專利名稱：用于純化由固相肽合成法制備的肽的化合物和方法
技術領域：
本發明涉及用于純化由固相肽合成法制備的肽的化合物和方法。
背景技術：
肽的化學合成法被很好的建立。原則上，分為兩種不同的方法溶液中合成，其經常是非常耗時的并因此對科學研究無用；和固相載體上合成，其允許快速優化反應周期。可用于固相肽合成(SPPS)的方案是基于用規定的序列在不溶性固相上合成肽的Merrifield技術(Merrifield, R. B.，J. Amer. Chem. Soc. 85，1963,2149)。SPPS 的總的原理是基于反復的偶聯-脫保護循環通過羧基端連接在固相上的肽的游離N-端胺與單個N-保護的氨基酸単元偶聯。該單元然后脫保護，顯露出可以連接另ー個氨基酸的新的N-端胺。
然而，現今的SPPS方法除了目標化合物(成熟肽)之外，還產生相對眾多的雜質，特別是大量的不成熟肽。因此源自固相肽合成(SPPS)的肽的純化需要除去由不完全的偶聯/脫保護步驟而產生的被刪過的肽(即缺乏一個或幾個氨基酸殘基的肽)，和程度少得多的來自外消旋化或側鏈重排的其他肽副產物，以及SPPS程序的脫保護或裂解階段期間引入的各種化學物質。尤其是，要合成的肽越長，雜質的數量、特別是被刪過的肽的數量越多。因此，SPPS法的重要目標是從雜質中高速高收率地只回收目標肽。因此，已有建議在每次偶聯反應后通過こ酸酐進行封端，以終止非目標序列肽鏈的進ー步伸長并避免進ー步產生被刪過的肽和得到截短的肽。在連接最后的氨基酸后，只有具有完整氨基酸序列的肽在其N-端具有氨基該氨基可用于純化目標肽。已經公開了幾篇利用N-端氨基的肽純化法的報告。然而，這些方法均不能實現有效的ー步分離；反而需要復雜的分離過程。已經開發了另ー種方法，其中只有目標肽在它的N-端被兩個額外的殘基(半胱氨酸-甲硫氨酸)延長，然后與被苯基-汞基團衍生化的固相載體起反應，所述苯基-汞基團利用了選擇性結合半胱氨酸的SH基團。在分離之后，甲硫氨酸-肽的酰胺鍵被BrCN選擇性裂解，以產生目標肽(D. E. Kriegeret al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，73，3160 (1976))。可是，該方法的局限是不適用于含甲硫氨酸或半胱氨酸的肽。另ー種已經公開的方法中，目標肽與固相載體通過SH基團共價連接(美國專利n° 5，648，462和n° 5,994,588)。可是,該方法的局限是不適用于含半胱氨酸的肽。因此，需要有其他的方法來純化通過SPPS產生的肽，所述方法適用于任何類型的肽并且是易于實施的。
發明內容
本發明人發現，在SPPS結束吋，并且在肽從固相上脫保護/裂解步驟之前，有可能用包含以連接體分開的兩個化學官能團的化合物來選擇性標記成熟肽。通過根據本發明所述化合物與特定固相反應，該化合物能因此用于將成熟肽從其他封端的截短肽(不成熟肽)中純化出來。本發明因此涉及通式(I)的化合物
Xj-L-X2(I)其中-X1 選自-N3 或-C 三 CH,-L表示隔開X1和X2的連接體，-X2選自通式(A)、(B)和(C)的化合物
權利要求
1.通式⑴的化合物X1-L-X2(I)其中-X1 選自-N3 或-C = CH,-L表示隔開X1和X2的連接體，-X2選自通式(A)、⑶和(C)的化合物
2.權利要求I的化合物，其中所述連接體L將X1和X2隔開至少一個原子，特別是I至30個連續的原子。
3.權利要求I或2的化合物，其中所述連接體L選自-(CH2)n-、-CH2-(CH2-O-CH2)n_CH2_、-kr_、- (CH2) n_Ar_> -CH2- (CH2_0_CH2) n_CH2_Ar_> _ (CH2) n_0_Ar_> _CH2_ (CH2-O-CH2)n-CH2-0-Ar-和-CH2- (CH2-O-CH2)n_Ar_，其中 “n” 是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 或更多，并且其中Ar表示下式的芳基
4.權利要求1-3任一項的化合物，其中所述通式(A)的化合物選自
5.權利要求1-4任一項的化合物，其中當Y3是離去基團時,Y3選自-OR13和N(R13)2，其中R13表示CH3或C2、C3> C4或C5烷基。
6.權利要求I至5任一項的化合物，其中所述吸電子基團選自具有下式的吸電子基團
7.權利要求1-6任一項的化合物，其中所述氨基甲酸酯前體具有如下通式(II)
8.權利要求1-7任一項的化合物，其中所述通式⑶的化合物選自
9.權利要求1-8任一項的化合物，其中所述通式(C)的化合物選自
10.權利要求7-9任一項的化合物，其中X5是選自如下的離去基團
11.一種用于純化通過固相合成產生的肽的方法，所述方法包括如下步驟 (a)獲得具有游離的N-末端氨基的成熟肽與不成熟的封端肽的混合物，其中所述成熟和不成熟的肽具有其受到保護的側鏈并且與固相共價結合； (b)將步驟(a)的混合物與如權利要求1-10任一項所定義的通式(I)化合物接觸， 其中將從步驟(a)獲得的混合物與通式(I)化合物接觸的所述步驟導致通過所述成熟肽的游離N-末端氨基與X2的反應而在成熟肽和通式(I)化合物之間形成共價連接， (C)將從步驟(b)獲得的混合物進行酸處理以將所述肽從固相上裂解， (d)將從步驟(C)獲得的肽和能夠與X1反應的固相載體接觸，所述步驟導致在所述固相載體和所述成熟肽之間形成穩定的共價鍵， (e)洗滌從步驟(d)獲得的固相載體以除去不成熟的封端肽， (f)通過在選自下面的條件下裂解X2與成熟肽之間的共價鍵，從固相載體上釋放成熟肽，獲得純化的成熟肽 i.X2是(A)時為親核條件， 11.&是(B)時為堿性條件，和 iii. X2是(C)時為紫外線照射。
12.權利要求11的方法，其中所述“能夠與X1反應的固相載體”是嫁接有化合物的固相載體，其中所述化合物包括疊氮化物、炔烴、環辛炔或膦官能團，其能夠與X1反應。
13.權利要求11或12的方法，其中所述“能夠與X1反應的固相載體”選自 ■當X1是C三CH時
14.權利要求1-10任一項中所限定的通式(I)化合物用于純化通過固相合成產生的肽中的用途。
全文摘要
本發明涉及能夠用于純化通過固相肽合成產生的肽的化合物。另外，本發明還涉及使用本發明的化合物純化通過固相肽合成產生的肽的方法。
文檔編號C07K14/435GK102666565SQ201080051790
公開日2012年9月12日 申請日期2010年11月16日 優先權日2009年11月16日
發明者A·戴爾馬, V·奧卡涅 申請人:國家科學研究中心