分子(解調劑、拮抗劑、促效劑)或抗原識別域。人類和獸醫領域中，能通過本身已知的方法制備醫學治療和預防藥學上有效的藥物，其包含至少一個根據本發明修飾的異源二聚體泛素蛋白。依靠草本制劑的制備，這些組合物能通過注射或灌輸、全身給藥、直腸給藥、腹膜給藥、肌肉給藥、皮下給藥、皮膚給藥或通過其他按照慣例上使用的應用方法腸胃外給予。藥物的制備的類型依賴要治療的疾病的類型、疾病的嚴重程度、要治療的病人和其他藥學領域那些技術人員已知的因素。取決于挑選的融合伴侶，本發明的藥學的組合物適于指導疾病的治療，其中靶分子是豐富的。組合物適于包含治療學上的有效劑量。要執行的劑量的質量依賴要治療的有機體、疾病的類型、病人的年齡和體重和本身已知的進一步的因素。組合物包含藥學上或診斷上可接收的載體且能可選地包含進一步的輔助劑和本身已知的賦形劑。這些包括但不限于，例如，穩定劑、表面活性劑、鹽、緩沖液、著色劑等等。藥物組合物能以液體制備、乳劑、用于局部滴旋的洗劑、氣霧劑形式，以粉末、顆粒、藥片、栓劑或者膠囊的形式，以乳劑或脂質體(liposomal)制備的形式。組合物優選的是無菌的、非高溫和等張的，且包含藥學上傳統的和可接收的本身已知的添加劑。此外，已做出參考美國藥典或Remington' s藥物科學(Mac Publishing Company (1990)) 的規則。依照本發明，“藥物組合物”可以組合物的形式出現，其中不同的有效成分和稀釋劑和/或載體是彼此混合的，或者采取組合制備的形式，其中有效成分以部分地或完全地不同的形式出現。這種組合或組合制備的實例是多部分的試劑盒(kit-of-parts)。依照本發明，“組合物”包括至少兩種制藥學上的活性化合物。這些化合物能利用一分鐘到幾天的時間間隔同時地或個別地給予。化合物能通過相同的途徑或不同地途徑給予；例如，一種活性化合物的口服給予和另外的腸胃外給藥都是可能的。活性化合物也可以配制在一種藥物中，例如，在一種輸注溶液中或作為包括分別配制的兩種化合物的試劑盒中配制。兩種化合物在兩個或更多包裝中出現，這也是可能的。進一步的實施例中，制物組合物是以多部分的試劑盒的形式，為本發明的組合的泛素蛋白質/融合蛋白質和為一個或更多化學治療藥提供分離的實體。依照本發明，可通過很多傳統的和已知的技術中的任何一個，例如普通的有機合成策略，固相合成技術(solid phase-assisted synthesis techniques)或者通過商業上可用的自動化的合成器制備修飾的泛素蛋白。另一方面，也可單獨通過傳統的重組技術或與傳統的合成技術組合來制備修飾的泛素蛋白。可選地，可通過遺傳工程在DNA水平上進行修飾，且在原核或真核生物體中或體外表達修飾的蛋白質。進一步的實施例中，所述修飾步驟包括化學合成步驟。本發明的一個方面，通過遺傳上融合兩個DNA庫獲得所述不同地修飾的蛋白質的群，其中這兩個DNA庫各自編碼不同地修飾的單體泛素蛋白。


圖I顯示具有結合決定區域(稱為BDRl)的前面(第一)修飾的泛素單體與一個具有結合決定區域的不同修改的后面(第二)泛素單體(稱為BDR2)的結合(recombination,重組)，以便產生異源二聚體，導致對ED-B親和力的顯著增加和結合特異性的增加。通過Biacore 、熒光各向異性、細胞上的結合、和組織切片方法分析修飾的泛素分子。顯示幾種異源二聚體泛素變體與人類ED-B結合的濃度依賴ELISAs (con. -ELISA)。圖IA顯示結合親和力Kd = 9. 4 ii M = 9. 45 X IO^6M的單體41B10 (這里SPWF28-41B10th)o封閉的環顯示第一單體41B10與碎片67B89的結合，碎片67B89代表纖連蛋白的額外域-B。對照組碎片6789不包含ED-B且以空心環示出。圖IB顯示異源二聚體泛素的結合親和力。異源二聚體包含與不同的第二單體結合導致變體46H9的第一單體41B10 (這里SPWF28-46H9th)。與圖IA中示出的單體相比，由于兩種單體與祀分子ED-B的單價結合(Kd = 131nM = I. 3X 10_7M ;這里封閉環示出的67B89)，46H9的結合親和力是大量增加的。對照組碎片6789不包含ED-B且以空心環示出。圖2顯示融合到細胞因子上的以修飾的泛素為基礎的(或稱“修飾的基于泛素的”)結合ED-B的異源二聚體分子的親和力和活性。圖2A顯示以修飾的泛素為基礎的結合ED-B的異源二聚體24H12的高親和力(Kd50. 7nM = 5X 1(T8M)。封閉環顯示24H12與EDB的結合；利用24H12與BSA (牛血清蛋白)的結合(空心環)作為陰性對照。圖2B顯示融合到細胞因子TNF a上的以修飾的泛素為基礎的結合ED-B的異源二聚體24H12的親和力提高，導致異源二聚體24H12的多聚化(Kd = 5. 6nM = 5. 6X10_9M)。圖2C顯示選自異源二聚體修飾的泛素庫選擇的典型的候選物的分析，例如異源二聚物變體9E12、22D1、24H12、和41B10。與用作對照組的胞液纖連蛋白(c_FN)相比，靶分 子ED-B的ELISA Kd值是增加的，證實對靶分子的特異性結合。圖2D顯示利用Biacore⑩通過非標記相互作用技術(label-free interactionassays),修飾的異源二聚體泛素分子9E12的分析的結果。針對結合固定在芯片(Biacore)上的ED-B，分析(察看圖例9E12的0-15微M)異源二聚體泛素變體的不同濃度，以便分析異源二聚體變體9E12和ED-B之間的相互作用。不能通過分析聯合和分離的曲線來決定Kd0圖2E顯示利用Biacore⑩通過非標記相互作用技術(label-free interactionassays)對修飾的異源二聚體泛素分子41B10進行分析的結果。針對結合固定在芯片(Biocore)上的ED-B，分析異源二聚體泛素變體的不同濃度(參見圖例0-15 y M的41B10)，以便分析異源二聚體變體41B10和ED-B之間的相互作用。分析聯合和分離的曲線形成623nM (6. 2X I(T7M)的 Kd。
圖3顯示不同修飾的基于泛素的變體對結合親和力和特異性的貢獻。不同的變體共有共同的序列模塊，其用下面的框中字母標出。針對變體的ED-B結合來分析變體。圖3顯示導致修飾的泛素異源二聚體的單體的不同組合。異源二聚體變體46-A5、50-Gll和46-H4具有所有相同的帶有BDRl (圖中用字母“a”標注)的第一(前面)修飾的單體，但是第二 (后面)泛素單體在不同的位置修飾，具有BDR2。與具有BDRl的46-H9相比，變體52-D和52-B3具有不同的第一(前面)修飾的單體，但是具有相同的帶有BDR2 (用字母“e”標注)第二 (后面)泛素單體。修飾的泛素異源二聚體具有下列序列46-H4:SEQ ID NO:25、45_H9:SEQ IDN0:26、46-A5:SEQ ID NO:27、50_G11:SEQ ID NO:28、52_B3:SEQ ID NO:29、52_D10:SEQ IDNO :30通過添加具有序列LEHHHHHH (SEQ ID NO: 31)的His-標簽在實驗期間修飾上述描述的序列。如能從圖3看出，46-H4對ED-B具有極好的結合親和力(Kd= 189nM);與46-H4對ED-B相比，46-A5和52-D沒有結合活性，而其他修飾的泛素蛋白提供較小的結合活性。因此能推論在異源二聚體變體中的兩種單體要求以高親和力結合靶分子；兩種單體均顯示對革巴分子的單價結合。正如與野生型泛素單體相比，通過下列兩種單體中的兩個結合域區域中的氨基酸置換，識別命名為46H9的具有高ED-B結合活性的修飾的泛素異源二聚物第一模塊中(BDRl)(a) Q2G、F4V、K6R、Q62P、K63H、E64A、S65T、T66L第二模塊中(BDR2)(e)K6H、L8M、Q62K、K63P、E64I、S65A、T66E50G11第一模塊中(46H9)(a) Q2G、F4V、K6R、Q62P、K63H、E64P、S65T、T66L第二模塊中(c)K6M、L8R、Q62M、K63N、E64A、S65R、T66L46H4第一模塊中(46H9)(a) Q2G、F4V、K6R、Q62P、K63H、E64P、S65T、T66L第二模塊中(d)K6G、L8W、Q62T、K63Q、E64Q、S65T、T66R52B3第一模塊中(g)Q2R、F4P、K6Y、Q62P、K63P、E64F、S65A、T66R第二模塊中(46H9)K6H、L8M、Q62K、K63P、E64I、S65A、T66E52D10 (非-ED-B 結合物)
第一模塊中Q2V、F4C、K6R、Q62T、K63A、E64P、S65G、T66D第二模塊中(46H9)(e) K6H、L8M、Q62K、K63P、E64I、S65A、T66E46A5 (非-ED-B 結合物)第一模塊中(46H9)(a) Q2G、F4V、K6R、Q62P、K63H、E64P、S65T、T66L第二模塊中(b)K6L、L8M、Q62L、K63A、E64F、S65A,圖4顯示序列比對(alignment)。行I :野生型泛素蛋白的兩個單體(第一行)是從位置77起始并在位置88終止與12-氨基酸連接子SGGGGSGGGGIG連接在一起；具有BDR2的第二單體在位置89上以甲硫氨酸開始。這種二聚物野生型泛素蛋白與修飾的泛素異源 二聚物變體46-H9 (第二行)比對，變體46-H9在第二和第二單體中具有不同的修飾，產生兩個BDRs。由于對靶的單價結合，兩個BDRs在靶的結合中共同起作用。圖5顯示修飾的泛素異源二聚物變體1041-D11 (第一行)與“Ub2_TsX9”(在兩種單體與位置45對色氨酸修飾的泛素)的序列比對，顯示兩種單體之間連接子GIG (位置77到79 ;第二單體在位置88上以甲硫氨酸開始)，和在第二單體最后的C-末端氨基酸上甘氨酸到丙氨酸的交換。第三行顯示“Ubi-Dimer wt”，作為二聚物的野生型泛素；顯示沒有連接子對齊(從而，第二單體在位置77上以甲硫氨酸開始)。第四行顯示人類野生型泛素“Ubi-Monomer wt”。圖6顯示異源二聚物泛素變體1041-D11與人類ED-B的結合的濃度依賴的ELISA。變體1041-D11對結合ED-B顯示非常高的親和力(Kd = 6. 9nM = 6. 9X 1(T9M)。與這種變體對陰性對照的沒有結合相比(涉及6789-tO)(空心環)，封閉的圓點顯示異源二聚物泛素變體1041-D11對包含纖連蛋白碎片(涉及67B89-tO)的ED-B的結合的親和力。圖7顯示在自由靶分子數量漸增的情況下，異源二聚體泛素變體1041-D11與包含纖連蛋白碎片(67B89)的固定的ED-B的結合的競爭性濃度依賴的ELISAs。從具有IC50為140nM的可溶67B89的固定的67B89分離的1041-D11表明由于固定到用于conc_ELISA設備的疏水表面上，1041-D11的結合不是ED-B結構破壞的人為現象(artefact)。圖8顯示利用Biacore⑩在非標記相互作用技術中修飾的異源二聚體泛素分子1041-D11的分析結果。對于結合包含固定在SA-芯片(Biacore)上的纖連蛋白碎片(涉及67B89)的ED-B，分析(參見圖例0_200nM的1041-D11)不同濃度的異源二聚物泛素變體。分析結合和分離曲線，產生InM的Kd( I X I(T9M)和7. 7 X lO、—1的k0ff速率，這指示10411-D11和ED-B復合體的長的半衰期。圖9顯示濃度依賴ELISA中異源二聚物泛素變體1041-D11對ED-B的結合，同時地分析結合活性的血清穩定性。示出不同的條件，例如在鼠或鼠血清中或在作為對照的PBST中變體在37°C預孵育lh。所有的Kd值都在10和20nM之間。因此，能推論異源二聚物1041-D11對ED-B的結合沒有受到血清的顯著影響。圖10顯示通過SE-HPLC分析異源二聚體泛素變體1041-D11與纖連蛋白碎片的復合體(comp I ex)形成。圖IOA顯示1041-D11與ED-B的復合體形成。三種HPLC類型覆蓋具有21.651min的保留時間的藍色峰來源于純1041-D11 ;具有26. 289min的保留時間的黑色峰代表纖連蛋白碎片67B89 ;在SE-HPLC之后，1041-D11和67B89的混合物產生紅色峰具有27. 407min的保留時間。1041-D11峰到較低保留時間的移動和67B89峰的消失指示1041-D11和可溶解的ED-B的復合體的形成。圖IOB顯示三種SE-HPLC類型的覆蓋圖，1041-D11 (藍色，21. 944min)、沒有ED-B的纖連蛋白碎片6789(黑色，26. 289min)以及1041-D11和6789的混合物(在21. 929min和26. 289min上具有峰的紅線)。觀察到1041-D11峰幾乎沒有移動。這個事實與6789峰沒有消失一起指示不含ED-B的纖連蛋白碎片6789沒有明顯的結合。圖11顯示ED-B結合變體的保守位置(consensus positions)和氨基酸取代。16個代表性的異源二聚體序列示出，已經發現其對ED-B具有意外地強烈的結合親和力。保守氨基酸位置是在第一單體結合決定區域2、4、6、62、63、64、65、66中而保守氨基酸取代是Q2T、F4W、K6H、Q62N、K63F、E64K、S65L、和 T66S。圖12顯示六個基于泛素的異源二聚體MIA2結合蛋白質的序列比對。第二泛素單體以在位置 89 (1111-B4、1111-C9)或位置 80 (1111-E10、1111-F6、1111-H12、1111-H2)的甲硫氨酸開始。
圖13顯示圖12的基于泛素的異源二聚體MIA2結合蛋白質的結合決定區域BDRl和BDR2的比對(排序)和連接子的比對(排序)。也示出泛素序列中另外的氨基酸的交換。圖14顯示與生物素化的MIA-2 (biot. MIA2)結合的圖12的變體1111-E10的濃度依賴的ELISA, Kd = 2. 6microM (封閉的環)；對照組人類血清蛋白(HSA)(空心環)。圖15A.在第一和第二單體泛素單元的一系列分子中的氨基酸殘基中進行修飾，且進行序列排序以便評價最有效的結合位點/位置。部分A顯示第一單體修飾的泛素單元的序列信息和部分B顯示第二單體修飾的泛素單元的序列信息。圖15B.修飾是在第一泛素單體的位置2、4、6、62_66、68中和第二單體中的位置6、8、62-66。兩種泛素單體之間的連接子SGGGGSGGGGIG。圖15C.顯示異源二聚物泛素變體SPWF-15-6-A12與人類腫瘤壞死因子(人類TNFa )的結合的濃度依賴的ELISA。結合蛋白質SPWF_15_6_A12顯示以很高的親和力結合腫瘤壞死因子(Kd= 12nM= 1.2X10_8M)。圖顯示高親和力結合人類腫瘤壞死因子(封閉的環)；對照組BSA (空心環)。圖15D.對于腫瘤壞死因子具有特異性的異源二聚體泛素結合蛋白質SPWF-15_16-D4_Th的序列。修飾是在第一泛素單體的位置2、4、6、62_66和第二單體中的位置6、8、62-66。兩種泛素單體之間的連接子SGGGGSGGGGIG。圖15E.顯示異源二聚體泛素變體SPWF-15_16_D4_Th與人類腫瘤壞死因子的結合的濃度依賴的ELISA。結合蛋白質SPWF-15_16-D4_Th顯示以很高的親和力結合腫瘤壞死因子(Kd = I. 7nM = I. 7X10_9M)。圖顯示對人類腫瘤壞死因子的結合(封閉的環)；對照組牛血清蛋白(BSA)(空心環)。圖16顯示修飾的基于泛素的異源二聚物的NGF結合。圖16A.對NGF具有特異性的異源二聚物泛素結合蛋白SPWF9_lB7_th的序列。修飾是在第一泛素單體的位置2、4、6、62-66和在位置51以及在第二單體的位置6、8、62_66。兩種泛素單體之間的連接子SGGGGSGGGGIG。圖16B.濃度依賴的ELISA確定/決定對NGF的高親和力的結合Kd為0. 9 y MC =9X 10_7M)。圖示出對重組人類NGF的結合(rhNGF ;封閉的環)；對照組BSA (空心環)。 圖16C.對NGF具有特異性的異源二聚體泛素結合蛋白SPWF9_6A2_th的序列。修飾是在第一泛素單體的位置2、4、6、62-66中和在第二單體的位置6、8、62、64_66中。兩種泛素單體之間的連接子SGGGGSGGGGIG。圖16D.濃度依賴的ELISA確定對NGF的高親和力的結合Kd為180nM (=
I.8X 10_7M)。圖示出對重組人類NGF的結合(rhNGF ;封閉的環)；對照組BSA (空心環)。圖17異源二聚體IgG結合蛋白質。圖17A.對IgG具有特異性的異源二聚物泛素結合蛋白SPVF4-16B2_ts的序列。修飾是在第一泛素單體的位置6、62、63、65、66中和在第二單體的位置6、62_66中。兩種泛素單體之間的連接子SGGGGSGGGGIG。圖17B.濃度依賴的ELISA確定對IgG的Kd為3.8 ii M的親和力的結合。圖示出對IgG的結合(封閉的黑色環);對照組為BSA-l、BSA-2和依那西普(Enbrel)(沒有擬合線的紅色、綠色和藍色環)。依那西普(Enbrel)具有人類IgGl的Fe片段。對依那西普(Enbrel) 的微弱的結合指示SPVF4-16B2-ts與IgG的Fab片段的結合。圖17C.對IgG具有特異性的異源二聚物泛素結合蛋白SPVF4-9C6_ts的序列。修飾是在第一泛素單體的位置6、8、62-66中和在第二單體的位置6、8、62-66中。兩種泛素單體之間的連接子SGGGGSGGGGIG。圖17D.濃度依賴的ELISA確定對IgG的Kd為4. I y M的親和力的結合。圖示出對IgG的結合(封閉的黑色環);對照組BSA (空心環)和依那西普(Etanerapt)(商品名為Enbrel)(紅色環,沒有擬合線)。依那西普(Enbrel)具有人類IgGl的Fe片段(moiety)。對依那西普(Enbrel)的微弱的結合指示SPVF4_9C6_ts與IgG的Fab片段的結合。實施例下列實例提供本發明的進一步說明。本發明關于泛素的修飾作為實施例部分地論證。然而，本發明不受實施例限制，且下列實施例僅以上述描述為基礎顯示本發明的實用性。用于本發明全部的公開，參考了在申請中和附件中引證的文獻，其全部內容結合在本申請中以供參考。實施例I.以修飾的泛素蛋白為基礎的異源二聚體ED-B結合蛋白的識別庫的構建和克隆除非有另外的說明，都使用如Sambrook等人描述的已知的重組遺傳方法。通過在總數15個挑選的氨基酸位置的協同的變異發生，制備具有高度復雜性的人類泛素異源二聚物的隨機庫。修飾的氨基酸，其是通過NNK三聯密碼(triplet)被取代的，包括選自第一泛素單體內位置2、4、6、8、62、63、64、65、66、68上的至少3個氨基酸和選自第二泛素單體內的位置2、4、6、8、62、63、64、65、66、68上的至少3個氨基酸。兩個泛素單體都是通過至少具有序列GIG的甘氨酸/絲氨酸連接子或通過至少具有序列為SGGGG的甘氨酸 / 絲氨酸連接子，例如，GIG、SGGGG, SGGGGIG、SGGGGSGGGGIG (SEQ ID NO :32)或SGGGGSGGGG而遺傳上連接的(首到尾)，但是也可能是任何其他連接子。TAT噬菌體展示選擇利用例如作為選擇系統的TAT噬菌體展示，針對靶分子富集異源二聚體泛素庫。能利用本領域已知的其他選擇方法。靶分子能非特異性地固定在蛋白質結合表面，或通過共價地連接到蛋白質上的生物素化殘基。優選的是通過生物素固定到鏈霉親和素磁珠(streptavidin beads)或親和素帶(neutravidin strips)上。在溶液中或在固定的革巴上選擇靶分子結合噬菌體；例如，對生物素化和固定的具有噬菌體的靶進行孵育，接著對結合到基體上的噬菌體洗滌并洗脫基質束縛的噬菌體。在每一個循環中在靶分子孵育之后，從溶液中磁性分離珠子且洗滌幾次。在第一到三個的選擇循環中，洗滌固定在靶分子負載的磁性珠上的三重復合體。第四次的選擇循環中，洗滌實行幾次。第一次的選擇循環中，生物素化的靶分子固定到親和素帶上，然而在第二到四個循環中，在溶液中進行選擇，緊跟其后的是將祀分子卩遼菌體復合體固定到Streptavidin-coated Dynabeads⑩(Invitrogen)上。在洗滌之后，在前兩個選擇循環中，珠子再一次從溶液中磁性分離，且利用酸性溶液通過洗脫釋放靶分子結合的修飾的泛素分子的噬菌體。在第三和第四選擇循環中，利用過量的靶分子通過競爭性洗脫執行噬菌體的洗脫。重新擴增洗脫的噬菌體。為了指導結合體的特異性，在選擇期間，能包括相似于靶分子的蛋白質。對于TAT噬菌體展示選擇的可替換方式核糖體展示選擇利用例如，作為選擇系統的核糖體展示(Zahnd et al. , 2007, Ohashi etal.，2007)針對靶分子富集泛素庫。也能利用其他本領域已知的選擇方法。依照標準的方法生物素化祀分子且固定在Streptavidin-coated Dynabeads(J)(Invitrogen)上。利用 PURExpress在體外蛋白質合成裝置中(NEB)組裝包括核糖體、mRNA和初始形成的泛素多肽的三重復合體。實行兩個初級的選擇循環(rounds)，其中孵育三重復合體，接著的是兩個相似的選擇循環。在每一個循環中在靶分子孵育后，從溶液中磁性分離珠子，并以增加的嚴格性利用核糖體展示緩沖液洗滌。在第一到三個選擇循環中，洗滌固定在靶分子負載的磁性珠上的三重復合體。在第四個選擇循環中，再一次從溶液中磁性地分離珠子，且通過加入50mM的EDTA從核糖體上釋放祀分子結合修飾的泛素分子的mRNA。在第三和四個選擇循環中，利用過量的祀分子通過競爭性洗脫執行mRNA的洗脫(Lipovsek and Pluckthun, 2004)。在每一個循環之后，利用RNeasy MinElute Cleanup Kit (RNA回收和濃縮小體積洗脫試劑盒XQiagen, Germany)、Turbo DNA-free Kit(核酸抽提試劑盒)(Applied Biosystems, USA)和 Transcriptor Reverse Transcriptase (反轉錄 cDNA 合成試劑盒)(Roche, Germany)實行RNA純化和cDNA合成。富集庫的克隆在第四個選擇循環之后，依照本領域中已知的方法，通過PCR擴增合成的cDNA，使用適當的限制性核酸酶切割且通過兼容的粘性末端連接到表達載體pET-20b (+)上(Merck, Germany)。單克隆Hit分析在轉入NovaBlue (DE3)細胞(Merck, Germany)之后,青霉素抗性的單克隆生長,通過在96孔深孔板中(Genetix，UK)利用自誘導培養基(Studier，2005)培養獲得靶分子結合修飾的泛素的表達。收集細胞并隨后裂解細胞。在離心之后，通過涂上靶分子的ELISA篩選合成的上清液，且泛素特異性的Fab片段結合到辣根過氧化物酶上(P0D)。因為使用檢測試劑 TMB_Plus(Biotrend，Germany),利用 0. 2MH2S04 溶液顯不黃色，且在 450nm 與 620nm 的下檢測板中的讀數。執行對靶分子的幾個選擇展示循環。最后兩個選擇的循環中，使用過量的自由靶分子洗脫結合分子。例如，識別對靶ED-B的異源二聚體修飾的泛素結合蛋白，例如46H9 (SEQID N0:6)，9E12(SEQ ID NO:7)，22D1(SEQ ID N0:8), 1041-Dll 圖 5(SEQ ID NO:33),1045-D10(SEQ ID NO:34)。例如，識別對其他靶的異源二聚體修飾的泛素結合蛋白，例如圖12的對靶MIA-2的結合蛋白Illl-ElO (SEQ ID NO: 53)，圖15B的對靶TNF a的結合蛋白SPWF-156-A12 (SEQ ID NO:57)和圖 15D 的 SPWF-1516-D4 (SEQ ID N0:90)，圖 16A 的對靶NGF 的結合蛋白 SPWF9-lB7-th (SEQ ID NO:91)和圖 16C 的 SPWF9_6A2_th (SEQ ID NO:92)和圖 17A 的對靶 IgG 的結合蛋白 SPVF4-16B2-ts(SEQ ID NO:93)和圖 17C 的 SPVF4_9C6_ts(SEQ ID N0:94)。圖5中示出野生型泛素單體(Ubi單體wt)，與野生型泛素二聚體(ubi 二聚體wt)和具有修飾的泛素異源二聚體變種1041-D11的野生型泛素蛋白(圖5中的Ub2-TsX9，每一個單體的位置45中具有交換和在C-末端上具有兩處取代)。Ub2-TsX中在單體的C-末端(GG到AA)上的取代增加血清的穩定性，因為去泛素化酶(deubiquitinases)分解是在泛素的GG之后，而不是在AA之后。野生型泛素的二級結構與在C-末端具有的這些取代的泛素相比，幾乎是相同的。通過與野生型相比的下列氨基酸置換來識別具有較高的ED-B結合活性的修 飾的泛素被稱作1041-D11 (圖X中顯示；SEQ ID N0:36)或1045-D10 :第一模塊中K6W, L8W, K63R, E64K, S65F, T66P ;第二模塊中K6T, L8Q, Q62W, K63S, E64N, S65W, T66E ；可選地Q2R (變體1041-D11中，但不在變體1045-D10中)。融合蛋白適當優選的連接子是具有至少序列為GIG或具有至少序列為SGGGG的連接子，或任何其他連接子，例如GIG, SGGGG, SGGGGIG, SGGGGSGGGGIG或SGGGGSGGGG。然而，有很多能用于代替的可能的連接子。圖11中顯示在第一單體結合決定區域中另外的具有他們的保守序列的EDB結合體。圖12-14示出具有較高的MIA-2結合活性的修飾的泛素。圖16示出具有較高的NGF結合活性的修飾的泛。圖15示出具有較高的TNF-a結合活性的修飾的泛素。在圖17示出具有較高的IgG結合活性的修飾的泛素。實施例2 :將變體結合到人類靶分子上的基于修飾的泛素的ED-B的結合分析實施例2A.通過濃度依賴的ELISA方法進行基于修飾的泛素的結合變體的結合分析通過濃度依賴的ELISA檢驗以泛素為基礎的變體和人類靶分子的結合。如果ED-B被用作靶分子，則漸增數量的純化蛋白適用于涂上人類靶分子，BSA或HAS和可能的進一步的對照，例如細胞纖連蛋白(cFN)(如果ED-B用作靶分子)的腔室玻片板(NUNC-medisorpplate)。每孔抗原涂上50iil蛋白質溶液(lOii g/ml)，4°C過夜。在用PBS，0. 1%吐溫20pH7. 4 (PBST)洗滌板之后，孔利用封閉液(PBS pH7. 4 ；3% BSA ;0. 5%吐溫20)在室溫RT下封閉2h。孔再次用PBST洗滌三次，然后用PBS洗滌三次。用不用濃度的靶結合蛋白在RT下孵育涂覆的孔lh。在PBST洗滌孔之后，將anti-Ubi fab片段(AbyD) POD的結合物加到PBST的適當的稀釋液中。板用PBST洗滌三次。每一個孔中加入50U1TMB基礎溶液(KEM-EN-Tec)且孵育15min。通過加入0. 2M H2SO4終止反應。利用TECAN SunriseELISA-Reader讀出ELISA板。在450nm下利用620nm作為參考波長完成吸光度測量。圖6顯示變體1041-D11與ED-B的結合的很高的親和力(Kd = 6. 9nM)。關于其他靶分子MIA-2、TNFa、NGF和IgG，分別由圖14、15、16和17中描述的結果證實(高的親和力)。因此，泛素野生型中只有很少的修飾(每一個單體中高達8個取代)，結果對特定的靶分子的親和力在很低的微摩爾范圍。實施例2B.通過競爭性的濃度依賴的ELISA方法進行基于修飾的泛素的結合變體的結合分析這里描述的是對于靶分子ED-B的結合分析，但是沒有進一步的實驗，它能用于任何其他的靶分子。在有增加數量的自由靶分子的情況下，利用競爭性濃度依賴的ELISAs分析泛素變體1041-D11與包含纖連蛋白片段(67B89 )的固定的ED-B的結合。ELISA的條件如實施例2A中描述的，除了 1041-D11蛋白質是與ED-B (67B89) (0 y M_10 y M)或者也與陰性對照6789 (Ou M-IO u M)預孵育lh，且隨后混合物提供給放置在酶標板上的靶分子67B89 ；之后，通過相應的抗體(anti-Ubiquitin-Fab-POD ；1 6500稀釋)檢測變體。圖7顯示變體1041-D11具有很高的親和力結合ED_B (IC50=140nM)。證實了圖6中顯示的結果；泛素野生型中只有少數的修飾(每一個單體中高達8個取代)，產生更高親和力結合ED-B。 實施例2C.通過濃度依賴ELISA方法進行基于修飾的泛素的ED-B結合變體的結合分析，同時分析結合活性的血清穩定性。利用本領域已知的且如上述描述的程序實行ELISA (實施例2A和2B)。將ED-B(這里被稱作67B89)涂在微量滴定板上，變體結合到ED-B上且通過特定的泛素抗體檢測(Anti-Ubi-Fab-POD)。這種實驗中以不同的方式處理變體；變體在鼠血清中在37°C孵育Ih(察看圖9，藍色環)；變體在褐家鼠血清中在37°C孵育Ih (察看圖13X，紅色環)；或者變體在PBS中在37°C孵育Ih (察看圖9、10，黑色環)。圖13顯示所有變體1041-D11的Kd在10. 3uM (PBS中)到20. 74 ii M (鼠血清中)之間。實施例2D.通過Biacore實驗進行基于修飾的泛素的ED-B結合變體的結合分析利用本領域的那些技術人員已知的方法，分析變體的不同濃度(例如，0-20 ii M的變體，優選地1041-D11)對結合ED-B的影響，ED-B包含固定在CM5-芯片(Biacore)上的纖連蛋白片段(被稱作67B89)。通過模型分析軟件(BIA evaluation software)和I :I-Langmuir-裝置處理獲得的數據。如圖8中示出的，變體1041-D11的Kd是I. 0 y M。動力學結合常數是 km=7. 6 X IO5M-1S-1 ^ff=TJXlO-4S' 融合蛋白 1041-D11-TNF a 的 Kd 是I. 13 u M0 動力學結合常數 kon=4. 5 X IO5M-1S-1 ;kQff=5. OX KT4S'實施例2E.通過SE-HPLC進行基于修飾的泛素的ED-B結合變體的復合體形成的分析對于復合體形成的分析，利用Tricorn Superdex 755/150GL 柱(GE-Healthcare)(V=3ml)且應用50iU量的蛋白質。進一步的條件緩沖液1XPBS，pH7.3，流量0.3ml/min,運行45min(樣品的加入15min 之后)。條件0. 72nmol 1041-D11 蛋白質 + 0. 72nmolED-B (這里涉及67B89)或者作為陰性對照的纖連蛋白(此處被稱為6789)在RT下孵育Ih ；然后應用于柱用于復合體形成的分析。圖14中，只有變體用黑色示出，只有靶分子ED-B用藍色示出，用粉紅示出變體與ED-B結合組成的復合體。圖IOA示出包含ED-B的纖連蛋白(67B89)與變體；圖IOB是不具有ED-B的纖連蛋白的變體(6789)。圖顯示變體1041-D11與ED-B (67B89) 一起組成復合體，但是與纖連蛋白(6789)沒有組成復合體，這證實了它的特異性。
實施例3 :對TNF-a具有改善的結合的基于泛素的異源二聚體的結合蛋白依照本發明的方法，選出對TNF-a特異性的基于泛素的異源二聚體的結合蛋白，即建立噬菌體庫，其包括修飾的異源二聚體的泛素的結合蛋白的群，在它們與TNF-a潛在的結合蛋白上篩選群。實行下列的修飾第一單體中在位置2、4、6、62_66上的一個或更多的氨基酸中，可選地另外在位置68、70、72-74的一個或更多的位置上，可選地另外的位置上。第二單體中位置6、8、62_66上的一個或更多的氨基酸的修飾。作為連接子，除了對于1144-Dll (SEQ ID NO:79))和 1144-E9 (SEQ ID N0:80)之外，SGGGGSGGGGIG用于大多數情形中。在第一和第二泛素單體之間1144-D11和1144-E9沒有利用連接子。位置75和76是AA或GG。圖15的A部分中示出連接子。圖15B-E中示出結合親和力。
實施例4 :具有改善的結合MIA-2的基于泛素的異源二聚體的結合蛋白的產生MIA-2是在例如肝的硬化、纖維化和癌變的情形中診斷和治療的標記。能在US2004076965中發現這種標記的詳細信息。本發明的修飾的泛素的結合蛋白質的靶蛋白是MIA-2的穩定的101個氨基酸核心區域，此處被稱作SPR30-3。SPR30-3是MIA-2的結構部分。除了信號肽之外，它類似于MIA(CD-RAP)，0T0R、TANGO0 它的分子量是 11569，198Da。MIA-2的氨基酸的核心區域如下(SEQ ID N0:95)MLESTKLLADLKKC⑶LECEALINRVSAMRDYRGPDCRYLNFTKGEEISVYVKLAGEREDLWAGSKGKEFGYFPRDAVQIEEVFISEEIQMSTKESDFLCL依照本發明的方法，選出對于MIA-2特異性的基于泛素的異源二聚體的結合蛋白，即建立噬菌體庫，其包括修飾的異源二聚體泛素的結合蛋白質的群，在它們與MIA-2潛在的結合上篩選群。結果如下圖13顯示基于泛素的異源二聚體的MIA-2結合蛋白質的比對變體1111-E10顯示對生物素化的靶分子的在微摩爾范圍中的親和力和在尺寸篩析色譜法中顯示復合體的形成。最有效(potent)的結合體指定是在第一單體泛素單元(BDRl)中位置6、8、62、63、64、65、66處具有氨基酸取代的1111-E10和在第二單體泛素單元(BDR2)的位置6、8、62、63、64、65、66處的不同的取代。第一單體泛素單元(BDRl)顯示與1111-H2和1111-H12相同的取代。因此，變體1111-H2和1111-H12能被看作BDRl和BDR2的結合，只通過一個取代的氨基酸區別BDRl和BDR2。已經評價下列進一步有效的結合分子1111-C9，1111-B4和1111-F6。在ELISA中和SEC上，這些結合體是不可溶解的或對MIA-2的SPR30-3不顯示任何結合。分別地富集變體1111-E10和1111-C9和1111-B4 (1111-B4中出現幾次額外的取代T9A)。1111-F6沒有富集，但是由于在Hit-ELISA中它的高信號，它似乎是令人感興趣的候選物；然而，這個結合體好像是不可溶解的。圖14顯示結合生物素化的MIA-2 (biot. MIA2)的變體1111-E10的濃度依賴的ELISA，Kd = 2. 6微摩爾(封閉的環)；對照組HAS (空心環)。已經證明這些變體111 1-E10作為 MIA2 最好的結合分子。序列如下MQIFVETFTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIGWHPELHLVLRLRGGGIGMQIFVRTETGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIffAGKQLEDGRTLSDYNILMGYVLHLVLRLRAA(SEQ ID NO:53)附在所附的序列表中的使用的連接子如下1111_B4_21231 sggggsggggig SEQ ID NO:961111_C9_21265 sggggsggggig SEQ ID NO:961111-E10_21315 gig1111-F6_21331 gig1111-H12_21391 eig 1111_H2_21371 gig出版物I. Birchler, M.，F. Vitij L. Zardi, B. Spiess，and D. Neri. 1999. Selectivetargeting and photocoagulation of ocular angiogenesis mediated by aphage-derived human antibody fragment. Nat Biotechnol 17:984-8.2. Brenmoehl，J.，M. Lang, M. Hausmann，S. N. Leebj W. Falk, J. Scholmerich，M.Gokej and G. Rogler. 2007. Evidence for a differential expression of fibronectinsplice forms ED-A and ED-Bin Crohn f s disease(CD)mucosa. Int J ColorectalDis22:611-23.3. Dubin，D.，J. H. Peters, L. F. Brown, B. Logan, K. C. Kent, B. Berse, S. Berven, B.Cercek，B. G. Sharifi, R. E. Pratt, and et al. 1995. Balloon catheterization inducedarterial expression of embryonic fibronectins. Arterioscler Thromb VaseBioll515:1958-67.4.Goodsell, D. S. 2001. FUNDAMENTALS OF CANCER MEDICINE:The MolecularPerspective:Antibodies. The Oncologist 6:547-548.5. Kaczmarek, J.，P. Castel Iani, G. Nicolo，B. Spina, G. Al lemanni, andL. Zardi. 1994. Distribution of oncofetal f ibronect in isoforms innormal, hyperplastic andneoplastic human breast tissues.Int J Cancer 59:11-6.6. Menrad，A.，and H. D. Menssen. 2005. ED-B f ibronectin as a target forantibody-based cancer treatments. Expert Opin Ther Targets 9:491-500.7. Pujuguet, P.，A. Hammann, M. Moutet, J. L. Samuel，F. Martin，andM.Martin. 1996. Expression of fibronectin ED—A+and ED—B+isoforms by humanand experimental colorectal cancer. Contribution of cancer cells andtumor-associated myofibroblasts. Am J Pathol 148:579-92.8. Trachsel, E.，M. Kaspar, F. Bootz, M. Detmar, and D. Neri. 2007. A human mAbspecific to oncofetal fibronectin selectively targets chronic skin inflammationin vivo. J Invest Dermatoll27:881-6.9. Van Vliet, A.，H. J. Baelde，L. J. Vleming, E. de Heerj and J. A. Brui jn. 2001.Distribution of bronectin isoforms in human renal disease. J Pathol 193:256-62.10. Lipovsek，D.，and PluckthunjA. (2004). In-vitro protein evolution byribosome display and mRNA display. J. Immunol. Methods 290，51—67.
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權利要求
1.一種用于識別具有結合配體能力的異源多聚體修飾的泛素的方法，包括下列步驟 a)提供來源于單體修飾的泛素蛋白質的異源多聚體修飾的泛素的群，所述群包括異源多聚體蛋白質，所述異源多聚體蛋白質包括兩個或更多以首尾排列的方式連接在一起的泛素單體，其中所述異源多聚體蛋白質的至少一個所述單體是至少通過定位在SEQ ID NO: I的位置2、4、6、8、62、63、64、65、66和68處的至少三個氨基酸中的表面暴露的氨基酸的取代而不同地修飾的，所述修飾的單體蛋白質與未修飾的泛素蛋白質具有至少80%或至少90%或至少95%的氨基酸序列同一性； b)為所述不同地修飾的泛素蛋白質的群提供潛在的配體； c)使所述不同地修飾的蛋白質的群與所述配體接觸； d)通過篩選方法識別異源多聚體修飾的蛋白質，其中所述修飾的異源多聚體蛋白質以Kd范圍是10_7-10_12M的特定的結合親和力結合于所述配體并且對于所述配體表現單價的結合活性；和可選地 e)利用所述結合親和力分離所述異源多聚體修飾的泛素。
2.根據權利要求I所述的方法，其中所述異源多聚體蛋白質是異源二聚體或異源三聚體蛋白質。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其中所述修飾的單體蛋白質包括總共I至10個氨基酸中一個或更多的插入和/或總共I至7個氨基酸中一個或更多的缺失，進一步可選地其中所述修飾的單體泛素蛋白包括至少6個和最多14個氨基酸的取代，并且其中所述修飾的異源二聚體的泛素蛋白包括總共至少12個和最多28個取代，和/或包括總共至少I個和最多20個插入和/或至少I個和最多14個缺失。
4.根據前述權利要求中的任一項所述的方法，其中所述修飾的單體泛素蛋白是通過編碼泛素的DNA的遺傳工程，并且在原核或真核生物體內或體外表達所述蛋白而獲得的。
5.根據前述權利要求中的任一項所述的方法，其中通過體外選擇方法提供所述多聚體蛋白質，所述體外選擇方法優選地是展示方法，可選地為噬菌體展示、核糖體展示、TAT噬菌體展示、酵母菌展示、細菌展示、細胞表面展示或mRNA展示方法。
6.根據前述權利要求中的任一項所述的方法，其中所述配體是抗原或半抗原。
7.根據前述權利要求中的任一項所述的方法，其中進一步地在至少一個所述單體泛素蛋白中的I至7個另外的氨基酸被取代，其可選地選自在位置36、44、70、71的一個或更多的氨基酸，和可選地附加地SEQ ID NO: I的位置62、63和64或72和73或8的氨基酸。
8.根據前述權利要求中的任一項所述的方法，其中所述泛素的異源多聚體融合蛋白的群通過以下方式提供遺傳上融合兩個DNA庫，所述DNA庫每一個編碼不同地修飾的單體蛋白質，將所述DNA翻譯成異源多聚體融合蛋白質，展示所述蛋白質并在修飾的異源多聚體泛素蛋白存在下篩選展示的蛋白質，所述修飾的異源多聚體泛素蛋白包括以首尾排列連接在一起的單體泛素蛋白，其中所述修飾的異源多聚體泛素蛋白以Kd范圍是KT7-IO-12M的特定的結合親和力結合所述配體并且對于所述配體表現出單價的結合活性，或者其中通過蛋白質的化學合成提供所述泛素的異源多聚體的融合蛋白質的群。
9.一種DNA庫，包含編碼來源于單體泛素的異源多聚體泛素融合蛋白的群的DNA，每一個多聚體蛋白質包括兩個或更多以首尾排列的方式連接在一起的修飾的泛素單體，其中每個所述多聚體蛋白質的所述單體的至少兩個被不同地修飾，這種修飾至少通過在位于SEQID勵:1的位置2、4、、6、8、62、63、64、65、66和68處的至少三個氨基酸中的表面暴露的氨基酸的取代而實現，所述修飾的單體蛋白質與未修飾的蛋白質具有的氨基酸序列同一性為至少80 %或至少90 %或至少95 %。
10.一種通過權利要求9所述的DNA庫的表達獲得的蛋白質庫。
11.一種包含根據權利要求9或10所述的DNA或蛋白質庫的原核的或真核的細胞或噬菌體的群。
12.—種多聚核苷酸，編碼權利要求10所述的蛋白質庫的融合蛋白質。
13.—種載體,包括根據權利要求12的多聚核苷酸。
全文摘要
本發明涉及用于識別具有結合配體能力的異源多聚體泛素的方法。此外，本發明提供編碼所述異源多聚體泛素群的DNA庫和由所述DNA庫的表達獲得的蛋白質庫、包含所述DNA或蛋白質的細胞和噬菌體、編碼所述融合蛋白(fusion proteins)的多聚核苷酸和包括所述多聚核苷酸的載體。進一步提供能夠以高親和力特異性地結合到所選擇的配體上的基于異源多聚體泛素的新的結合蛋白質。
文檔編號C07K14/00GK102753568SQ201080056911
公開日2012年10月24日 申請日期2010年12月14日 優先權日2009年12月14日
發明者埃里克·菲德萊爾, 安雅·庫納特, 托馬斯·戈特勒, 約爾格·納坎普, 阿諾德·施托伊爾納格爾, 馬庫斯·菲德萊爾 申請人:塞爾蛋白質股份有限公司