專利名稱：新型熒光性人工堿基的制作方法
技術領域：
本發明涉及新型熒光性核酸人工堿基，該人工堿基在嘌呤堿基、I-脫氮嘌呤堿基、1，7-脫氮嘌呤堿基的6位(嘌呤環的6位)具有由2個以上雜環分子縮聚而成的官能團。本發明還涉及包含該人工堿基的化合物及其衍生物、以及組入有包含該人工堿基的核苷酸的核酸。本發明還涉及制備該核酸的方法。
背景技術：
熒光性核酸堿基類似物，能夠廣泛地用于核酸的熒光標識法。進行核酸的熒光標識時，通常來說采取使熒光色素與天然堿基中的某一個結合，通過化學合成或酶反應(復制或轉錄)將該修飾堿基導入到DNA或RNA中的方法。但是,就該方法而言,熒光色素部分 從核酸結構中明顯突出，以及該熒光色素部分與核酸中的某處的堿基重疊，由此可能會導致該核酸的功能失活。此外，由于熒光色素與天然堿基結合，因此通過復制或轉錄，無法將這些堿基導入到核酸中的特定位置。相比之下，熒光性核酸堿基類似物，在保持核酸的結構和功能的條件下可以進行熒光標識，并作為人工堿基對進行復制和轉錄，可以導入到DNA或RNA中的特定位置。作為以往使用的熒光性核酸堿基類似物，有2-氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤等(專利文獻I、非專利文獻1-4)。但是，這些熒光性核酸堿基類似物的熒光強度不是很強，如果向核酸中導入這樣的堿基類似物，則由于與附近的堿基重疊會導致消光。此外，這些堿基類似物為A(腺嘌呤)的類似堿基，作為T(胸腺嘧啶)的互補堿基，可以利用復制或轉錄導入到DNA或RNA中。但該導入的效率低，并且在復制或轉錄時，由于會導入到核酸中相當于A的位置，因此無法導入到特定位置。即，如果核酸中只有一個A，則可以導入到該部位代替A，但這樣的核酸序列是非常特殊的，不具有通用性。此外，這些堿基類似物，由于如上所述可以作為A的類似物使用，可以用這些堿基類似物取代DNA或RNA中的A的部位，但與其它堿基(G、C、T等)進行取代時可能會降低這些核酸的功能。本發明人等，為了擴張DNA的遺傳信息而開發了第三堿基對(人工堿基對)。到目前為止，已經成功開發了 s-y堿基對(s :2_氨基-6-噻吩基嘌呤、y :卩比唳~2~酮)、ν-y堿基對(V :2_氨基-6-噻唑基嘌呤)、S-Pa堿基對(Pa :吡咯_2_甲醛)、Ds-Pa堿基對(Ds 7-(2-噻吩基)_咪唑并[4，5-b]吡啶)、Ds-Pn堿基對(Pn :2_硝基吡咯)等具有復制或轉錄功能的數種人工堿基對(非專利文獻5-10)。另外，人工堿基s、v具有熒光，報道了使用這樣的人工堿基對核酸的局部結構進行解析的方法等。但是，s的熒光強度不是很強，或由于最大激發波長為348nm、熒光波長為435nm，希望上述波長進一步向長波長側移動的核酸堿基類似物。V的熒光強度比s強，但作為化合物的穩定性低，在堿性條件下容易分解導致其利用受到限制。就Ds-Pa堿基對或Ds-Pn堿基對而言，利用PCR可以擴增導入了這些人工堿基對的DNA，是非常有用的，但在350nm以上的激發波長下，Ds的熒光基本無法通過肉眼觀測。因此，如果開發出能夠利用復制或轉錄導入到DNA或RNA的特定部位的熒光性人工堿基，則可以確立核酸的新熒光標識化法。此外，將與任何天然堿基均以同樣程度的穩定性形成堿基對的堿基類似物稱為通用堿基(universal base),已知有卩比咯_3_甲酰胺、3_硝基卩比咯、5-硝基Π引哚等(專利文獻2-4 ;非專利文獻11-17)。但是，在本技術領域中，在利用人工堿基對功能性核酸進行標識時，需要具有更高熱穩定性的作為通用堿基的人工堿基。現有技術文獻專利文獻專利文獻I :美國專利第6，451，530號專利文獻2 :美國專利第5，438，131號
專利文獻3 :美國專利第5，681，947號專利文獻4 :美國專利第5，780，233號非專利文獻非專利文獻I :J. M. Jean and K. B. Hall, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 98，37-41(2001)非專利文獻2 D. C. Ward, et al. , J. Biol. Chem.，244，1228-1237 (1969)非專利文獻3 N. Patel, et al.，Eur. J. Biochem.，203，361-366 (1992)非專利文獻4 :Ε· L. Rachofsky, et al. , Biochemistry, 40, 946-956 (2001)非專利文獻5 T. Mitsui, et al.，Tetrahedron, 63，3528-3537 (2007)非專利文獻6 M. Kimoto, et al.，Nucleic Acids Res.，35，5360-5369 (2007)非專利文獻7 I. Hirao, et al.，Nature Methods, 3，729-735 (2006)非專利文獻 8 T. Mitsui, et al. , J. Am. Chem. Soc.，127，8652-8658 (2005)非專利文獻9 I. Hirao, et al.，J. Am. Chem. Soc.，126，13298-13305 (2004)非專利文獻10 :1. Hirao, et al. , Nature Biotechnology, 20，177-182 (2002)非專利文獻11 P. Zhang, et al. , Nucleic Acids Res.，26，2208-2215(1998)非專利文獻12 D. Loakes, et al.，Nucleic Acids Res.，23，2361-2366 (1995)非專利文獻13 D. Loakes, Nucleic Acids Res.，29，2437-2447 (2001)非專利文獻14 :Ν· Ε. Watkins and J. SantaLucia, Nucleic AcidsRes.，33, 6258-6267(2005)非專利文獻15 :D. Loakes and D. M. Brown, Nucleic AcidsRes.，22，4039-4043(1994)非專利文獻16 R. Nicols, et al.，Nature, 369，492-493 (1994)非專利文獻17 :Z. Guo, et al. , Nature Biotechnology, 15，331-335 (1997)
發明內容
發明要解決的問題本發明的目的在于提供新型的熒光性人工堿基。本發明的目的尤其在于提供顯示出下述各性質中的至少一種的新型熒光性人工
喊基I)產生強的突光；
2)通過與互補人工堿基形成堿基對，從而能夠利用復制、轉錄導入到DNA或RNA中的特定位置；3)顯示出作為通用堿基的性質。解決問題的方法本發明人等為了解決上述問題，進行了深入研究，結果發現在嘌呤堿基、I-脫氮嘌呤、1，7-脫氮嘌呤的6位(嘌呤環的6位)上具有由2個以上雜環分子縮聚得到的取代基的人工堿基具有優異的熒光特性，從而完成了本發明。到目前為止，發明人等以擴張DNA的遺傳信息為目的開發了具有復制或轉錄功能的第三堿基對(人工堿基對)。由此，這次開發了通過復制或轉錄能夠位置特異地導入到DNA或RNA中的熒光性人工堿基(ss :2_氨基-6-(2，2’-聯噻吩-5-基)嘌呤-9-基；Dss 7-(2, 2’ -聯噻吩-5-基)咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基等)。人工堿基ss或Dss的轉錄用底物(ssTP、DssTP)與模板DNA中的人工堿基Pa (吡咯-2-甲醛)互補，可以通過轉錄導入到RNA中。此外，Dss作為與Pa、Pn (2-硝基吡咯)的人工堿基對具有復制功能(例如，組入了 Dss-Pa或Dss-Pn堿基對的DNA能夠利用PCR擴增)。另外，發現這些熒光性人工堿基Dss或ss可以與任何天然堿基在雙鏈DNA中形成穩定的堿基對，也顯示出作為通用堿基的性質。結果完成了本發明。以上，為了理解本發明對想到本發明的過程進行了說明，但本發明的范圍不限定于上述說明,應根據權利要求所述的內容來確定。本發明提供以下的方式1-16。方式I :包含下式I表示的人工堿基或其衍生物的化合物
權利要求
1.一種包含式I表示的人工堿基或其衍生物的化合物
2.根據權利要求I所述的化合物，其由式II表示，
3.根據權利要求I或2所述的化合物，其包括選自下述的基團 (i)7-(2,2’ -聯噻吩-5-基)咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Dss)； (ii)7-(2，2，，5’，2”-三聯噻吩-5-基)咪唑并[4，5-b]吡啶_3_ 基(Dsss) (iii)2-氨基-6-(2，2’ -聯噻吩-5-基)嘌呤-9-基(ss)； (iv)2-氨基-6-(2，2’，5’，2”-三聯噻吩-5-基)嘌呤 _9_ 基(sss)； (V) 4-(2，2，-聯噻吩-5-基)-吡咯并[2，3-b]吡啶-I-基(Dsas)； (vi)4-[2-(2-噻唑基)噻吩-5-基]吡咯并[2，3-b]吡啶-I-基(Dsav);及 (vii)4-[5_(2-噻吩基)噻唑-2-基]吡咯并[2，3-b]吡啶-I-基(Dvas)。
4.一種具有式I表不的人工堿基的核苷、核苷酸或它們的衍生物，
5.根據權利要求4所述的核苷、核苷酸或它們的衍生物,其中，式I表不的人工堿基選自以下基團 (i)7-(2，2’-聯噻吩-5-基)咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基(Dss)； (ii)7-{2，2，，5’，2”-三聯噻吩-5-基}咪唑并[4，5-b]吡啶_3_ 基(Dsss)； (iii)2-氨基-6-(2，2’ -聯噻吩-5-基)嘌呤-9-基(ss)； (iv)2-氨基-6-{2，2’，5’，2”-三聯噻吩-5-基}嘌呤 _9_ 基(sss)； (V) 4-(2，2，-聯噻吩-5-基)-吡咯并[2，3-b]吡啶-I-基(Dsas)； (vi)4-[2-(2-噻唑基)噻吩-5-基]吡咯并[2，3-b]吡啶-I-基(Dsav);及 (vii)4-[5_(2-噻吩基)噻唑-2-基]吡咯并[2，3-b]吡啶-I-基(Dvas)。
6.根據權利要求4或5所述的核苷、核苷酸或它們的衍生物,其中，核苷或核苷酸包括β -D-呋喃核糖基或2-脫氧-β -D-呋喃核糖基作為糖部分。
7.根據權利要求4 6中任一項所述的核苷、核苷酸或它們的衍生物,其中，核苷酸為脫氧核糖核苷5’ -三磷酸或核糖核苷5’ -三磷酸。
8.根據權利要求4飛中任一項所述的核苷、核苷酸或它們的衍生物，其為亞磷酰胺衍生物。
9.根據權利要求4 6中任一項所述的核苷、核苷酸或它們的衍生物,其在200nm以上的激發波長下產生熒光。
10.根據權利要求4飛中任一項所述的核苷、核苷酸或它們的衍生物，其作為通用堿基使用。
11.一種核酸，其組入有權利要求4飛中任一項所述的核苷酸。
12.根據權利要求11所述的核酸，其在200nm以上的激發波長下產生熒光。
13.根據權利要求11或12所述的核酸，該核酸是選自反義DNA、反義RNA、核酶、脫氧核酶、siRNA或shRNA等RNA干擾誘導性核酸、微小RNA、抗微小RNA核酸分子、誘殺核酸、DNA適體、及RNA適體的功能性核酸。
14.根據權利要求11或12所述的核酸，該核酸是用于核酸擴增法的擴增反應用引物，所述核酸擴增法選自LAMP法、SDA法、SMAP法、NASBA法、ICAN法、UCAN法、TMA法、PadlockProbe 法、RCA 法、bDNA 法、PALSAR 法、Invader 法、TRC 法、CPT 法、及 Plexor 法。
15.根據權利要求11或12所述的核酸，該核酸是選自分子信標、Taqman探針、基于Scorpion的探針、及Riboswitch的祀標核酸檢測用探針。
16.一種核酸模擬物，其堿基部分具有下述式I表示的人工堿基或其衍生物
17.—種通過核酸的復制反應，向DNA或RNA中導入下述式I所示人工堿基或其衍生物的方法，
18.一種通過化學合成，向DNA或RNA中導入下述式I表示的人工堿基或其衍生物的方法，
全文摘要
本發明涉及一種新型熒光性核酸人工堿基，該人工堿基在嘌呤堿基、2-脫氮嘌呤堿基或2,7-脫氮嘌呤堿基的6位(嘌呤環的6位)上具有由2個以上雜環分子縮聚而成的官能團。本發明還涉及包含該人工堿基的化合物及其衍生物，以及導入了含該人工堿基的核苷酸的核酸。本發明進一步涉及制備該核酸的方法。本發明的人工堿基具有優異的熒光特性，此外還具有作為通用堿基的優異性質。
文檔編號C07H21/00GK102884071SQ201080055369
公開日2013年1月16日 申請日期2010年10月6日 優先權日2009年10月6日
發明者平尾一郎, 平尾路子, 橫山茂之, 三井雅雄 申請人:塔古西庫斯生物株式會社