專利名稱：人類人工染色體載體的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種人類人工染色體載體，其包含人類抗體重鏈基因、人類抗體輕鏈基因和非人類動物來源的IgM重鏈恒定區基因，還涉及具有所述人類人工染色體載體的動物以及生產人類抗體的方法。
背景技術：
通過將包含人類染色體片段的微核與具有 多能分化性的細胞進行融合以獲得雜交細胞來產生嵌合動物的技術開發，允許制備保持了有待生產的大外源基因的非人類動物(非專利文獻I和專利文獻I)。隨后，提出了構建所需人類人工染色體(在后文中縮寫為HAC)載體以生產非人類動物的方法，通過該方法已建立了包含廣泛的各種人類抗體基因座的HAC。首先，作為對將要引入到非人類動物中的染色體片段進行修飾的方法，已經開發了通過基因打靶將端粒序列插入到保持在雞DT40細胞中的人類染色體上的目標序列中，以有效制備缺失染色體的技術(專利文獻2)。此外，在保持了人類染色體的小鼠細胞的維持過程中，已發現可以獲得包含來源于人類14號染色體的抗體重鏈基因座的片段SC20，并且所述片段穩定地保持在胚胎干(ES)細胞和小鼠個體中，并具有向后代傳遞的效率高(專利文獻2)。因此，使用例如SC20作為載體的基本骨架，通過Cre/loxP位點特異性重組系統對包含人類22號染色體上的抗體λ型輕鏈基因座的片段進行易位，構建了包含人類抗體重鏈和人類抗體λ鏈的XHAC (非專利文獻2和專利文獻3)。λ HAC具有與SC20幾乎等同的穩定性和向后代傳遞的效率，并且通過將該λ HAC導入小鼠ES細胞產生了穩定保持AHAC的嵌合小鼠(非專利文獻2和專利文獻3)。通過這種方法，現在能夠構建包含具有特定的兆堿基(Mb)尺寸的人類染色體區的HAC載體。此外，出于移除對染色體導入動物的產生具有不利影響的染色體區的目的，根據人類22號染色體的結構信息(非專利文獻3)制備了具有優化尺寸并包含抗體λ型輕鏈(入鏈)基因區的染色體片段AHAC和Λ AHAC (專利文獻4)。已證實，AHAC和Δ AHAC分別包括具有2. 5Mb和I. 5Mb大小的區域，這些區域比AHAC上抗體λ型輕鏈基因區周邊IOMb短，提供了比λ HAC更高的后代傳遞效率(專利文獻4)。同時，從獲自多個人類供體的血清合并物制備了目前用于治療和預防各種疾病的人類多克隆抗體。因此，人類多克隆抗體的性能很大程度上取決于作為供應源的人類供體血清，因此在制備中需要選擇具有所需抗原反應性或滴度的供體的過程。此外，由于多克隆抗體制備中的多種因素例如抗原種類、暴露于免疫原的次數以及可以收集的供體血清的量，其應用的發展受到限制。因此，已制備了具有人類抗體基因座的轉基因動物作為用于生產人類多克隆抗體的工具。由于體型，有蹄類動物可用作大量人類多克隆抗體的供應源。到目前為止，為了生產人類多克隆抗體，其中導入了上述HAC、特別是AHAC和Λ ΛHAC以生產人類多克隆抗體的牛，是已知的(非專利文獻4和專利文獻5)。在導入了這些HAC的牛的新生仔血清中，產生了 13至258ng/mL的人類免疫球蛋白(Ig) G (非專利文獻4)。隨后，為了消除在牛活體中產生的牛抗體，在編碼牛內源抗體重鏈基因中的功能性IgM基因的IGHM和IGHMLl上執行了基因打靶，作為結果，其中抗體重鏈被敲除的牛是已知的(非專利文獻5和專利文獻6和7)。當將Λ AHAC導入獲得的抗體重鏈雙敲除牛(IgHM+AgHMLl+牛)中時，發現在14日齡小牛的血清中產生了 7. lyg/mL人類IgG (專利文獻7)。
此外，產生了其中導入K HAC的牛，所述K HAC是具有人類抗體重鏈基因座和人類抗體K型輕鏈(K鏈)基因座的HAC載體(非專利文獻6和專利文獻8)。K HAC是通過將包含人類2號染色體上的抗體K鏈基因座的片段易位到SC20上而構建的載體。在圖I中顯示了 K HAC的示意圖。在導入了 K HAC的IgHM+/IgHMLl+牛中，克隆468是抗體生產最高的個體，從出生后84天起，在血清中恒定地產生lg/L以上的人類IgG，并且在出生后210天顯示出超過2g/L的滴度。然而，穩定地產生表現出如上所述的高滴度的個體的技術還是未知的，因此對于以更高效率生產人類抗體的動物或能夠穩定地產生這些動物的技術，存在著需求。現有技術文獻專利文獻專利文獻I :W097/07671專利文獻2 W098/37757專利文獻3 W000/10383專利文獻4 :W002/92812專利文獻5 W02002/70648專利文獻6 :W003/97812專利文獻7 W005/104835專利文獻9 W009/111086非專利文獻非專利文獻I :Tomizuka 等，Nature Genetics, 16, 133-143，1997非專利文獻2 Kuroiwa 等，Nature Biotechnology, 18, 1086-1090，2000非專利文獻3 Dunham 等，Nature, 402, 489-495，1999非專利文獻4 Kuroiwa 等，Nature Biotechnology, 20, 889-894, 2002非專利文獻5 Kuroiwa 等，Nature Genetics, 36, 775-780, 2004非專利文獻6 Kuroiwa 等，Nature Biotechnology, 27, 173-181, 2009發明概述技術難題本發明的目的是提供用于有效生產人類抗體的動物、用于穩定供應所述動物的方法以及用于高效生產人類抗體的方法。
問題的解決方法考慮到上述目的，為了實現與常規HAC相比高的人類IgG生產量并穩定地產生具有高滴度的牛個體，本發明人改進了 HAC載體。也就是說，本發明涉及下列(I)至(8)(I) 一種人類人工染色體載體，其包含編碼人類抗體重鏈的基因、編碼人類抗體輕鏈的基因和編碼非人類動物來源的IgM重鏈恒定區的基因。(2) (I)中描述的人類人工染色體載體，其包含編碼人類抗體替代輕鏈的基因。(3) (2)中描述的人類人工染色體載體，其中編碼人類抗體替代輕鏈的基因是VpreB基因和λ 5基因。(4) (I)至(3)任一項中描述的人類人工染色體載體，其中編碼非人類動物來源的 IgM重鏈恒定區的基因是牛來源的IGHM。(5) 一種動物，其具有(I)至(3)任一項中描述的人類人工染色體載體。(6) 一種牛，其具有(4)中描述的人類人工染色體載體。(7) 一種用于生產人類抗體的方法，所述方法包含將靶抗原施用到(5)中描述的動物中以在動物血清中產生并積累針對該抗原的特異性人類抗體，以及從血清回收針對該抗原的特異性人類抗體。(8) 一種用于生產人類抗體的方法，所述方法包含將靶抗原施用到(6)中描述的牛中以在牛血清中產生并積累針對該抗原的特異性人類抗體，以及從血清回收針對該抗原的特異性人類抗體。本發明的有利效果通過將本發明的包含編碼人類抗體重鏈的基因、編碼人類抗體輕鏈的基因和編碼非人類動物來源的IgM重鏈恒定區的基因的人類人工染色體載體導入動物中，與通過常規HAC技術產生的載體相比，可以高效率生產人類抗體。此外,通過將本發明的人類人工染色體載體導入動物，可以穩定地產生能夠高效生產人類抗體的動物。此外，作為優選實施方案，當將除了編碼人類抗體重鏈的基因、編碼人類抗體輕鏈的基因和編碼非人類動物來源的IgM重鏈恒定區的基因之外還包含人類抗體替代輕鏈基因的人類人工染色體載體導入動物時，可以更高效率地生產人類抗體,并且可以穩定地產生能夠以這種高效率生產人類抗體的動物。附圖簡述圖I (a)顯示了 kHAC的示意圖。圖I (b)顯示了當將κ HAC導入動物時將在B細胞膜上形成的IgM的示意圖。在圖I (b)中,虛線表示人類來源的IgM部分,實線表示牛來源的IgM部分。圖2 (a)顯示了 KcHAC的示意圖。圖2 (b)顯示了當將KcHAC導入動物時將在B細胞膜上形成的IgM的示意圖。在圖2 (b)中,虛線表示人類來源的IgM部分,實線表示牛來源的IgM部分。圖3 (a)顯示了 cKSL-HACA的示意圖。圖3 (b)顯示了當將cKSL_HACΛ導入動物時將在B細胞膜上形成的IgM的示意圖。在圖3 (b)中，虛線表示人類來源的IgM部分，實線表示牛來源的IgM部分。圖4顯示了打靶載體pTEL’ hisDpurolox2272F9R9的示意圖。
圖5顯示了打靶載體pTELCAGzeoSLF2R2的示意圖。圖6顯示了打靶載體p553CAGlQx2272BsrDT的示意圖。圖7顯示了打靶載體pSC355CAGlM￡511hisDDT的示意圖。圖8顯示了打靶載體P 14CEN(FR) hygpuro^nDT的示意圖。圖9顯示了打靶載體pRNR2lQxPbSrDT的示意圖。
圖10顯示了打靶載體pCHlCAGzeoDT的示意圖。圖11顯示了打靶載體pCH2CAGzeoDT的示意圖。圖12顯示了用于在雞DT40細胞中修飾人類2號染色體的方法的概要。 圖13顯示了用于在雞DT40細胞中修飾人類22號染色體的方法的概要。圖14顯示了用于在DT40雜交細胞中構建SLKH片段的方法的概要。圖15顯示了用于在DT40細胞中構建CH2D片段的方法的概要。圖16顯示了用于在DT40細胞中修飾人類14號染色體的方法的概要。圖17顯示了用于在DT40雜交細胞中構建cKSL_HACA的方法的概要。圖18顯示了用于在成纖維細胞中構建cHAC的方法的概要。
圖19顯示了在6月齡HAC牛的各血清中人類IgG的總量。圖20顯示了 CEM細胞特異性ELISA測定法的結果。執行本發明的實施方案本發明涉及(I)包含人類抗體重鏈基因、人類抗體輕鏈基因和非人類動物來源的IgM重鏈恒定區基因的人類人工染色體載體，(2)具有所述人類人工染色體載體的動物，以及(3)用于生產人類抗體的方法，所述方法包含將靶抗原施用到動物以在動物血清中生產和積累抗原特異性人類抗體，以及從血清回收抗原特異性人類抗體。I.本發明的人類人工染色體載體在本發明中，“人類人工染色體載體”是指包含人類染色體來源的著絲粒序列、端粒序列和復制原點、并且在宿主細胞的核中獨立于宿主細胞的染色體存在的載體。具體來說，載體是指通過將人類染色體上的所需區域易位到穩定的人類染色體片段中而制備的人類人工染色體(HAC)載體。用于制備HAC的方法的具體實例包括下述方法，所述方法包含插入端粒序列和被Cre重組酶識別的IoxP序列，使得可以包含人類染色體或染色體片段上的所需區域，并使插入到染色體或染色體片段的端粒序列與IoxP序列之間的區域與插入到另一個染色體或染色體片段(優選為在核中穩定并且向后代傳遞效率高的染色體片段)的端粒序列與IoxP序列之間的區域通過易位而結合(Kuroiwa等，NatureBiotechnology, 18，1086-1090，2000 和 WO No. 00/10383)。(人類抗體重鏈基因) 本發明的人類人工染色體載體包含人類抗體重鏈基因。在本發明中，“人類抗體重鏈基因”是指在構成人類免疫球蛋白分子的兩條同一重鏈和兩條同一輕鏈中，編碼前者的基因。人類抗體重鏈基因的具體實例包括編碼重鏈可變區的基因和編碼決定恒定區結構的Y鏈、μ鏈、α鏈、δ鏈和ε鏈的基因。在本發明的人工染色體載體中，“包含人類抗體重鏈基因”是指包含編碼人類抗體重鏈基因的DNA。可以通過將編碼人類抗體重鏈基因的DNA插入到任何位置中，或插入或連接包含編碼人類抗體重鏈基因的DNA的染色體片段，來制備本發明的人類人工染色體載體。人類抗體重鏈的可變區基因和恒定區基因形成簇，并位于人類14號染色體的14q32處。因此，本發明的人工染色體載體優選包含人類14號染色體片段，更優選為人類抗體重鏈的可變區基因和恒定區基因所位于的人類14號染色體片段，更加優選為包含14q32區的人類14號染色體片段。(人類抗體輕鏈基因)本發明的人類人工染色體載體包含人類抗體輕鏈基因。在本發明中人類抗體輕、鏈基因”是指在構成人類免疫球蛋白分子的兩條同一重鏈和兩條同一輕鏈中，編碼后者的基因。人類抗體輕鏈基因的具體實例包括兩種類型的基因，即K鏈基因和λ鏈基因。每種鏈的基因包含編碼可變區的基因和編碼恒定區的基因。本發明的人類人工染色體載體可以只包含K鏈基因或λ鏈基因、或這兩種基因作為人類抗體輕鏈基因。在本發明的人工染色體載體中，“包含人類抗體輕鏈基因”是指包含編碼人類抗體輕鏈基因的DNA。可以通過將編碼人類抗體輕鏈基因的DNA插入到任何位置中、或插入或連接包含編碼人類抗體輕鏈基因的DNA的染色體片段，來制備本發明的人類人工染色體載體。K鏈和λ鏈的可變區基因和恒定區基因成簇定位于染色體上。K鏈基因簇位于人類 2 號染色體的 2ρ11· 2 處(Gottfrie 等，Genomics, 16，512-514，1993)，λ 鏈基因簇位于人類 22 號染色體的 22qll. 2-12 處(Collins 等，Nature, 377，367-379，1995)。因此，本發明的人工染色體載體優選包含人類2號染色體片段，更優選為λ鏈基因簇所位于的人類2號染色體片段，更加優選為包含2pll. 2-12區的人類2號染色體片段。此外，本發明的人工染色體載體優選包含人類22號染色體片段，更優選為κ鏈基因簇所位于的人類22號染色體片段，更加優選為包含22qll. 2區的人類22號染色體片段。( IgM重鏈恒定區基因)本發明的人類人工染色體載體包含非人類動物來源的IgM重鏈恒定區基因。對非人類動物沒有特別限制，只要動物是能夠作為宿主導入本發明的人類人工染色體載體的非人類動物即可，并可以是任何有蹄類動物例如奶牛、馬、山羊、綿羊和豬，嚙齒類動物例如小鼠、大鼠和兔，家禽例如雞、家鴨和鵝。非人類動物優選為非人類哺乳動物，更優選為有蹄類動物，更加優選為牛。在本發明中“IgM重鏈恒定區基因”是指編碼IgM重鏈恒定區的基因。IgM重鏈恒定區通過與B細胞膜分子Iga/Igi3相互作用以引起細胞內信號傳導，促進B細胞的發生。IgM重鏈恒定區基因的具體實例包括編碼恒定區結構域例如CH1、CH2、CH3和CH4以及B細胞跨膜結構域例如TMl和TM2的基因。對包含在本發明的人類人工染色體載體中的非人類動物來源的IgM重鏈恒定區基因沒有特別限制，只要該區域處于上述IgM重鏈恒定區中可以充分誘導B細胞發生信號的范圍內即可，但優選包含非人類動物來源的TMl和TM2結構域，更優選包含編碼非人類動物來源的CH2結構域、CH3結構域、CH4結構域、TMl結構域和TM2結構域的基因。在本發明的人類人工染色體載體中，“包含非人類動物來源的IgM重鏈恒定區基因”是指包含編碼非人類動物來源的IgM重鏈恒定區基因的DNA。可以通過將編碼非人類動物來源的IgM重鏈恒定區基因的DNA插入到任何位置中，或連接包含編碼人類IgM重鏈恒定區基因的DNA的染色體片段，來制備本發明的人類人工染色體載體。
具體來說，優選將人類人工染色體上編碼人類IgM重鏈恒定區基因的一些DNA用編碼非人類動物來源的IgM重鏈恒定區基因的一些DNA替換。具體來說，當將人類人工染色體上編碼人類IgM重鏈恒定區基因的一部分DNA用編碼非人類動物來源的IgM重鏈恒定區基因的一部分DNA替換時，優選將人類人工染色體上編碼人類IgM重鏈恒定區基因中的TMl結構域和TM2結構域的DNA，分別用編碼非人類IgM重鏈恒定區基因中的TMl結構域和TM2結構域的DNA替換；更優選將編碼人類IgM重鏈恒定區基因中的CHl結構域、CH2結構域、CH3結構域、CH4結構域、TMl結構域和TM2結構域的DNA，分別用編碼非人類IgM重鏈恒定區基因中的CHl結構域、CH2結構域、CH3結構域、CH4結構域、TMl結構域和TM2結構域的DNA替換；或者將人類人工染色體上編碼人類IgM重鏈恒定區基因中的CH2結構域、CH3結構域、CH4結構域、TMl結構域和TM2結構域的DNA，分別用編碼非人類IgM重鏈恒定區基因中的CH2結構域、CH3結構域、CH4結構域、TMl結構域和TM2結構域的DNA替換。非人類動物來源的IgM重鏈恒定區基因優選為非人類哺乳動物的IgM重鏈恒定區基因，更優選為有蹄類動物的IgM重鏈恒定區基因，更加優選為牛的IgM重鏈恒定區基因。牛的IgM重鏈恒定區基因優選為包含在牛內源IgM重鏈基因所位于的IGHM區中(IGHM來源)的牛IgM重鏈恒定區的編碼基因，或者是編碼IGHMLl區中(IGHML1來源)的牛IgM重鏈恒定區的基因，更優選為編碼包含在IGHM區中的牛IgM重鏈恒定區的基因。(人類抗體替代輕鏈基因)本發明的人類人工染色體載體包含人類抗體替代輕鏈基因。在本發明中，“人類抗體替代輕鏈基因”是指編碼假抗體輕鏈的基因，所述假抗體輕鏈與在人類前B細胞中通過基因重構產生的抗體重鏈結合，以構成前B細胞受體(preBCR)。人類抗體替代輕鏈基因的具體實例包括VpreB基因和λ 5基因。本發明的人類人工染色體載體優選包含VpreB基因和λ 5基因作為人類抗體替代輕鏈基因。本發明的VpreB基因優選包含VpreBl基因和VpreB3基因中的任一個或兩者，更優選包含VpreBl基因和VpreB3基因兩者。在本發明的人類人工染色體載體中，“包含人類抗體替代輕鏈基因”是指包含編碼人類抗體替代輕鏈基因的DNA。可以通過將編碼人類抗體替代輕鏈基因的DNA插入到任何位置中，或插入或連接包含編碼人類抗體替代輕鏈基因的DNA的染色體片段，來制備本發明的人類人工染色體載體。VpreB基因和λ 5基因中的任一個都位于人類22號染色體的22ql I. 2處的人類抗體λ鏈基因座內。因此，本發明的人類人工染色體載體優選包含人類22號染色體，更優選為包含VpreB基因和λ 5基因的人類22號染色體，更加優選為包含22qll. 2區的人類22號染色體。
2.構建本發明的人類人工染色體載體的方法本發明的包含人類抗體重鏈基因、人類抗體輕鏈基因和人類抗體替代輕鏈基因的人類人工染色體載體，可以使用下述(I)至(3)的方法來構建。(I)包含人類抗體重鏈基因的人類人工染色體片段的構建可以按照W098/037757中描述的方法，通過從人類正常細胞分離人類14號染色體，以從所述染色體獲得包含人類抗體重鏈基因的染色體片段，來構建包含人類抗體重鏈基因的人類人工染色體片段。
具體來說，盡管在人類14號染色體分離過程或在細胞內保持所述染色體的過程期間偶發產生的染色體片段可以通過W000/010383中描述的方法來分離，但可以通過對人類14號染色體輻照電離輻射以斷裂染色體來獲得染色體片段，并且也可以通過將端粒序列插入到人類14號染色體的所需位置中以在該位置處產生缺失，來獲得染色體片段。此夕卜，可以通過使用Kuroiwa等的方法(Kuroiwa等，NatureBiotechnology, 18，1086-1090, 2000和W000/010383)，將不包含人類抗體重鏈基因的人類染色體片段插入或連接到包含人類14號染色體來源的人類抗體重鏈基因的片段中，來構建由此獲得的人類人工染色體載體。包含人類抗體重鏈基因的人類人工染色體片段的實例包括SC20 (Tomizuka等，Proceeding of the National Academy of Sciences, 97，722-727，2000和W098/037757)、入 HAC (Kuroiwa 等，Nature Biotechnology, 18，1086-1090，2000 和 W000/010383)、k HAC(Kuroiwa等，Nature Biotechnology, 27，173-181，2009和W009/111086)、AHAC和 A AHAC(Kuroiwa 等，Nature Biotechnology, 18, 1086-1090，2000 和 W000/010383)等。(2)包含人類抗體輕鏈基因的人工染色體片段的構建可以按照W098/037757中描述的方法，通過從人類正常細胞分離人類2號染色體，以從所述染色體獲得包含人類抗體K鏈基因的染色體片段，來構建包含人類抗體K鏈基因的人類人工染色體片段。具體來說，盡管在人類2號染色體分離過程或在細胞內保持所述染色體的過程期間偶發產生的染色體片段可以通過W000/010383中描述的方法來分離，但可以通過對人類2號染色體輻照電離輻射以斷裂染色體來獲得染色體片段，并且也可以通過將端粒序列插入到人類2號染色體的所需位置中以在該位置處產生缺失，來獲得染色體片段。可以通過使用Kuroiwa等的方法(Kuroiwa等，NatureBiotechnology, 27，173-181，2009和W009/111086)，將包含人類2號染色體來源的人類抗體K鏈基因的片段插入或連接到不包含人類2號染色體來源的人類抗體K鏈基因的人類染色體片段中，來構建包含人類抗體K鏈基因的人類人工染色體片段。由此獲得的包含人類抗體K鏈基因的人類人工染色體片段的實例，包括KHAC(Kuroiwa 等，Nature Biotechnology, 27, 173-181，2009 和 W009/111086)。可以按照W098/037757中描述的方法，通過從人類正常細胞分離人類22號染色體，以從所述染色體獲得包含人類抗體 ' 鏈基因的染色體片段，來構建包含人類抗體 ' 鏈基因的人類人工染色體片段。具體來說，盡管在人類22號染色體分離過程或在細胞內保持所述染色體的過程期間偶發產生的染色體片段可以通過W000/010383中描述的方法來分離，但可以通過對人類22號染色體輻照電離輻射以斷裂染色體來獲得染色體片段，并且也可以通過將端粒序列插入到人類22號染色體的所需位置中以在該位置處產生缺失，來獲得染色體片段。此外，可以通過使用Kuroiwa等的方法(Kuroiwa等，NatureBiotechnology, 18，1086-1090，2000 和 W000/010383)，將包含人類 22 號染色體來源的人類抗體\鏈基因的片段插入或連接到不包含人類抗體\鏈基因的人類染色體片段中，來構建包含人類抗體X鏈基因的人類人工染色體片段。由此獲得的包含人類抗體重鏈基因的人類人工染色體片段的實例，包括XHAC(Kuroiwa 等，Nature Biotechnology, 18, 1086-1090, 2000 和 W000/010383)、AHAC 和A AHAC (Kuroiwa 等，Nature Biotechnology, 20，889-894，2002 和 W002/092812)。(3)包含非人類動物來源的IgM重鏈恒定區基因的人類人工染色體片段的構建 可以通過用非人類動物來源的IgM重鏈恒定區基因替換通過上述(I)的方法構建的包含人類抗體重鏈基因的人類人工染色體片段上的人類IgM重鏈恒定區基因，將非人類動物來源的IgM重鏈恒定區基因包含在本發明的人類人工染色體載體中。具體來說，可以通過同源重組，將通過上述(I)的方法構建的包含人類抗體重鏈基因的人類人工染色體載體上編碼人類IgM重鏈恒定區基因中的CH2結構域、CH3結構域、CH4結構域、TMl結構域和TM2結構域的DNA，分別用編碼非人類IgM重鏈恒定區基因的CH2結構域、CH3結構域、CH4結構域、TMl結構域和TM2結構域的DNA替換，來構建非人類動物來源的IgM重鏈恒定區基因。因此，可以通過同源重組，將通過上述(I)或(2)的方法構建的包含人類抗體重鏈基因和人類抗體輕鏈基因的人類人工染色體載體中包含人類抗體重鏈基因的人類人工染色體片段上編碼人類IgM重鏈恒定區基因中的CH2結構域、CH3結構域、CH4結構域、TMl結構域和TM2結構域的DNA，分別用編碼非人類IgM重鏈恒定區基因中的CH2結構域、CH3結構域、CH4結構域、TMl結構域和TM2結構域的DNA替換，來構建包含人類抗體重鏈基因、人類抗體輕鏈基因和非人類動物來源的IgM重鏈恒定區基因的人類人工染色體載體。或者，通過同源重組，將通過上述(I)至(3)的方法構建的包含人類抗體重鏈基因和人類抗體輕鏈基因的人類人工染色體載體中包含人類抗體重鏈基因的人類人工染色體片段上編碼人類IgM重鏈恒定區基因中的CHl結構域、CH2結構域、CH3結構域、CH4結構域、TMl結構域和TM2結構域的DNA，分別用編碼非人類IgM重鏈恒定區基因中的CHl結構域、CH2結構域、CH3結構域、CH4結構域、TMl結構域和TM2結構域的DNA替換。此外，可以使用上述(I)至(3)的方法，來構建本發明的包含人類抗體重鏈的編碼基因、人類抗體輕鏈的編碼基因和非人類動物來源的IgM重鏈恒定區的編碼基因的人類人工染色體載體。具體來說，可以將通過(I)的方法構建的包含人類抗體重鏈基因的人類14號染色體片段上的人類IgM重鏈恒定區基因用非人類動物來源的IgM重鏈恒定區基因替換，然后連接通過(2)的方法構建的包含人類K鏈基因的人類2號染色體片段，來構建本發明的載體。更具體來說，本發明的包含非人類動物來源的IgM重鏈恒定區基因的人類人工染色體載體可以用下述方式構建。通過同源重組，將K HAC (Kuroiwa等，NatureBiotechnology, 27，173-181，2009和W009/111086)上編碼人類IgM重鏈恒定區基因中的CHl結構域、CH2結構域、CH3結構域、CH4結構域、TMl結構域和TM2結構域的DNA，分別用編碼非人類IgM重鏈恒定區基因的CHl結構域、CH2結構域、CH3結構域、CH4結構域、TMl結構域和TM2結構域的DNA替換。以這種方式構建的本發明的人類人工染色體載體的實例包括KcHAC。在圖2中顯示了 KcHAC的示意圖。在圖2中顯示了 KcHAC的示意圖。如圖2中所示，與k HAC的結構(圖I)相比，由于KcHAC包含非人類動物(牛)來源的IgM重鏈恒定區基因的編碼基因，因此當它被導入動物中時，能夠以更高效率產生人類抗體，并且KcHAC可以穩定地產生能夠以這種高效率生產人類抗體的動物。(4)包含人類抗體替代輕鏈基因的人類人工染色體片段的構建可以按照W098/037757中描述的方法，通過從人類正常細胞分離人類22號染色體，以從所述染色體獲得包含人類抗體替代輕鏈基因的染色體片段，來構建包含人類抗體替代輕鏈基因的人類人工染色體片段。 具體來說，盡管在人類22號染色體分離過程或在細胞內保持所述染色體的過程期間偶發產生的染色體片段可以通過W000/010383中描述的方法來分離，但可以通過到人類22號染色體輻照電離輻射以斷裂染色體來獲得染色體片段，并且也可以通過將端粒序列插入到人類22號染色體的所需位置中以在該位置處產生缺失，來獲得染色體片段。此外，可以通過使用Kuroiwa等的方法(Kuroiwa等，NatureBiotechnology, 18，1086-1090, 2000和W000/010383)，將包含人類抗體替代輕鏈基因的片段插入或連接到不包含人類抗體替代輕鏈基因的人類染色體片段中，來構建包含人類抗體替代輕鏈基因的人類人工染色體片段。可以使用上述(I)至(4)的方法，來構建本發明的包含人類抗體重鏈的編碼基因、人類抗體輕鏈的編碼基因和非人類動物來源的IgM恒定區的編碼基因、并且還包含人類抗體替代輕鏈的編碼基因的人類人工染色體載體。具體來說，可以將通過(I)的方法構建的包含人類抗體重鏈基因的人類14號染色體片段上的人類IgM重鏈恒定區基因，通過(3)的方法用非人類動物來源的IgM重鏈恒定區基因替換，然后連接通過(2)的方法構建的包含人類K鏈基因的人類2號染色體片段，以及通過(2)和(4)的方法構建的包含人類\鏈基因和人類抗體替代輕鏈基因的人類22號染色體片段，來構建本發明的載體。更具體來說，包含本發明的人類抗體重鏈基因、人類抗體輕鏈基因和人類抗體替代輕鏈基因、并且還包含非人類動物來源的IgM恒定區的人類人工染色體載體，可以用下述方式構建。首先，通過同源重組，將人類14號染色體片段上編碼人類IgM重鏈恒定區基因中的CH2結構域、CH3結構域、CH4結構域、TMl結構域和TM2結構域的DNA，分別用編碼非人類IgM重鏈恒定區基因的CH2結構域、CH3結構域、CH4結構域、TMl結構域和TM2結構域的DNA替換。然后，通過同源重組將IoxP序列插入到人類14號染色體片段上的RNR2基因座內(Worton 等，Science, 239, 64-68，1988)。同時，將作為Cre重組酶的識別序列的IoxP序列和lox2272序列，通過同源重組分別插入到位于人類2號染色體片段上人類K鏈基因簇區的極性著絲粒一側上的COS138位點(Kuroiwa 等，Nature Biotechnology, 27, 173-181，2009)和位于極性端粒一側的AC104134位點(基因登記號)中。此外，在通過同源重組將端粒序列插入到人類22號染色體片段上包含人類入鏈基因和人類抗體替代輕鏈基因的簇區域的極性端粒一側上的AP000350位點(基因登記號)中并然后切開染色體之后，通過同源重組將10x2272序列插入到極性著絲粒一側上的AP000553位點(基因登記號)中。通過Cre/loxP重組，通過將人類22號染色體片段上的AP000553位點易位到人類2號染色體片段上的AC104134位點中，將兩條染色體連接。此外，通過Cre/loxP重組，通過將人類14號染色體片段上的RNR2基因座易位到上面的連接體的人類2號染色體片段上的Cos138位點中，將三條染色體連接。將以這種方式構建的本發明的人類人工染色體載體的實例包括cKSL-HAC A。在圖3中顯示了 cKSL-HACA的示意圖。在圖3中顯示了 cKSL_HACA的示意圖。如圖3中所示，與K HAC的結構(圖I)相比，由于cKSL-HACA還包含非人類動物(牛)來源的IgM重鏈 恒定區的編碼基因和人類抗體替代輕鏈的編碼基因，因此當它被導入動物中時，能夠以更高效率產生人類抗體，并且也可以穩定地產生能夠以這種高效率生產人類抗體的動物。3.具有本發明的人類人工染色體載體的動物具有本發明的人類人工染色體載體的動物是指其中導入了本發明的人類人工染色體載體的動物。對具有本發明的人類人工染色體的動物沒有特別限制，只要動物是可以在其細胞內導入人類人工染色體片段的動物即可，并且可以使用任何非人類動物，例如有蹄類動物如奶牛、馬、山羊、綿羊和豬，嚙齒類動物例如小鼠、大鼠和兔，家禽例如雞、家鴨和鵝等。非人類動物優選為非人類哺乳動物，更優選為有蹄類動物，更加優選為牛。可以將通過上述(2)的方法構建的本發明的人類人工染色體載體導入到宿主動物的卵母細胞中，來構建具有本發明的人類人工染色體載體的動物。具體來說，使用W02005/104835中描述的方法和Kuroiwa等的方法(Kuroiwa等，Nature Biotechnology, 20, 889-894),將通過上述(2)的方法構建的本發明的人類人工染色體載體，通過微細胞融合方法導入到宿主動物來源的體細胞中。然后，可以通過將細胞的核或染色質凝聚物移植到卵母細胞中，并將卵母細胞或從卵母細胞形成的胚胎移植到宿主動物的子宮中使其生產，來構建具有人類人工染色體載體的動物。通過Kuroiwa 等的方法(Kuroiwa 等，Nature Biotechnology, 18, 1086-1090, 2000和Kuroiwa等,Nature Biotechnology, 20, 889-894),可以確認通過上述方法構建的動物是否具有本發明的人類人工染色體載體。4.生產本發明的人類抗體的方法可以通過用所需抗原免疫接種在上述(3)中構建的具有本發明的人類人工染色體載體的動物以在動物血清中產生抗原特異性人類抗體，并從血清回收抗原特異性人類抗體，來生產抗原特異性人類抗體。對用于免疫接種具有本發明的人類人工染色體載體的動物的抗原沒有特別限制，其實例包括腫瘤相關抗原、與過敏或炎癥相關的抗原、與心血管疾病相關的抗原、與自體免疫疾病相關的抗原、與神經變性疾病相關的抗原和與病毒或細菌性感染相關的抗原。腫瘤相關抗原的實例包括CD la、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD9、CD10、CD13、CD 19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD28、CD30、CD32、CD33、CD38、CD40、CD40 配體(CD40L)、CD44、CD45、CD46、CD47、CD52、CD54、CD55、CD55、CD59、CD63、CD64、CD66b、CD69、CD70、CD74、CD80、CD89、CD95、CD98、CD105、CD134、CD137、CD138、CD147、CD158、CD160、CD162、CD164、CD200、CD227、腎上腺髓質素、血管生成素相關蛋白4 (ARP4)、aurora、B7-H1、B7-DC、整合蛋白、骨髓基質抗原2 (BST2)、CA125、CA19. 9、碳酸酐酶9 (CA9)、鈣粘著蛋白、cc_趨化因子受體(CCR) 4、CCR7、癌胚抗原(CEA)、富含半胱氨酸的成纖維細胞生長因子受體-I (CFR-1)、c-Met, c-Myc、膠原蛋白、CTA、結締組織生長因子(CTGF)、CTLA-4、細胞角蛋白-18、DF3、E-catherin、表皮生長因子受體(EGFR)、EGFRvIII、EGFR2 (HER2)、EGFR3 (HER3)、EGFR4(HER4)、內皮糖蛋白、表皮細胞粘附分子(EpCAM)、內皮蛋白C受體(EPCR)、肝配蛋白、肝配蛋白受體(Eph)、EphA2、endotheliase_2 (ET2)、FAM3D、成纖維細胞活化蛋白(FAP)、Fc 受體同系物I (FcRHl)、鐵蛋白、成纖維細胞生長因子-8 (FGF-8)、FGF8受體、堿性FGF (bFGF)、bFGF受體、FGF受體(FGFR)3、FGFR4、FLTI、FLT3、葉酸鹽受體、卷曲蛋白同源物10 (FZD10 )、卷曲蛋白受體4 (FZD-4)、G250、G-CSF受體、神經節苷脂(⑶2、⑶3、GM2、GM3等)、globo H、gp75、gp88、GPR-9-6、乙酰肝素酶I、肝細胞生長因子(HGF)、HGF受體、HLA抗原(HLA-DR等)、HMl. 24、人乳脂肪球(HMFG)、hRS7、熱休克蛋白90 (hsp90)、獨特型表位、胰島素樣生長因子 (IGF)、IGF受體(IGFR)、白介素(IL-6、IL-15等)、白介素受體(IL-6R、IL-15R等)、整合蛋白、免疫受體易位相關蛋白-4 (IRTA-4)、激肽釋放酶I、KDR、KIR2DL1、KIR2DL2/3、KS1/4、lamp-1、lamp-2、層粘連蛋白-5、Lewis y、唾液酰Lewis x、淋巴毒素-0 受體(LTBR)、LUNX、黑素瘤相關的硫酸軟骨素蛋白多糖(MCSP)、間皮素、MICA、苗勒管(Mullerian)抑制物質II型受體(MISIIR)、粘蛋白、神經細胞粘附分子(NCAM)、Necl-5、Notchl、骨橋蛋白、血小板衍生生長因子(PDGF)、PDGF受體、血小板因子-4 (PF-4)、磷脂酰絲氨酸、前列腺特異抗原(PSA)、前列腺干細胞抗原(PSCA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、甲狀旁腺激素相關蛋白/肽(PTHrP)、NF-K B配體的受體活化因子(RANKL)、透明質酸介導的細胞游走受體(RHAMM)、ROBOl、SART3、腦信號蛋白4B (SEMA4B)、分泌型白細胞蛋白酶抑制劑(SLPI)、SM5-1、神經鞘氨醇-I-磷酸、腫瘤相關糖蛋白-72 (TAG-72)、轉鐵蛋白受體(TfR)、TGF-P ,Thy-UTie-UTie2受體、T細胞免疫球蛋白結構域和粘蛋白結構域I (TM-1)、人組織因子(hTF)、Tn抗原、腫瘤壞死因子(TNF)、Thomsen_Friedenreich抗原(TF抗原)、TNF受體、腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TRAIL)、TRAIL受體(DR4、DR5等)、系統ASC氨基酸轉運蛋白2(ASCT2)、trkC、TR0P-2、TWEAK受體Fn 14、IV型膠原酶、尿激酶受體、血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF受體(VEGFRl、VEGFR2、VEGFR3 等)、波形蛋白、VLA-4 等。與過敏或發炎相關的抗原的實例包括IL-6、IL-6R、IL-5、IL-5R、IL-4、IL_4R、TNF、TNF受體、CCR4、趨化因子、趨化因子受體等。與心血管疾病相關的抗原的實例包括GPIIb/IIIa、PDGF, I3DGF受體、凝血因子、IgE、a V 旦 3、a 4 3 7 等。與病毒或細菌性感染相關的抗原的實例包括gpl20、⑶4、CCR5、志賀樣毒素、炭疽保護性抗原、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ) (MRSA)抗原、乙型肝炎病毒(HBV)抗原、巨細胞病毒(CMV)抗原、狂犬病抗原、水痘帶狀皰疹(Varicella zoster)抗原等。它們的其他實例包括T細胞表面膜蛋白混合物、Rh(D)抗原、響尾蛇毒素、地高辛坐寸O通過將抗原與例如弗氏完全佐劑或適合的佐劑例如氫氧化鋁凝膠和百日咳細菌疫苗一起皮下、靜脈內或腹膜內施用到動物中，來進行免疫接種。將抗原施用到具有本發明的人類人工染色體載體的動物中的形式的實例，包括肽、蛋白、細菌、病毒、細胞、生物組織塊等。當抗原是部分肽時，與載體蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)、鑰孔嘁血藍蛋白(KLH)等產生接合物，并將其用作免疫原。在第一次施用后，將抗原每I至4周施用I次至10次。在從每次施用起I至14
天后，從動物收集血液以測量血清的抗體效價。用于檢測和測量血清中包含的抗原特異性人類抗體的方法的實例，包括通過酶聯免疫吸附測定法[《抗體實驗指南》(Antibodies-A Laboratory Manual), Cold SpringHarbor Laboratory (1988)]的結合測定法、生物傳感器Biacore等。具體來說，可以通過將包含人類抗體的血清與抗原表達細胞溫育，然后使用特異性識別人類抗體的抗體來測量血清中人類抗體的結合量。此外，除了這些方法之外，可以通過按照本技術領域已知的方法(TheProstate, 67, 1163, 2007)鑒定抗體的祀抗原,來選擇抗體。用于從血清回收人類抗體的方法的實例，包括通過將人類抗體吸附在蛋白A載體、蛋白G載體或承載有人類免疫球蛋白特異性抗體的載體上以進行純化的方法。此外，可以將蛋白質純化中使用的方法例如凝膠過濾、離子交換層析和超濾進行組合。通過上述方法生產的人類抗體可以是多克隆或單克隆抗體，優選為多克隆抗體。實施例實施例I打靶載體的構建(I)打靶載體 pTEL’ hisDpurolox2272F9R9 的構建基本上使用在出版物(Kuroiwa等，NatBiotechnol. 18:1086-1090, 2000,Kuroiwa等，Nat Biotechnol. 20:889-894，2002 和 Kuroiwa 等，Nat Biotechnol. 27:173-181，2009)中描述的方法來構建打靶載體。具體來說，使用兩個引物DNA kD_F9 (5’_tcgaggatccgccagggagacagatgccaagtacggtttag_3，) (SEQ ID N0:l)#PkD_R9 (5，_tcgaggatccaggatctttgggggactgaatggggtgtgct-3’)(SEQ ID NO :2)，并使用具有人類2號染色體的雞DT40細胞株KTLUKuroiwa等，NatBiotechnol. 27:173-181，2009)的基因組DNA作為模板，通過由40個循環的98°C 10秒和680C 9分鐘構成的PCR，擴增了用作同源臂的基因組DNA片段Dk_F9R9。隨后，以下列次序構建質粒pTEL’ hisDpuro1 2272。首先，通過將包含修飾型lOX2272序列的兩個寡DNA片段[由核苷酸序列5’-agettggatccataacttcgtataggatactttatacgaagttata-3’ (SEQ ID NO :3)構成的 DNA 片段和由核苷酸序列 5，-agcttataacttcgtataaagtatcctatacgaagttatggatcca-3> (SEQ ID NO :4)構成的DNA片段]退火,然后克隆到質粒pPUR (BD Bioscience Clontech)的HindIII位點中，構建了質粒pPUR1 2272。同時,通過將質粒pTELpuro (Kuroiwa 等，Nat Biotechnol. 18:1086-1090，2000，Kuroiwa 等，Nat Biotechnol. 20:889-894，2 0 0 2 和 Kuroiwa 等，NatBiotechnol. 27:173-181，2009)的嘌呤霉素抗性基因(在后文中稱為pure/)用hisD基因替換，將EcoRI位點用SrfI位點替換，并將SpeI位點用PmeI位點替換，構建了質粒PTELj hisDPm。在產生了 pPUR1 2272的BamHI消化并平端化的片段后，將獲得的片段克隆到pTEL’ hisDPm的PmeI位點中，由此獲得的質粒被命名為pTEL’ hisDpuro1 2272。通過將上述PCR擴增的Dk-F9R9亞克隆到pTEL’ hisDpurolox2272的BamHI位點中，構建了質粒 pTEL’ hisDpurolox2272F9R9 (圖 4)。(2)打靶載體 pTELCAGzeoSLF2R2 的構建
采用與(I)中相同的方式，通過將質粒pTELpuro的EcoRI位點用SrfI位點替換，然后將SrfI位點用PmeI位點替換，并進一步將pirn)基因用CAGzeo基因替換，構建了pTELCAGzeo(Sr)Pm。同時，通過使用 SL-F2 (5，-tcgaggatccggcctcccaaaggattatagacgtgagccactgt~3>) (SEQ ID NO :5)和 SL-R2 (5’ -tcgaggatccaaagaaggggcccgcctctgcctctaaatcctgac-3’)(SEQ ID NO :6)作為PCR引物組，并使用具有人類22號染色體的雞DT40細胞株52-18(Kuroiwa 等，Nucleic Acids Res 26:3447-3448，1998)的染色體 DNA 作為模板,通過重復40個循環的98°C 10秒和68°C 9分鐘，擴增了用作同源臂的基因組DNA片段。通過將獲得的PCR產物亞克隆到質粒pTELCAGzeo (Sr) Pm的BamHI位點中，構建了pTELCAGzeoSLF2R2 (圖 5)。
(3)打靶載體 p553CAGlM￡2272BsrDT 的構建構建了結構中將打祀載體pHCF21oxPHyg (Kuroiwa等，NatBiotechnol. 18:1086-1090, 2000)用通過PCR在其中擴增了 HCF2基因的同源臂序列的AP000553位點(GenBank登記號)序列替換的載體，并用作打靶載體p5531oxPHyg (F)。此時，使用553-F3 (5，_tgtagctgactttagccacccacaagtac_3，)(SEQ ID NO :7)和553-R3 (5，-cttgctgattatacctcatctccttccctc-3，)(SEQ ID NO :8)作為引物組,雞 DT40細胞52-18的基因組DNA作為模板，通過由40個循環的98°C 10秒和68°C 15分鐘構成的PCR，進行了 AP000553位點片段的擴增。在將獲得的質粒p5531oXPHyg(F)用NotI消化后，執行自身連接，然后將白喉毒素A片段(在后文中稱為DT-A)克隆到Srf位點中。同時，如下所述對pDRIVE-CAG (InvivoGen)進行修改。將各自包含IoxP序列的"M- DNA[5，_gtacaataacttcgtatagcatacattatacgaagttatagatctg_3， (SEQ ID NO 9) #口5J -aattcagatctataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatt-3J (SEQ ID NO :10)]退火，并替換pDRIVE-CAG的IacZ片段。通過將SdaI和SwaI消化的片段克隆到PstI和SmaI消化的 pBluescript SK- (Stratagene)中，構建了 pCAGloxP。隨后，將pCAGlQxP 的 IoxP 序列用包含通過兩個寡 DNA[5’_gatctataacttcgtataggatactttatacgaagttatg_3，(SEQ ID NO :11)#口 5，_ctagcataacttcgtataaagtatcctatacgaagttata-3’ (SEQ ID NO :12)]的退火產生的lox2272的序列替換。此外，通過將滅瘟素抗性基因(bsr基因)插入到SpeI位點中，構建了 pCAG^mnbsr。最后，通過將NotI-KpnI 片段(CAG-lox2272-polyA-bsr)克隆到 NotI 位點中，完成了 p553CAGlox2272BsrDT (圖 6)。(4)打靶載體 pSC355CAGlra￡511hisDDT 的構建使用SC355-F3 (5，-gtacaatcttggatcactacaacctctgcctacca-3，)(SEQ ID NO:13)和 SC355-R3 (5，-tgctgtgtctaatcaggtgttgaacccatctacta-3，)(SEQ ID NO :14)作為引物組，并使用包含人類14號染色體的雞DT40細胞的基因組DNA作為模板，通過由40個循環的98°C 10秒和68°C 15分鐘構成的PCR擴增了用作同源臂的基因組DNA。將質粒pBluescript的KpnI位點用SrfI位點替換,并將上述擴增的DNA片段亞克隆到SpeI位點中。獲得的質粒被用作pSC355F3R3。、隨后,將pCAGlra￡P的IoxP序列用包含通過兩個寡DNA [由序列5’-gatctataacttcgtatagtatacattatacgaagttatg-3’ (SEQ ID NO :15)構成的 DNA 片段和由核苷酸序列 5’_ctagcataacttcgtataatgtatactatacgaagttata-3，(SEQ ID NO :16)構成的 DNA 片段]退火產生的10x511的序列進行替換，并用作pCAG1 51。通過將hisD基因插入到pCAG1 511的SpeI位點中，構建了 pCAGk—hisD。將用NotI 和 KpnI 消化的片段(CAG-lox511-polyA-hisD)克隆到 pSC355F3R3 的 EcoRV 位點中。最后，通過將DT-A片段亞克隆到NotI位點中獲得的質粒，作為pSCSSSCAG^HhisDDT使用(圖 7)。(5)打靶載體 pl4CEN(FR)hygpurolra￡511DT 的構建使用14CEN-F (5，_tcgaggatccttcgccaccccaaagatgattacagattac_3，)(SEQ IDNO 17)和 14CEN-R (5’ -tcgaggatcctacactagaagcacaaaccccaccattacacat-3J) (SEQ IDNO 18)作為引物組，并使用包含人類14號染色體的雞DT40細胞的基因組DNA作為模板，通過由40個循環的98°C 10秒和68°C 15分鐘構成的PCR擴增了用作同源臂的基因組DNA。通過將PCR產物克隆到其中KpnI位點被PmeI位點替換的pBluescript的BamHI位點中，構建了 pl4CEN(FR)。將包含lox511 序列的寡 DNA[由核苷酸序列 5’_agcttggatccataacttcgtatagtatacattatacgaagttata-3’ (SEQ ID NO :19)構成的 DNA 片段和由核苷酸序列 5’_agcttataacttcgtataatgtatactatacgaagttatggatcca-3’(SEQ ID NO :20)構成的 DNA 片段]退火。通過將獲得的片段克隆到質粒pPUR (BD Bioscience Clontech)的HindIII位點中，構建了質粒 pPUR1 511。通過分別將BamHI消化的pPURlox511片段克隆到pBluescript的BamHI位點中，將潮霉素抗性基因(hyg基因)克隆到EcoRV位點中，構建了 pHygPuro1 511。將NotI 和 KpnI 消化的片段(puro-lox511_hyg)克隆到 pl4CEN(FR)的 HpaI 位點中。最后，通過將DT-A片段亞克隆到PmeI位點中，完成了 p 14CEN(FR)hygpurolox511DT (圖8)。(6)打靶載體 pRNR2lQxPbsrDT 的構建通過將DT-A 片段插入到載體 pRNR2lQxPbsr (Kuroiwa 等，NatBiotechnol. 18:1086-1090, 2000)中，構建了打靶載體 pRNR2lQxPbsrDT (圖 9)。(7)打靶載體pCHlCAGzeoDT的構建
使用載體AFIX II，由定制文庫構建服務機構(Lofstrand社)從包含k HAC(W02009/111086)的CHO細胞構建了 k HAC的\噬菌體基因組文庫。使用由 5，-cagtccccggcagattcaggtgtcc-3，( SEQ ID NO 21)和5’-gaaagtggcattggggtggctctcg-3’ (SEQ ID NO :22)的核苷酸序列構成的 DNA 作為引物，并使用從包含K HAC的CHO細胞(W02009/111086)提取的DNA作為模板，通過由40個循環的98°C 10秒、64°C 30秒和72°C I分鐘構成的PCR進行擴增，使用所述PCR的產物作為探針，從構建的基因組文庫篩選包含人類IgM恒定區的克隆。結果，分離到I號、4號和7號克隆。將4號克隆(PmlI片段，I. 7kb)亞克隆到pBluescript的SmaI位點中，并將其命名SpCHlS(F)。在質粒口8(1^￥37-95中，將5&11-牛16冊染色體片段克隆到了 pBluescript中，將來自所述質粒的SacI-PmlI片段(Ikb)亞克隆到pCHlS(F)的PstI位點中，構建了pCHlSSP(F)。通過將源自于I號克隆的SmaI-EcoRI片段(7. 4kb)克隆到用EcoRV/EcoRI消化 的 pCHlSSP(F)中，構建了 pCHlSL。同時，從pBCii AY37-95，將SacI消化的片段(3. 5kb)pCH2S(F)亞克隆到pBluescript中。通過將其中導入了 IoxP序列的CAGzeo的XhoI消化片段(通過將CAGzeo片段插入到PBS246 (Gibco)的EcoRV位點中并用XhoI消化而構建的片段)克隆到獲得的質粒的Van91I位點中，構建了 pmAYSazeo(F)。此外，通過將pmAYSazeo (F)的SacI片段亞克隆到平端化的pCHlSL的EcoRI位點中，構建了 pCHlzeo(F)。最后，通過將DT-A片段亞克隆到PCHlzeo(F)的NotI位點中，完成了 pCHlCAGzeoDT (圖 10)。(8)打靶載體pCH2CAGzeoDT的構建將通過由核昔酸序列 5，-ggaccaggtggagactgtgcagtcctcacccataactttcagggcctacagcatgctg_3，(SEQ ID NO :23口 5，_cagcatgctgtaggccctgaaagttatgggtgaggactgcacagtctccacctggtcc-3’ (SEQ ID NO :24)構成的寡DNA退火產生的SeSp片段,克隆到平端化的pBluscript 的 PstI 位點中。通過將從質粒pBCii AY37-95用SphI和BamHI消化的片段(約2kb)亞克隆到上面獲得的質粒的SphI-BamHI位點中，構建了 pmAYSpB。同樣地，通過將？8(1^￥37-95用8&111111和？11111消化的片段(約2kb)亞克隆到pmAYSpB的BamHI-PmlI位點(其替換了原始的SpeI位點)中，構建了 pmAYSpBPml。通過將實施例I (7)中的I號克隆的EcoRI-SexAI片段(約0.6kb)亞克隆到pmAYSpBPml 的 EcoRI-SexAl 位點中，構建了 pRISe。隨后，通過將其中導入了 IoxP序列的CAGzeo亞克隆到pRISe的Van91I位點中，構建了 pRISeCAGzeo (R)。此外，通過將pRISeCAGzeo (R)的NotI位點用EcoRI位點替換，構建了 pRISeCAGzeoE。同時，通過將實施例1(7)中4號克隆的PmlI片段(約I. 7kb)亞克隆到其中EcoRV位點被MluI位點替換的pBluescript的SmaI位點中，構建了 pCH2S(F)。通過將實施例I (7)中I號克隆的MluI和EcoRI消化的片段(約6. 6kb)克隆到pCH2S(F)的 MluI-EcoRI 位點中，構建了 pCH2LS。
隨后，通過將pRISeCAGzeoE的EcoRI片段亞克隆到pCH2LS的EcoRI位點中，構建了 pCH2CAGzeo (F)。最后，通過將DT-A片段亞克隆到pCH2CAGzeo (F)的NotI位點中，完成了 pCH2CAGzeoDT (圖 11)。實施例2KSL-HAC 的構建(I)雞DT40細胞中人類2號染色體的修飾為了在人類2號染色體的AP104134位點處產生缺失并插入lox2272序列和無啟動子的 pure/盒,將打祀載體 pTEL’JiisDpurolrai2272FgRg 用 SrfI (Stratagene)線性化，并導入到 KTLl (Kuroiwa 等，Nat. Biotechnol. 27:173-181，2009)中，所述 KTLl 是通過電穿孔(550V、25 ii F)在CD8A基因座處具有消化的人類2號染色體片段的雞DT40細胞株。DT40 細胞的電穿孔通過出版物(Kuroiwa等，Nat. Biotechnol. 18:1086-1090，2000)中描述的方法來執行。通過組胺醇(0. 5mg/ml, Sigma)對集落進行2周的選擇,并測量對嘌呤霉素(I V- g/ml, Sigma)的敏感性作為Q)8A基因座上缺失puro1盒的指標。使用Gentra Puregene細胞試劑盒(QIAGEN)，從具有嘌呤霉素敏感性的集落提取染色體DNA，并使用FABPl-F(5’-tatcaagggggtgtcggaaatcgtg-3，)(SEQ ID NO :25)和 FABPl-R(5，-actgggcctgggagaacctgagact_3，) (SEQ ID NO :26)作為引物進行PCR篩選。通過重復30個循環的98°C 10秒、60°C 30秒和72°C I分鐘，在擴增存在于KTLl中但不存在于靶克隆中的FABPl基因座的條件下執行PCR。結果，將克隆K53鑒定為其中發生了所需缺失的克隆。圖12顯示了用于在雞DT40細胞中修飾人類2號染色體的方法的概要。(2)雞DT40細胞中的人類22號染色體的修飾為了在位于距人類22號染色體的AP000344位點(Kuroiwa等，Nat.Biotechnol. 20:889-894, 2002)約450Mb端粒一側上的AP000350位點處產生缺失，將打靶載體 pTELCAGzeoSLFR 用 PmeI (New England Biolabs)線性化并通過電穿孔(550V、25 u F)導入到作為具有人類22號染色體的雞DT40細胞株的52-18 (Kuroiw等，Nucleic AcidsRes 26:3447-3448，1998)中。通過博來霉素(lmg/ml, Invitrogen)對集落進行2周選擇。使用350T-F(5，_gaggtgggctgaggggcaagtgtg_3，)(SEQ ID NO :27)和 350T-R (5，_tacgaggaggggaggcagtgagagg-3’)(SEQ ID NO :28)作為引物，對從由此獲得的集落提取的基因組DNA進行PCR篩選。在存在于52-18中但是不存在于發生了打靶的克隆中的AP000350位點被擴增的條件下執行PCR (重復30個循環的98°C 10秒、63°C 30秒和72°C I分鐘)。結果，發現在克隆ST13中產生了正確消化。為了將10X2272序列和CAG啟動子整合到AP000553位點中，通過電穿孔(550V，25 u F),將用 PmeI (New England Biolabs)線性化的打祀載體 p553CAGlox2272bsrDT 導入ST13 中。通過滅痕素S (15 ii g/ml, Invitrogen)對集落進行2周選擇。從由此獲得的集落提取基因組 DNA,并使用 553K0-F (5，-gtcagccaggcgggccatttaccgtaagttatgta-3’)(SEQID NO :29)和 553K0-R (5，_agggctgggttagatggcaccaaatgaaaggagaa_3，)(SEQ ID NO :30)作為引物對其進行PCR篩選。通過重復40個循環的98 °C 10秒和68°C 6分鐘來執行PCR。結果，將克隆STL54鑒定為其中發生了打靶的克隆。圖13顯示了在雞DT40細胞中修飾人類22號染色體的方法的概要。(3)在DT40雜交細胞中構建SLKH片段按照出版物的方法(Kuroiwa 等，Nat. Biotechnol. 27:173-181，2009)，在雞 DT40雜交細胞中構建SLKH片段。將包含在實施例2 (I)中制備的包含源自于具有Iiyglr盒的人類2號染色體的片段的 K53 (Kuroiwa 等，Nat. Biotechnol. 27:173-181，2009)，與包含在實施例 2 (2)中制備的源自于具有bf盒的人類22號染色體的片段的STL54，使用PEG1500 (Roche)進行融合，以制備DT40雜交細胞。將集落在潮霉素B (I. 5mg/ml, Invitrogen)和滅痕素 S (20 u g/ml, Invitrogen)存在下維持3周，以選擇保持了兩個人類染色體片段的細胞。從所述集落提取基因組DNA并進行PCR。使用表I中顯示的引物組合，執行PCR，分別在使用cosl38K0-F和cosl38K0_R時重復40個由98°C 10秒和65°C 8分鐘構成的循環，在其他情況下重復40個由98°C 10秒、600C 30秒和72°C I分鐘構成的循環，驗證了人類2號染色體是否保持。
權利要求
1.一種人類人工染色體載體，其包含編碼人類抗體重鏈的基因、編碼人類抗體輕鏈的基因和編碼非人類動物來源的IgM重鏈恒定區的基因。
2.權利要求I的人類人工染色體載體，其包含編碼人類抗體替代輕鏈的基因。
3.權利要求2的人類人工染色體載體，其中編碼人類抗體替代輕鏈的基因是VpreB基因和λ 5基因。
4.權利要求I至3任一項的人類人工染色體載體，其中編碼非人類動物來源的IgM重鏈恒定區的基因是牛來源的IGHM。
5.—種動物，其具有權利要求I至3任一項的人類人工染色體載體。
6.一種牛,其具有權利要求4的人類人工染色體載體。
7.一種用于生產人類抗體的方法，其包括將靶抗原施用到權利要求5的動物中以在動物血清中產生并積累針對所述抗原的特異性人類抗體，以及從血清回收針對所述抗原的特異性人類抗體。
8.一種用于生產人類抗體的方法，所述方法包括將靶抗原施用到權利要求6的牛中以在牛血清中產生并積累針對所述抗原的特異性人類抗體，以及從血清回收針對所述抗原的特異性人類抗體。
全文摘要
本發明公開了一種人類人工染色體載體，其包含編碼人類抗體重鏈的基因、編碼人類抗體輕鏈的基因和編碼非人類動物來源的IgM重鏈恒定區的基因。
文檔編號C07K16/00GK102741404SQ201080052158
公開日2012年10月17日 申請日期2010年11月17日 優先權日2009年11月17日
發明者佐野曉子, 松下裕昭, 黑巖義巳 申請人:協和發酵麒麟株式會社