患有牛新生兒全血細胞減少癥的小牛中的圓環病毒的檢測的制作方法

專利名稱：患有牛新生兒全血細胞減少癥的小牛中的圓環病毒的檢測的制作方法
患有牛新生兒全血細胞減少癥的小牛中的圓環病毒的檢測描述本發明涉及作為牛中的骨髓再生障礙伴出血性疾病的誘因劑的新的圓環病毒(CV)。本發明提供了用于診斷和治療用途的新的核酸和蛋白序列。簡介牛中的出血性疾病與多種誘因有關，包括病毒感染、遺傳疾病、免疫介導的疾病、細菌性敗血病和中毒。出血傾向和血小板減少癥與非細胞病變2型牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)感染相關(Ellis等人，1998, Rebhun等人，1989)。描述了西門塔爾牛(Simmentalcattle)的遺傳性出血體質。這種西門塔爾遺傳性血小板病是由血小板功能紊亂引起的(Steficek等人，1993)。免疫介導的血小板減少癥在牛中是罕見的狀況。其可被分類為特發性血小板減少性紫癜或繼發性實體(Yeruham等人，2003)。細菌感染的實例包括多殺巴 斯德菌(Pasteurella multocida),其是小牛中的出血性敗血病的熟知的誘因，臨床表現為瘀點性和瘀斑性出血、泛發性充血和肺炎(Rhoades等人，1967，Rimler, 1978)。有幾種毒素可能是牛中的致命性出血體質的原因。由于喂給小牛的三氯乙烯提取的大豆油柏中的二氯乙烯基半胱氨酸(DCVC) (Lock等人，1996)以及抗生素呋喃唑酮(Hoffmann-Fezer等人，1974,Hofmann等人，1974)中度,產生致命性再生障礙性貧血,顯著的骨髓非細胞性和廣泛的出血。攝入羊齒植物[歐洲蕨(Pteridium aquiIinum)]引起牛急性中毒，還伴有不可逆轉的骨髓低常增生(Maxie and Newman，2007，Valli，2007)。另外，已經描述了反會動物中Stachybotrys chartarum(atra)的真菌毒素中毒,導致全細胞減少疾病，其特征在于很多組織中的大出血和壞死(Harrach等人，1983，Valli, 2007)。雞感染性貧血是與本文報告的小牛中的出血性疾病非常類似的疾病。誘因劑是雞感染性貧血病毒(CIAV)。在感染了 CIAV的雞中，一致性發現嚴重的貧血、嚴重的骨髓再生障礙、胸腺和法布里劉烏斯氏囊的萎縮，以及出血(Kuscu and Gurel, 2008, Yuasa等人，1979)。實驗性接種了 CIAV的一日齡的SPF雞顯示出血細胞比容值的降低，變得瘦弱和抑郁并伴有貧血，特別是在接種后12-20天時(Goryo等人，1989)。CIAV在分類上屬于圓環病毒科(Circoviridae) (Todd等人,2005)。其僅感染雞，是環病毒屬(Gyrovirus)的唯一成員。然而，在哺乳動物和禽類物種中已經檢測到了另一個屬，圓環病毒屬(Circovirus)的數個成員，包括豬圓環病毒PCVl和PCV2。圓環病毒科的成員是無被膜的二十面體顆粒，具有環狀的單鏈DNA(ssDNA)基因組，大小為1759至2319個核苷酸(nt) (Todd等人，2005)。圓環病毒屬中的病毒具有雙義基因組結構，從有意鏈編碼復制相關(Itep)蛋白(開放閱讀框[ORF]-VI)，從互補鏈編碼衣殼蛋白(ORF-Cl)。在一些圓環病毒中已經認識到了另外的小的0RF，例如，在PCV2感染的細胞中編碼調亡誘導性蛋白的0RF3 (Liu等人，2005，Timmusk等人,2008)。在非編碼區，存在莖環結構，其含有保守性的九聚體序列并參與病毒基因組復制的起始(Steinfeldt等人，2001)。最近有人對圓環病毒的分子生物學進行了綜述(Mankertz,2008) 除了 PCVl之外，所有已知的圓環病毒都是病原體，引起免疫抑制和淋巴網狀組織的破壞(Mankertz, 2008, Segales 等人，2005, Segales and Mateu, 2006, Todd, 2000)。PCV2是與豬中的多種不同癥狀和疾病相關的病毒性病原體，例如斷奶后多系統消瘦綜合癥(PMWS)、豬呼吸道病復合體(PRDC)、與PCV2相關的繁殖障礙，豬皮炎和腎病綜合征(PDNS)。然而，通過PCV2接種在不哺喂母乳的仔豬和常規豬中僅證明了 PMWS的典型損傷(Ellis等人，1999，Kennedy等人，2000)，尚未完全研究透PCV2在除了 PMWS之外的豬疾病中的參與(Allan 等人，2003，Chae, 2005)。關于牛中的圓環病毒感染僅存在有限的數據。通過PCR證明了圓環病毒在100例牛呼吸道疾病中的6例、30例流產胎兒中的4例中的肺組織樣品中的存在(Nayar等人，1999)。該病毒的基因組，臨時命名為牛圓環病毒(BCV)，幾乎與PCV2相同，具有99%的總體核苷酸序列同一性。已經報道了與人、小鼠和牛的血清中的豬圓環病毒反應的抗體的存在(Tischer等人，1995)。然而,在另一項研究中，在來自牛、綿羊、馬和人的血清中未檢測到針對PCV2的抗體(Allan等人，2000，Ellis等人，2001)。另外，實驗性感染了 PCV2的I只血清陰性新生小牛和6只血清陰性的6月齡肉牛未產生針對該病毒的抗體(Ellis等人，2001)。
從2007年開始，在全德國的小牛中有了農場主和獸醫關于無法解釋的出血性疾病的報道。具有自發性出血的56只小牛被送到巴伐利亞動物健康服務中心以鑒定損傷并通過進一步的實驗室研究來研究病因。在不同品種的幼牛出生頭一個月內觀察到該疾病。雄性和雌性小牛同樣受影響。主要發現為出血，尤其是皮膚、皮下組織和胃腸道中的出血。其它零星發現有炎性損傷。組織學研究表明在所有的動物中存在嚴重的骨髓減少至再生障礙，在43%的受影響的小牛中存在淋巴細胞消減(lymphocytic depletion)。5只動物的血液分析揭示有再生障礙性全血細胞減少癥。相信所產生的血小板減少癥代表該出血性疾病綜合征(HDS)、也稱作出血體質(HD)的主要病理機理。同時，HDS/HD的更常見的和科學上接受的名稱是牛新生兒全血細胞減少癥(BNP)。不同的名稱和縮寫可以在本申請中相互替換地使用。細菌感染和牛病毒性腹瀉病毒或藍舌病毒感染被排除是該疾病的誘因。未檢測到已知引起骨髓再生障礙的特定毒素。系譜分析沒有給出該疾病的遺傳性的指示。使用寬譜PCR，本發明人能夠證明圓環病毒在受影響的小牛中的存在。全病毒基因組測序揭示了與2b型豬圓環病毒(PCV2b)的高度相似性。I只小牛的單個骨髓細胞顯示出輕度PCV2抗原免疫反應。

發明內容
本發明涉及被鑒定為牛中的出血性疾病綜合征(HDS)或出血體質(HD)、現在主要被稱作牛新生兒全血細胞減少癥(BNP)的誘因劑的新的圓環病毒(CV)的核酸分子。此外，本發明涉及由該病毒核酸編碼的新的多肽和針對這些多肽的抗體。所述核酸、多肽和抗體適合于診斷和治療用途，特別是用于開發針對HD的疫苗。在第一方面，本發明涉及圓環病毒(CV)核酸分子，其包含(a)如SEQ ID NO 1所示的序列或其片段，和/或(b)根據(a)的核苷酸序列的互補物。在另一方面，本發明涉及圓環病毒(CV)核酸分子，其包含(a)如SEQ ID NO 7所示的序列或其片段，和/或(b)根據(a)的核苷酸序列的互補物。
在另一方面，本發明涉及圓環病毒(CV)核酸分子，其包含(a)如SEQ ID NO 11所示的序列或其片段，和/或(b)根據(a)的核苷酸序列的互補物。所述核酸分子可以是DNA或RNA分子，其是單鏈或雙鏈的、環狀或線性的。在一些實施方式中，所述核酸分子可以這樣存在，或連接于另外的核酸分子，例如可操作地連接于異源表達控制序列。核酸分子也可以封裝于病毒衣殼中。本發明的核酸分子可以包含SEQ ID NO :1的完整序列和/或其互補物或其片段。同樣，本發明的核酸分子可以包含SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :11的完整序列和/或其互補物或其片段。所述片段優選包含如SEQ ID NO :1、7或11所示的至少15個、至少20個、至少25個、至少30個或至少50個連續核苷酸，或其互補物。優選地，本發明的CV核酸分子相對于相關的圓環病毒株、例如圖6中所不的GeneBank登記號的圓環病毒株具有至少一個 核苷酸的差異。本發明還涉及以下核酸分子(a)與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%的同一性；(b)在嚴格條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交；或(c) (a)或(b)的互補物。本發明還涉及以下核酸分子(a)與SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列具有至少90%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%的同一性；(b)在嚴格條件下與SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列雜交；或(c) (a)或(b)的互補物。本發明還涉及以下核酸分子(a)與SEQ ID NO :11所示的核苷酸序列具有至少90%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%的同一性；(b)在嚴格條件下與SEQ ID NO 11所示的核苷酸序列雜交；或(c) (a)或(b)的互補物。給定核酸分子與參考核酸分子(即，例如，SEQ ID NO 1或其片段)的同一性可通過如下確定I = n/Lxl00,其中I是以百分率表示的同一性，n是給定核酸分子與參考物的相同核苷酸的數目；和L是給定核酸分子與參考物的序列重疊的長度。優選地，在嚴格條件下雜交的意思是以IXSSC緩沖液和0. I % SDS在50°C、優選55°〇、更優選621、最優選68°C洗滌I小時之后，尤其是以0. 2XSSC和0. 1% SDS在50°C、優選55°C、更優選62°C、最優選68°C洗滌I小時之后，觀察到陽性雜交信號。雜交程序為，例如，公開于 Wahl 和 Berger (Methods Enzymol. 152 (1987), 399-407)以及 Kimmel (MethodsEnzymol. 152 (1987)，507-511)，其內容通過引用方式并入本文。本發明的另一方面涉及編碼圓環病毒多肽或其片段的CV核酸分子，其中所述核酸分子包含(a)如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列的區域(i)核苷酸 51-995 (Itep)(ii)核苷酸 1034-1735 (Cap)(iii)核苷酸 357-671 (0RF3);或(b)在遺傳密碼簡并性范圍內對應于(a)的序列的核苷酸序列 ；或(c)根據(a)或(b)的核苷酸序列的片段。本發明的另一方面涉及編碼圓環病毒多肽或其片段的CV核酸分子，其中所述核酸分子包含(a)如SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列的區域(i)核苷酸 51-995 (Itep)(ii)核苷酸 IOM-I735(Cap)(iii)核苷酸 357-671 (0RF3);或(b)在遺傳密碼簡并性范圍內對應于(a)的序列的核苷酸序列；或(c)根據(a)或(b)的核苷酸序列的片段。本發明的另一方面涉及編碼圓環病毒多肽或其片段的CV核酸分子，其中所述核酸分子包含(a)如SEQ ID NO 11所示的核苷酸序列的區域(i)核苷酸 51-995 (Itep)(ii)核苷酸 1033-1734(Cap)(iii)核苷酸 357-671 (0RF3);或(b)在遺傳密碼簡并性范圍內對應于(a)的序列的核苷酸序列；或(c)根據(a)或(b)的核苷酸序列的片段。優選地，核酸分子編碼選自下列的CV多肽R印(SEQ ID NO 2) >Cap (SEQ ID NO 3)和0RF3(SEQ ID NO :4)，或其片段。核酸分子還可以編碼選自下列的CV多肽R印(SEQ IDNOs 8 和 12)、Cap (SEQ ID NOs 9 和 13)和 0RF3 (SEQ ID NOs 10 和 14)，或其片段。上述CV多肽的片段可以例如包含如SEQ ID N0:2，3或4或SEQ ID NO :8_10或12-14所示氨基酸序列的至少6個、至少8個、至少10個、至少20個或至少30個連續氨基酸。另外，本發明涉及編碼與SEQ ID NO :2，3或4所示的氨基酸序列的任意項具有至少90 %、至少92 %、至少94 %、至少96 %、至少98 %或至少99 %同一性的多肽的核酸分子。另外，本發明涉及編碼與SEQ ID NO :8，9，10，12，13或14所示的氨基酸序列的任意項具有至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%同一性的多肽的核酸分子。給定多肽與參考多肽、例如SEQ ID NO :2，3或4之間的同一性程度可以根據上文就核酸分子所述的來確定。本發明的核酸分子可以可操作地連接于異源表達控制序列，例如允許在適當的宿主細胞中表達的表達控制序列。用于表達本發明的核酸序列的異源表達控制序列的實例，例如原核或真核的，包括哺乳動物表達控制序列，是本領域技術人員已知的，例如公開于Sambrook 等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Press,和 Ausubel 等人(1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley andSons，其內容通過引用方式并入本文。本發明還包括以如上文所述的核酸分子轉化或轉染的非人宿主細胞，例如原核或真核宿主細胞，例如酵母、昆蟲或哺乳動物宿主細胞。以核酸分子、例如位于載體例如病毒載體或質粒上的核酸分子轉化或轉染宿主細胞是本領域技術人員熟知的，描述于例如Sambrook等人(見上文)或Ausubel等人(見上文)。本發明的另一方面是由如上文所述的核酸分子編碼的圓環病毒(CV)多肽。CV多肽可以包含(a)選自下列的氨基酸序列⑴氨基酸序列SEQ ID NO 2 (Rep)，(ii)氨基酸序列 SEQ ID NO 3(Cap)，、(iii)氨基酸序列 SEQ ID NO 4(0RF3);或(b)其片段。本發明的另一方面是由如上文所述的核酸分子編碼的圓環病毒(CV)多肽。CV多肽可以包含(a)選自下列的氨基酸序列(i)氨基酸序列 SEQ ID NO 8 和 12 (Rep)，(ii)氨基酸序列 SEQ ID NO 9 和 13 (Cap)，(iii)氨基酸序列 SEQ ID NO 10 和 14(0RF3);或(b)其片段。本發明包括CV多肽或片段，所述片段包含如SEQ ID N0:2，3或4或SEQ ID NO:8-10或12-14所示氨基酸序列的至少6個、至少8個、至少10個、至少20個或至少30個連續氨基酸。優選地，本發明的CV多肽相對于相關的圓環病毒株、例如圖6中所示的GeneBank登記號的圓環病毒株具有至少一個氨基酸的差異。本發明還涉及與SEQ ID NO :2，3或4所示的氨基酸序列的任意項具有至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%同一性的多肽。本發明還涉及與SEQ ID NO :8，9，10，12，13或14所示的氨基酸序列的任意項具有至少90 %、至少92 %、至少94 %、至少96 %、至少98 %或至少99 %同一性的多肽。本發明的另一方面是針對如上文所述的多肽的抗體或此類抗體的抗原結合片段。產生抗體、例如多克隆或單克隆抗體的方法是本領域熟知的。例如,可以通過注射具有免疫原性的本發明的多肽免疫多種哺乳動物宿主，例如小鼠或兔子。如果需要，本發明的多肽可以偶聯于載體，例如鑰孔血藍蛋白(KLH)。可以通過熟知的方法從經免疫的宿主獲得多克隆抗體或產生抗體的細胞。可以通過已知的技術，例如B-細胞雜交瘤技術(KShler等人，Nature256 ;(1975)495-497)(其內容通過引用方式并入本文)或相關技術制備針對本發明的多肽的單克隆抗體。本發明還包括此類抗體的嵌合、人源化或人類抗體，或抗原結合片段，它們可通過已知技術獲得。本發明的另一方面是包含如上文所述的核酸分子的圓環病毒。所述病毒可以是活性病毒。備選地，所述病毒可以是滅活的病毒或減毒的病毒。可以按照下文的詳細描述進行滅活和減毒。本發明的核酸分子、多肽、病毒和抗體可用作診斷或藥物試劑，例如，用于診斷或預防和/或治療哺乳動物、特別是牛、更特別是小牛中的HD。在診斷性的實施方式中，核酸分子或多肽可以攜帶報告基團，例如任何適合用于診斷方法中的報告基團，例如熒光基團、發光基團、染料、酶、半抗原或生物素。特別地，對于診斷性實施方式，如本申請中使用的術語“核酸分子”還包括核酸類似物，例如肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)或本領域已知的其它類型的核酸類似物。因此，本發明的其它方面是包含如上文所述的核酸分子、多肽、病毒或抗體以及可接受的載體的診斷組合物。 診斷組合物可用于診斷HD、特別是牛中的HD的方法，其中，將來自待診斷的受試者的樣品與如上文所述的診斷組合物接觸，從而測定該樣品中CV的存在和/或數量，特別是PCV2-Ha08株、PCV2_Ha09株或PCV2_HalO株的存在和/或數量，或針對CV、特別是PCV2-Ha08株、PCV2_Ha09株或PCV2_HalO株的抗體的存在和/或數量。所述樣品可以是體液樣品，例如血液、血清、血漿、唾液、痰或淋巴液，或組織樣品，例如，來自肝、肺、骨髓或淋巴組織的樣品。在一個實施方式中，本發明的診斷方法可以包括在基于核酸的檢驗中測定CV核酸分子，所述檢驗可以涉及核酸雜交和擴增技術，例如PCR。另外，本發明的診斷方法包括在免疫檢驗中測定CV多肽，使用本發明的抗體作為診斷試劑并測定CV多肽與探測抗體的免疫復合物的存在。另一方面，本發明的診斷方法可以包括測定樣品中的抗-CV抗體，例如使用如上文所述的CV多肽作為探測抗原。本發明的另一實施方式是如上文所述的核酸分子、多肽、病毒和抗體用于治療性應用的用途，特別是用于治療和/或預防哺乳動物生物、特別是牛中的HD。因此，本發明還包括用于治療性用途的組合物，其包含如上文所述的核酸分子、多肽、抗體或病毒，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑。在優選實施方式中，組合物是疫苗或免疫原性組合物，例如，基于核酸的疫苗或免疫原性組合物，或基于多肽的疫苗或免疫原性組合物，或基于病毒的疫苗或免疫原性組合物，或基于抗體的疫苗。在特別優選的實施方式中，組合物是基于多肽的疫苗或免疫原性組合物，并包含能夠在受試者中引發免疫應答的CV多肽，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑。在另一個特別優選的實施方式中，組合物是基于病毒的疫苗或免疫原性組合物，并包含能夠在受試者中引發免疫應答的圓環病毒，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑。本發明還包括預防或治療HD、特別是哺乳動物受試者、例如牛中的HD的方法，其中向有此需要的受試者施用有效量的如上文所述的治療性組合物。對于治療性應用，核酸分子可以以下列形式使用基于核酸的疫苗或免疫原性組合物，或者核酸效應子分子、例如反義分子、或能夠RNA干擾的分子。本發明的多肽或病毒可用于治療性應用，用于制備如上文所述的基于多肽或基于病毒的疫苗或免疫原性組合物。抗體可用于治療性應用，用于治療已經存在的CV感染。發明詳述以下定義可適用于本發明的實施方式的描述中使用的術語。以下定義取代每篇通過引用方式并入本文的各個參考文獻中的任何矛盾定義。除非在本文中另有定義，否則本發明中使用的科學和技術術語將具有本領域普通技術人員通常理解的含義。此外，除非上下文需要，否則單數術語應包括復數，復數術語應包括單數。如本文使用的術語“佐劑”是指任何作為免疫應答的非特異性刺激物的物質。合適的佐劑包括但不限于RIBI佐劑系統(Ribi Inc.)，明礬氫氧化鋁凝膠，水包油乳劑，油包水乳劑，例如弗氏完全佐劑和不完全佐劑，嵌段共聚物(CytRx，AtlantaGa.), SAF-M(Chiron, Emeryville Calif.), AMPHIGEN 佐劑，離子多糖，阜苷，QuiI A, QS-21(Cambridge Biotech Inc. , Cambridge Mass.)，GPI-0100 (GalenicaPharmaceuticals, Inc. , Birming-ham, AL)或其它阜苷級份，Procision-A (包含 Quil A、AMPHIGEN 和膽固醇的混合物的佐劑)、單磷酰脂質A，阿夫立定脂質-胺佐劑，來自大腸桿菌的熱不穩定性腸毒素(重組的或其它方式)，霍亂毒素，或胞壁酰二肽，等本領域 技術人員所知的。提及“離子多糖”應理解為任何帶正電或負電的多糖或其衍生物或化學等同物。所述離子多糖可以是可溶或不可溶形式。優選地，所述離子多糖是離子葡聚糖。更優選地，所述離子葡聚糖是DEAE-葡聚糖，硫酸葡聚糖或QAE-葡聚糖。最優選地，所述離子葡聚糖是DEAE葡聚糖。優選地，所述離子葡聚糖的葡聚糖成分具有250，000至4，000，OOODa的分子量，更優選為 500, 000 至 I, 500，OOODa0皂苷的佐劑特性已長久為人所知，因為其具有增強針對免疫原的抗體效價的能力。如本文使用的術語“皂苷”是指一組植物來源的表面活性的糖苷，其由與留類或三萜類結構的疏水性區域結合的親水性區域(通常是數個糖鏈)組成。皂苷可從多個不同來源獲得，已經從南美樹木阜樹(Quillaja saponaria) (Molina)中得到了具有有用的佐劑活性的皂苷。來自該來源的皂苷被用于分離“均一的”級份，該級份被稱作"Quil A" (Dalsgaard,1974)。劑量-位點反應性是在疫苗制備物中使用Quil A用于獸用和人類的一個主要考慮。避免Quil A的這種毒性的一種方式是使用免疫刺激復合物(稱作Iscoms ，ImmunoStimulating COMplexes的縮寫)。這是主要的，因為當摻入到免疫刺激復合物中時，QuilA的反應活性沒那么高，因為其與復合物中的膽固醇的結合降低了其與細胞膜中的膽固醇結合的能力，因此降低了其細胞裂解效應。另外，產生相似水平的佐劑效應所需的Quil A的量較少。已經在多個公開物中描述了 Quil A皂苷的免疫調節性質和當把它們摻入免疫刺激復合物時將會從這些皂苷產生的額外益處，例如Cox和Coulter，1992 (Cox，J. C. and Coulter, A. R. , “Advances in Adjuvant Technology and Application，，，見Animal Parasite Control Utilizing Biotechnology,第 4 章，編者Yong, ff. K. , CRCPress (1992)) ；Dalsgaard, 1974 ；Morein 等人，澳大利亞專利說明書號 558258、589915、590904 和 632067。本發明情境下有用的佐劑和添加劑的數量和濃度可由技術人員容易地確定。在一個實施方式中，本發明涉及包含大約50 ii g至大約2000 ii g佐劑的免疫原性組合物和疫苗。在另一個實施方式中，所包括的佐劑的量是大約IOOii g至大約1500ii g，或大約250ii g至大約IOOOiI g，或大約350i! g至大約750 i! g。在另一個實施方式中，包括的佐劑的量是大約500 u g/2ml劑量的免疫原性組合物或疫苗。如本文使用的術語“氨基酸”是指天然產生的和合成的氨基酸，以及按照類似于天然產生的氨基酸發揮作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然產生的氨基酸是那些由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及那些后來被修飾的氨基酸，例如，羥基脯氨酸、羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸。20種常規氨基酸的立體異構體(例如，D-氨基酸)，非天然氨基酸，例如a和a-雙取代的氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸和其它非常規氨基酸也可以是本發明的多肽的合適的成分。非常規氨基酸的實例包括4_羥基脯氨酸、Y -羧基谷氨酸、e -N, N，N-三甲基賴氨酸、e -N-乙酰基賴氨酸、0-磷酸絲氨酸、N-乙酰基絲氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、O -N-甲基精氨酸，和其它類似的氨基酸和亞氨基酸。氨基酸類似物是指具有與天然產生的氨基酸相同的基本化學結構(即，與氫、羧基、氨基和R基團結合的碳)的化合物。示例性的氨基酸類似物包括，例如，高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜和甲硫氨酸甲基锍。此類類似物具有修飾的R基團(例如正亮氨酸) 或修飾的肽骨架，但是保持與天然產生的氨基酸基本上相同的化學結構。氨基酸模擬物是指具有不同于氨基酸的一般化學結構的結構、但是按照類似于天然產生的氨基酸的方式發揮作用的化學化合物。在本文中可以通過它們通常已知的三字符或IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的單字符來指稱氨基酸。如本文使用的術語“抗體”是指能夠通過識別表位的方式結合抗原的免疫球蛋白分子。抗體可以是多克隆的混合物或單克隆的。抗體可以是來自天然來源或來自重組來源的完整免疫球蛋白，或者可以是完整免疫球蛋白的免疫反應活性部分。抗體可以以多種形式存在，包括，例如，Fv, Fab’，F(ab’)2，以及單鏈。如本文使用的術語“抗原”是指包含一個或多個表位(線性、構象或二者)的分子，其在暴露于受試者之后將誘導特異于該抗原的免疫應答。如本文使用的術語“抗原”可以指減毒的、滅活的或修飾的活體細菌、病毒、真菌、寄生蟲或其它微生物。如本文使用的術語“抗原”還可以指亞基抗原，其相對于與抗原天然結合的整個生物體是分離的和離散的。如本文使用的術語“抗原”還可以指抗體，例如抗獨特型抗體或其片段，以及指合成的肽模擬位，其可以模擬抗原或抗原決定簇(表位)。如本文使用的術語“抗原”還可以指在體內表達抗原或抗原決定簇的寡核苷酸或多核苷酸，例如在DNA免疫應用中的那些。在用于疫苗中之前，本發明的圓環病毒可以是“減毒的”或“滅活的”。減毒和滅活的方法是本領域技術人員熟知的。減毒方法包括但不限于在合適的細胞系的細胞培養物中連續傳代，紫外光輻射，和化學誘變。滅活方法包括但不限于使用福爾馬林、P -丙內酯(BPL)或二乙烯亞胺(BEI)處理，或本領域技術人員已知的其它方法。通過福爾馬林滅活可以這樣進行將病毒懸浮液與37%的甲醛混合至甲醛的最終濃度為0. 05%。通過在室溫恒定攪拌大約24小時而混合病毒-甲醛混合物。然后通過檢驗在適當的細胞系中的生長而就殘余活體病毒測試滅活的病毒混合物。通過BEI滅活可以這樣進行將本發明的病毒懸浮液與0. IM BEI (2-溴代-乙胺，在0. 175N NaOH中)混合至BEI的最終濃度為ImM。通過在室溫恒定攪拌大約48小時而混合病毒-BEI混合物，然后加入I. OM硫代硫酸鈉至0. ImM的終濃度。再繼續混合2小時。通過通過檢驗在適當的細胞系中的生長而就殘余活體病毒測試滅活的病毒混合物。如本文使用的術語“細胞系”或“宿主細胞”意思是病毒在其中可復制和/或被維持的原核或真核細胞。如本文使用的術語“免疫原性組合物”意思是能夠在受試者中誘導免疫應答或抗原性應答的組合物。如本文使用的術語“藥學上可接受的載體”是指這樣的物質在合理的醫學判斷范圍內，適合用于與人或動物的組織接觸而無不適毒性、刺激、變應性應答等，與合理的收益/風險比相稱，并對于它們的意欲用途有效。本發明的疫苗可以包括一種或多種藥學上可接受的載體，例如所有的溶劑、分散介質、包衣、佐劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑、吸收延遲劑等。稀釋劑可以包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等滲劑可以包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖，等本領域技術人員已知的。穩定劑包括白蛋白等本領域技術人員已知的。防腐劑包括硫柳汞等本領域技術人員已知的。如本文使用的術語“多核苷酸或核酸分子”意思是由鏈中共價結合的核苷酸單體組成的有機聚合物分子。DNA(脫氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是具有不同生物功能的多核苷酸的實例。如本文使用的術語“預防”意思是抑制微生物的復制、抑制微生物的傳播或抑制微生物在其宿主中建立其自身。如本文使用的該術語也可意指抑制或阻斷一個或多個感染跡象或癥狀。如本文使用的術語“治療劑”意思是在其所施用至的受試者中引起免疫應答的微生物(或其部分)或亞基抗原或多肽或多核苷酸分子，以及它們的組合。所述免疫應答可以包括但不限于細胞和/或體液免疫力的誘導。如本文使用的術語“治療”意思是減少或消除微生物引起的感染。如本文使用的該術語也可意指減少微生物的復制、減少微生物的傳播或降低微生物在其宿主中建立其自身的能力。如本文使用的該術語還可以意指減少、緩解或消除微生物引起的感染的一個或多個跡象或癥狀，或加速從微生物引發的感染的復原。如本文使用的術語“疫苗”和“疫苗組合物”意思是預防或減少感染、或預防或減少感染的一個或多個跡象或癥狀的組合物。疫苗組合物針對病原體的保護性效應通常是通過在受試者中誘導免疫應答(細胞介導的或體液免疫應答或二者的組合)而實現。一般而言，感染的消除或降低的發生率，跡象或癥狀的緩解，或微生物從被感染的受試者的加速的消除，是疫苗組合物的保護性效應的指示。本發明的疫苗組合物提供針對圓環病毒(CV)引起的感染的保護性效應。提供了以下描述的附圖和實施例以輔助本領域技術人員實施本發明。雖然如此，這些描述不應被解釋為不恰當地限制本發明，因為本領域普通技術人員可以不脫離本發明的精神或范圍而對本文討論的實施方式進行修飾和改變。



圖I.患病小牛中的出血位置。A :頭部皮膚中的病灶性急性出血。干燥后的血液使小束毛發粘在一起。B :下唇和牙齦的粘膜中的瘀點性和瘀斑性出血。C :除了與注射位點和耳朵打標記相關的出血之外，無創傷性皮膚損傷的跡象。D :小腸和大腸的腸系膜中的中度病灶性出血。小腸的節段性暗紅色變色是由于嚴重的管腔內的出血。E :腕骨的皮下組織。在骨突出物和身體的力學緊張部分最常見到皮下出血。圖2.在患有全血細胞減少癥和出血性疾病(BNP)的小牛中的額外發現的頻率。一些動物顯示出數個額外損傷。經常發現不同器官的炎癥，但是所研究的動物中有30%不具有另外的損傷。GIT:胃腸道。圖3.脫鈣、HE染色之后骨髓(胸骨)的組織學研究，放大倍數100。A :具有造血組織、包括數個巨核細胞(箭頭)的3周齡小牛的正常骨髓。B :嚴重損失了造血組織的受影響的小牛的骨髓。僅保留了間質成纖維細胞和脂肪細胞。圖4.來自患有出血性疾病的小牛的樣品中的圓環病毒DNA的檢測。使用提取自小牛的骨髓(泳道3、5、9-12)、血液(泳道4和8)、肝(泳道6)或腎(泳道7)的DNA進行巢式寬譜PCR，在泳道上標示了數字。Neg :陰性分離對照；p0s :陽性PCR對照；M :分子量標記物，在左側以bp標示了大小。在溴化乙啶染色的瓊脂糖凝膠中分離了大小為約350bp的、次級PCR產物。圖5.用于檢測PCV2-特異性抗原的免疫組織化學，胸骨，I號小牛。單一骨髓細胞顯示出輕微至中度的細粒細胞質染色。比例尺100iim。圖6.在具有2型豬圓環病毒株的德國小牛中檢測到的圓環病毒PCV2_Ha08的系統發生關系。基于參考株PCV2a、PCV2b和PCV2c (黑體)、加拿大牛圓環病毒(BCV)和通過BLAST搜索發現的與PCV2-Ha08最密切相關的10種圓環病毒的完整核苷酸序列建立系統發生樹。以箭頭標示了 PCV2-Ha08。在括號中顯示了序列的GenBank登記號。該樹以核苷酸替換單兀(nucleotide substitution units)定標。圖7.根據未公布的Gen Bank條目登記號FJ804417的PCV-2株Ha08的核苷酸和
氨基酸序列。圖8.根據未公布的Gen Bank條目登記號HQ231329的PCV-2株Ha09的核苷酸和
氨基酸序列。圖9.根據未公布的Gen Bank條目登記號HQ231328的PCV-2株HalO的核苷酸和
氨基酸序列。圖10.在原型物種非依賴性PCV2酶聯免疫吸附檢驗(ELISA)中分析血清。實線代表豬PCV2陰性血清，虛線代表豬PCV2陽性血清，點線代表牛BNP血清。
實施例材料和方法病史在2007年10月至2009年5月期間，對56頭具有出血性疾病的小牛(產自德國巴伐利亞的45頭奶牛)進行尸檢。就年齡、性別和品種縱覽醫學記錄。詢問主人關于小牛的既往疾病和既往的醫學處理、小牛飼養、飼料被霉菌或羊齒植物污染以及殺嚙齒動物藥的使用情況。根據表I對HDS (BNP)病例和對照組動物編號。對照組動物如文本中所指定。包括了由于出血性疾病之外的原因而被送去進行病理學檢查的8頭小牛作為圓環病毒特異性PCR的對照；它們被列舉于表I中。I號對照屬于與患出血性疾病的兩個病例(11和15號)相同的家畜，于出生后不久由于不明原因死亡。在該例中沒有可檢出的感染性試劑。對照組中包括的7頭小牛(由于它們年齡的緣故)患有嚴重的多關節炎或嚴重的腸炎，在出生后I個月內死亡。對照組動物均未顯示任何骨髓消減的跡象。組織病理學所有動物均進行尸檢，收集標準系列組織，包括股骨和胸骨的骨髓、肺、肝、腎、脾和淋巴結，以進行組織病理學檢查。根據需要，根據其它病理學發現收集另外的樣品。器官組織的樣品固定于10%緩沖的福爾馬林。胸骨骨髓樣品在OssaFixona (Waldeck,Miinster, Germany)中進行過夜脫I丐。就石臘包埋進行處理之后，切取4 y m厚的切片并以蘇木精和曙紅01E)染色。免疫組織化學
在封片于Superfrost Plus載玻片上的4mm切片上進行免疫組織化學檢查(IHC)。將針對 PCV2 的 VP2 蛋白(0RF2)的小鼠單克隆抗體 36A9 (Ingenasa, Madrid, Spain)應用于2頭受影響的小牛的骨髓、脾和淋巴結的組織切片。在收集自確認具有PCV2感染(基于免疫組化和PCR分析)的豬的淋巴結和派爾斑(Payers Patch)的切片上在每次運行中檢測抗體的反應活性。染色前處理包括二甲苯洗滌以使切片去石蠟化和連續乙醇洗滌以復水化，然后以3%過氧化氫處理以猝滅內源性組織過氧化物酶活性。根據生產商的說明書，使用Hist0stam -PlusBulkKit和色原試劑AEC Single Solution(Invitrogen ,Camarillo, CA, USA)進行染色。最后，以Mayer的蘇木精對切片進行對比染色。被分類為PCV2陽性的玻片顯示出胞質內的顆粒式樣的亮紅色信號。血液病學從5個病例(2和53-56號)可獲得EDTA血液樣品，在收集后48小時內進行血液分析。使用CELL-DYN 3500 (Abbott, Wiesbaden, Germany)設備進行全血計數,包括白細胞計數、血小板計數、血紅蛋白水平和紅細胞參數。使用顯微鏡方法測定血球計數器玻片上的血小板數目。毒理學就特定毒素測定以下樣品使用特定方法分析21和22號病例的尿液和血液樣品，以檢測二氯乙烯基半胱氨酸(DCVC)及其代謝物。使用氣相色譜-質譜(GC-MS)方法檢測25號病例的尿液樣品和8號病例的腎組織中的揮發性有機化合物、香豆素衍生物和化療藥物，例如磺酰胺。使用GC-MS方法和高效液相色譜(HPLC)方法測定3個病例(23、34和36號)的尿液和肝樣品中的藥物。從具有2例受影響病例(I號和2號小牛)的農場收集飼料樣品(青貯飼料、枯草、大豆萃取粉和稻草)。稻草樣品是可疑的，因為變灰色和生霉的味道。就黃曲霉毒素BI和葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)的毒素進行真菌毒理學研究以及細胞毒性檢驗。使用最近發表的LC-MS/MS分析法(Gottschalk等人，2008)嘗試證明真菌毒素(煙曲致震顫毒素C、Verrucologen、黃曲霉毒素BI、夫馬潔林、膠霉毒素、Verrucarol NH4+、脫氧瓜萎鐮菌醇、瓜萎鐮菌醇、玉米赤霉烯酮、黑葡萄穗霉毒素G、黑葡萄穗霉毒素H、疣孢菌素A、桿孢菌素A、桿孢菌素L、黑葡萄穗霉毒素F和疣孢菌素J)的存在。根據Reubel等人(1987)的方法進行細胞毒性(MTT)檢驗。微生物培養就細菌的存在情況檢查本研究和對照組中的所有動物的標準器官組(肺、肝、脾、腎和小腸)以及另外的樣品(取決于病理學發現)。通過接種含有5%去纖維的綿羊血液的哥倫比亞血瓊脂和Water-blue-metachrome-yellow lactose agar來研究每個樣品。使用腦心浸出液瓊脂和巧克力瓊脂檢測肺中的微需氧微生物。對于厭氧檢測，使用Zeissler瓊脂。在緩沖的蛋白胨水和木糖賴氨酸去氧膽酸鹽瓊脂中預富集之后，在Rappaport-Vassilioadis培養基中分離沙門氏菌屬。病毒學根據生產商的說明書，使用診斷試劑盒(Bio-X Diagnostics, Jemelle,Belgium),通過直接免疫熒光法，就BVDV的存在檢測所有受影響的動物的腎和甲狀腺組織。為了分離 BVDV,將單層牛 KOP-R 細胞(RIE 244, CCLV Federal Research Centre for VirusDiseases of Animals, Island of Riems, Germany)接種器官勻衆物。每日篩選細胞的細胞病變方面的變化。在第二次細胞培養物傳代之后，按照描述的方法通過直接免疫熒光檢驗法檢測細胞并通過間接ELISA法檢測BVDV特異性抗原(SERELISA BVD p80 Ag MonoIndirect, Synbiotics, Lyon,France)。為了顯不BVDV特異性核苷酸序列，使用 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)從組織樣品分離RNA,根據生產商的說明書使用商售的實時RT-PCR 程序(Virotype BVDV Kit ；Labor Diagnostik Leipzig, Leipzig, Germany)。為了檢測BTV特異性序列，使用分離自所有受影響小牛的脾組織的RNA進行實時RT-PCR程序，覆蓋所有24個BTV血清型(Toussaint等人，2007)。在研究組中的總共56頭小牛中，隨機選擇25頭(病例號1，2，4-13，15-22, 31，34，41,42,45)以檢測哺乳動物和禽類圓環病毒，包括PCV2 ;也研究了對照組中的所有小牛(稱作對照I號、對照2號等)。使用高純PCR模板制備試劑盒(Roche,Mannheim, Germany)從組織、包括血液、骨髓、脾、胸腺、腎和肝提取DNA，并根據最近的描述(Halami等人，2008)進行巢式寬譜PCR程序。根據Bogner等人(2005)進行另外的PCR程序，其常規被用于PCV2的特異性檢測。在PCR分析過程中要小心以排除實驗室DNA污染。使用不同組的移液搶和專用過濾槍頭在另外的房間進行DNA分離、PCR標準混合物的制備和PCR產物的分析。使用陰性對照試劑和陰性DNA分離對照就污染情況篩選每組反應。在進行本研究之前，該實驗室從未用于PCV2感染的常規PCR診斷。圓環病毒全基因組的擴增使用一對反向引物(inverseprimer) (5 ' -AGC TCC ACA CTC GATCAGTAAG-3' (SEQ ID NO :5)和 5' -CCT AGA TCT CAG GGA CAACGG AG-3' (SEQ ID NO :6))通過PCR擴增所檢測的圓環病毒的完整基因組，所述引物是根據巢式寬譜PCR擴增的序列設計的。使用高保真PCR酶混合物(Fermentas, St. Leon-Rot, Germany),使用下列循環條件進行擴增首先在95°C變性5分鐘，然后是35個循環的“95°C，30sec ；58°C,30sec和70°C，4分鐘”，最后在70°C延伸10分鐘。DNA測序和系譜分析。使用GeneJET. PCR CloningKit (Fermentas, St. Leon-Rot,Germany)克隆 PCR 產物。使用引物 pjetl forward 和 pJetIreverse (Fermentas, St. Leon-Roth, Germany)或特異性引物在 ABI Prism 裝置(AppliedBiosystems)中對質粒的插入物進行測序。使用Lasergene DNASTAR軟件包(DNASTAR,Inc. , Madison, WI, USA)里的EditSeq模塊從序列片段重新裝配所檢測的圓環病毒的完整基因組序列，然后存于GenBank數據庫中，登記號為FJ804417。使用BLAST 2. 2. 14檢索設施進行序列相似性檢索。使用CLUSTAL W方法(Thompson等人，1994)，使用上述的軟件包中的MegAlign模塊進行序列比對和系統發生樹的構建。株的命名和GenBank登記號顯示于圖6中。系譜分析通過它們的耳朵標記鑒定并追蹤所有的小牛及其雙親。從用于德國和奧地利的聯合繁殖評價的系譜構建所有病例的系譜。使用Pedigraph TM軟件進行系譜的圖形化呈現，鑒定出現一次以上的父系。
結果所檢查的小牛有86%是西門塔爾牛(n = 48)，4%是荷蘭乳牛(n = 2)，11%是混合或未知品種(n = 6)。死亡時的年齡是7-32天(平均為17天)。85%的小牛在生命的第2至第3周發病。雄性和雌性小牛以相同比例受影響。臨床病史的回顧分析揭示小牛在出生時和出生后第一天是健康的。牛的主人和主診獸醫報告有自發性的經皮膚的出血，在數個粘膜表面無任何明顯損傷和出血，以及與創傷或標準管理程序例如耳朵打標記或感染相關的過量出血。有的時候，記錄另外的跡象，例如發燒、腹瀉或呼吸困難。似乎僅在無規律的間隔在農場的單只或幾只小牛中出現出血。醫學治療是不成功的。多數小牛在數天內死亡(n = 50)或者由于血液損失而需要被實施安樂死(n = 6)。所有的小牛在出生后第一天皆接受初乳。然后，多數農場主以來自他們自己的母牛的全奶喂養。一般地，保持小牛不被處理，直至出現出血的第一個跡象。一些小牛接受預防性藥物，或者由于急性腹瀉，以針對隱孢子蟲的鹵夫酮處理一些小牛。由于在德國羊齒植物僅在低程度上是牧草的成分，所以尚未報道由于羊齒植物污染而造成的任何問題。在農場上使用了殺嚙齒動物藥，但是牛的主人排除了母牛或小牛攝取它們的可能性。僅有一位農場主提到由于生霉的飼料而引起的牛中的健康問題。系譜分析構建了所有小牛的系譜。小牛的家系是各不相同的，未指示疾病的單基因(隱性或顯性)遺傳誘因。雖然一些父系被描述了數次，但小牛的數目太少，以致無法從此分析獲得有意義的結果。總病理學在尸檢時，研究組中的56頭小牛的獸體處于良好的營養狀態，體重為38_72kg，取決于年齡(平均為53kg)。在多數動物中，皺胃含有凝固的牛奶，在瘤胃中發現一些稻草。沒有跡象表明攝取了有毒植物，例如羊齒植物。所有56個病例中的主要的病理形態學發現是在多個器官和組織中有嚴重急性出血。88%的動物顯示出皮膚和皮下組織中的多病灶瘀點性至瘀斑性出血。在一些具有嚴重黑糞癥的病例中，在胃腸道的漿膜和粘膜表面上的出血出現得非常頻繁(98%)。此外，心臟、腦膜和骨骼肌中的出血是常見的(多達84%)。在圖I中顯示了出血的實例。長骨和胸骨的骨髓是淡紅色。取決于出血的持續時間和強度，獸體出現貧血。炎性損傷是另外的散發性發現。最經常觀察到的是纖維性或化膿性肺炎(合計27% )和口腔中的病灶性潰瘍性至壞死性炎癥(合計11% )。另外的病理學和組織學發現列舉于圖2。組織病理學主要的組織病理學發現是在56只動物中的每一個的骨髓中有造血組織的明顯的低細胞至無細胞性(圖3)。所有的造血譜系均以相同方式受影響。在一些病例中，仍然保持造血組織的一些島狀物。在這些位置偶然有前體細胞的病灶性退化和調亡。間質細胞之間的空間是充血的或填充有勻質嗜曙紅性物質，或者造血組織被脂肪組織代替。56個病例中僅有5例(9%)顯示出髓外造血跡象。出血位點未顯示出另外的變化，這將解釋由于之前的組織損傷、例如脈管炎、炎性反應或組織破裂而造成的出血傾向。在43%的病例中(n = 24)，隨著淋巴樣濾泡中的調亡淋巴細胞數目的增加或具有小濾泡的脾和淋巴結的低細胞性，淋巴組織中的損傷變得明顯。這些變化總結為淋巴細胞消減型(lymphocyticdepletion)。偶然的和不常見的發現是在淋巴組織中存在極少的多核巨大細胞(n = 2)。口腔的一些潰瘍性損傷中的細胞炎性反應主要由單核細胞與極少嗜中性粒細胞組成。同樣，在纖維性肺炎的一些病例中，炎性滲出物由大量的纖維蛋白與極少嗜中性粒細胞組成。另外的組織學發現也列舉于圖2中。沒有黃疸或溶血的跡象。在造血或淋巴組織中沒有見到包涵體。血液病學 從5個病例(2、53_56號)可獲得EDTA血液。在所有5個病例中，血液分析揭示出嚴重的血小板減少癥(12. 5-82x103細胞/iil)、中度至嚴重的白細胞減少(285-1. 470細胞/ul)和中度的相對淋巴細胞增多(68-96%)。另外，這些病例中的4例顯示出明顯的嗜中性粒細胞減少(粒細胞減少，1-4% )。3個病例為貧血。2個病例的血細胞比容仍然介于生理限值。詳細的血液學結果顯示于表2。毒理學病例號8和25的尿和腎組織的毒理學篩選未顯示沒有諸如三氯乙烯、抗凝劑或磺胺的物質的攝取的跡象。使用HPLC方法在病例號23、34和36的尿和肝樣品中未檢出抗生素呋喃唑酮。然而，在病例號23和34中發現了安乃近(metamizol),在病例號36中發現了磺胺二甲嘧啶與甲氧芐啶的組合。分析這些結果是死亡前短時間內的藥物施用造成的。另外，使用檢測DCVC及其代謝物N-乙酰基-DCVC的特定方法分析收集自2個病例的尿和血液樣品產生了陰性結果。收集自一個農場的稻草的狀況提示可能有霉菌污染。然而，未檢測到真菌毒素。細胞毒性檢驗也顯示出陰性結果。微生物培養物就潛在的致病細菌的存在測試了所有患出血疾病的小牛病例。在一些病例中，檢測到一種以上的試劑。在腸和其它器官中最常檢測到的是大腸桿菌(n = 29)，其次是產氣莢膜梭菌(C. perfringens) (n = 14)。在少數病例中發現多殺巴氏桿菌(P. multocida)(n = 3)和綠膿桿菌(P. aeruginosa) (n = 3)。僅在一只動物中發現溶血性曼氏桿菌(M. haemolytica)、假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)、葡萄球菌屬(Staphylococci)、諾卡氏菌屬(Nocardia spp.)和腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)(每個都是n = 1)。在16個病例中未檢測到細菌病原體。26例具有出血性疾病的小牛顯示出另外的炎性損傷(圖2)。最經常觀察到的是肺炎(n = 15)。在9個病例的肺組織中分離了大腸桿菌。在I個病例的肺組織中檢測到多殺巴氏桿菌(P. multocida)和綠膿桿菌(P. aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(S. aureus)和S. uberis,或諾卡氏菌屬(Nocardia spp.)。在其它3例具有肺炎的肺組織中，未分離到病原體。在3個病例中診斷出由于大腸桿菌(n = 2)和產氣莢膜梭菌(n = I)感染造成的腸炎。病毒學就BVDV和BTV測試了所有具有出血性疾病的動物。對于這些病毒試劑未顯示出病毒抗原或病毒基因組的存在(數據未顯示)。使用具有圓環病毒基因組的ORF-Vl中的結合位點的引物，通過巢式寬譜？0 ，就圓環病毒DNA的存在研究了從25個病例(第1，2，4-13，15-22，31，34，41，42，45號)收集的器官組織。在測定為陽性的樣品中，瓊脂糖凝膠電泳揭示了具有預期長度大約350bp的帶。圖4顯示了 2號病例的陰性骨髓樣品(泳道3)，當分析血液時，形成了具有預期大小的強烈的帶(泳道4)。 在4號病例中，骨髓、肝、腎和血液是陽性的(泳道5-8)。當研究收集自其它小牛的樣品時，檢測到了較弱的帶(泳道9、10和12);其它的保持為陰性(泳道11)。總計，研究組的25個病例中的5例(第2，4，5，717號)和8個對照中的I例在圓環病毒PCR中經測定為陽性。測序了 3個樣品的PCR產物(小牛編號2，4和17)，當與GenBank數據庫中存在的PCV2的核苷酸序列比較時，獲得了 99%的同一性。在所研究的25個樣品中，在圓環病毒特異性PCR中測定為陽性的5例樣品以及從測定為陰性的樣品中隨機選擇的4例被送往另一個實驗室；常規使用的PCV2特異性PCR程序揭示所有病例均為陰性結果(數據未顯示)。PCV2_Ha08株的全基因組序列分析基于PCR產物的序列，產生了反向引物，其能夠擴增存在于4號病例(以骨髓、肝、腎和血液測定為陽性)的樣品中的完整的圓環病毒基因組。這個株被稱作PCV2-Ha08并進行了完整測序。PCV2-Ha08基因組的長度為1768個核苷酸。序列分析揭示出與PCV2 Rep和衣殼蛋白以及與0RF3的產物具有相似性的3個0RF。在非編碼區I (NCRl)中存在莖環結構,大小為Ilbp并包含保守性九聚體的序列。PCV2_Ha08基因組序列與GenBank數據庫序列的序列相似性搜索揭示出與PCV2分離體DK558control (EF565365)(源自丹麥的一頭豬)的最高程度的同一性(99% )。推導的R印、Cap和0RF3產物的氨基酸序列與所選擇的豬和牛圓環病毒的比較揭示出68. 5%至100%的同一性(表3)。在所有的病例中，PCV2-Ha08與PCV2b株密切相關并顯示出與分離體DK558control (EF565365)的最高百分率的同一性。使用PCV2_Ha08、牛圓環病毒(AF109397)、10種具有最高序列相似性的圓環病毒(通過BLAST檢索確定)和3個確定PCV2a、PCV2b和PCV2c亞型的參考株(Segales等人，2008)的全基因組序列進行了系統發生分析。如系統發生樹所示(圖6)，PCV2-Ha08在PCV2b亞型內明顯地簇集；然而，其在該組內形成單獨的分支。與此相反，牛圓環病毒(AF109397)，其之前被描述為感染加拿大的小牛，與PCV2a —起簇集。在圖7和序列表中顯示了 PCV2_Ha08的3個開放閱讀框的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO :1，2，3 和 4)。PCV2-Ha09 和 PCV2_HalO 的分離根據上文描述的程序(見“圓環病毒全基因組的擴增”部分)獲得了另外兩個分離體。
從死于牛新生兒全血細胞減少癥(BNP)癥狀的來自巴伐利亞的小牛的血液獲得的分離體被稱作PCV2-Ha09，并被完整測序。與PCV2_Ha08株相似，PCV2_Ha09基因組具有1768個核苷酸的長度并包含與PCV2-R印和衣殼蛋白以及與0RF3的產物具有相似性的3個ORF。也是死于BNP的來自Saxonia的小牛的肺和腦的分離體被稱作PCV2_HalO，并被完整測序。PCV2-HalO基因組具有1767個核苷酸的長度，與PCV2_Ha08和PCV2_Ha09 —樣，包含與PCV2-Rep和衣殼蛋白以及與0RF3的產物具有相似性的3個0RF。PCV2-Ha09和PCV-HalO的核苷酸序列以及PCV2_Ha09與PCV-HalO各自的3個開放閱讀框的氨基酸序列顯示于圖8和9以及序列表中(PCV2-Ha09 SEQ ID NOs. 7，8，9和10 ；PCV2-HalO SEQ ID NOs. 11，12，13 和 14)。免疫組織化學
(IHC)，以檢測PCV2抗原。I號病例的僅單一骨髓細胞顯示出輕微的免疫反應活性(圖5)。3號病例的所有組織和I號病例的淋巴組織對于PCV2抗原是陰性的。牛中的PCV2特異性抗體的檢測通過聚合酶鏈式反應(PCR)對于受牛新生兒全血細胞減少癥(BNP)影響的小牛中的PCV2的檢測提出了關于其在BNP病理發生中的作用的問題。如果PCV2是BNP的病理發生中的主要參與者，則人們應該能夠在受影響的獸群中檢測到PCV2特異性抗體應答。我們嘗試了通過競爭性方法檢測牛中的PCV2特異性抗體將以PCV2-0RF2-抗原包被的ELISA平板與PBS中的血清稀釋物(1/2，1/20，1/200，1/2000,1/20000)在37°C在濕室中溫育90分鐘。以PBS潤洗測試板3次。在PBS中按1/500稀釋綴合于辣根過氧化物酶的抗-PCV2單克隆抗體(mab)，并加入至測試板中。在濕室中在37°C再溫育90分鐘。以PBS潤洗測試板之后，加入底物(TMB/H202)。通過加AH2SO4終止顯色，在450nm測定光密度(OD)。作為參照，包括了兩個商業化試劑盒(Synbiotics, Ingenasa)的陽性對照。不含血清的孔(PBS)作為陰性對照。其中包括了 2例PCV2陰性豬仔的血清、5例PCV2陽性豬仔的血清和3例來自受BNP影響的獸群的牛的血清。結果總結于圖10。從1/20的稀釋度開始，PCV2陰性和陽性的豬血清被清楚地分辨。來自受BNP影響的獸群的3例牛血清以劑量依賴性方式抑制PCV2特異性mab的結合。雖然沒有觀察到如豬血清那樣的完全抑制，但是抑制超過了陽性對照物(例如Ingenasa PC OD = 0. 343)。這些數據高度指明了牛中的PCV2特異性免疫應答。討論在此，我們描述了小牛的出血性疾病(HD，也稱作出血性疾病綜合征(HDS)和牛新生兒全血細胞減少癥(BNP))，其可通過以下臨床、病理和組織學標準與其它出血區別開最顯著的臨床跡象是自發性經皮膚的出血而無明顯損傷，粘膜表面的出血和與標準管理程序相關的過量出血。與此一致，出血性疾病在幼牛出生的頭一個月內顯現。在所有病例中發現嚴重的骨髓低常增生(hypoplasia)，以至再生障礙(aplasia)。血液學結果在這些動物中的5只中表明了再生障礙性全血細胞減少癥，這支持上述發現。由此造成的血小板減少癥引起的出血性疾病被認為代表了疾病的主要致病機理。此外，血液學結果揭示了中度至嚴重的白細胞減少和粒細胞減少。該發現與所有動物中觀察到的嚴重的骨髓枯竭和43%動物中的淋巴組織消減是一致的。推測增殖性淋巴細胞的缺乏引起了免疫抑制。這可以解釋損傷的頻發，例如肺炎和潰瘍性口炎以及這些損傷中的一些中的炎性細胞的缺乏。在骨髓破壞之后，臨床跡象的出現將很大程度上取決于血液細胞、尤其是血小板在循環中的半衰期。由于牛紅細胞的壽命長，為120天，貧血不那么顯著，除非并發出血(Loesch等人，2000，Valli，2007)。血小板的壽命僅有9天，嗜中性粒細胞在循環中的半衰期僅8_9h，更短(Paape等人，2003，Valli, 2007)。考慮到這些因素，我們假設破壞性損傷可能發生于新生小牛中。為了檢測HD的病因學，研究了牛中的由于血小板減少造成的出血的數個誘因。在西門塔爾牛中描述了遺傳性出血性體質，其被稱作西門塔爾遺傳性血小板病。其是由血小板的顯著功能失調引起的(Steficek等人，1993)。在多數病例中西門塔爾牛受到影響，但是兩頭荷蘭乳牛顯示出等同的損傷。在德國南部，西門塔爾牛是最常見的品種，因此，在本研究中可能過度表現。不同品種中該疾病的不同的臨床表現和系統發生分析結果表明沒有常染色體顯性或隱性遺傳病。然而，該研究中的動物數目目前不足以達到確定性結論。、
由于血小板減少，非細胞病變2型BVDV感染可能導致嚴重的出血傾向(Ellis等人，1998，Rebhun等人，1989)。目前認為骨髓的成熟庫的減少、循環的血小板數目的減少和改變的血小板功能造成出血(Ellis等人，1998，Walz等人，2001，Wood等人，2004)。然而，骨髓細胞構成在BVDV感染中不減少。與此相反，在本研究中報告的病例中持續發現嚴重的骨髓消減。此外，在所研究的任何小牛中未檢測到BVDV。根據這一點，似乎可合理排除BVDV感染。已知數種毒素和真菌毒素在牛中引起出血。患病小牛的病史和關于動物飼養的信息給出了個體病例中可能的中度情況的一些指示，例如，真菌毒素或藥物。然而，在適用于所有受影響的農場并對懷疑特定毒素給出理由的所給出的信息中沒有一致性。但是，進行了毒素的一些隨機測試，其保持陰性。特別地，S-(I，2-二氯乙烯基)-L-半胱氨酸(DCVC)或呋喃唑酮中毒(二者都引起骨髓再生障礙和出血)，適于所觀察到的損傷。向小牛喂飼的以三氯乙烯提取的大豆油柏在較高劑量時產生致命性再生障礙性貧血和腎損傷。DCVC——三氯乙烯的代謝物，是該實體中的毒性因子。在實驗中，施用10天的低劑量的DCVC (0. 4mg/kg/天，i.v.)導致骨髓的明顯的非細胞性和廣泛出血(Lock等人，1996)。目前，己烷被用于替代三氯乙烯用于提取大豆油。就三氯乙烯、DCVC及其代謝物N-乙酰基-DCVC檢測總共4頭小牛的血液、腎組織和尿，產生了陰性結果。抗生素呋喃唑酮用于治療或預防人類和動物中的細菌和原蟲感染。由于嚴重骨髓消減，在實驗中，向喂奶小牛施用的每日劑量為4. 0至8. Omg/kg體重的呋喃唑酮產生致命性出血體質(Hoffmann-Fezer等人，1974,Hofmann等人，1974)。根據國家委員會的規定，向產生食物的動物施用呋喃唑酮被禁止。總之，研究了3頭受影響的小牛，就呋喃唑酮而言被證明是陰性的。羊齒植物[歐洲蕨(Pteridium aquiIinum)]的攝取在食草動物中引起中毒癥狀。牛中的急性羊齒植物中毒產生不可逆的骨髓低常增生，導致再生障礙性全血細胞減少癥。慢性攝取導致地方性動物血尿癥并且與下尿道和消化道中的腫瘤相關(Maxie andNewman, 2007, Valli, 2007) 同樣，在反芻動物和馬中描述了蕨類真菌毒素中毒為全血細胞減少疾病(Harrach等人，1983，Valli，2007)。羊齒植物中毒和葡萄穗霉屬中毒似乎在這些病例中是不可能的，因為癥狀應該在所有年齡的動物中出現，尤其是那些喂以含粗糙食物的食品的動物。在本研究中，飼料樣品對于真菌毒素測定為陰性，也沒有表明小牛或母牛對羊齒植物的攝取。特發性血小板減少性紫癜被描述為母牛中的罕見病況(Yeruham等人，2003)。該自身免疫疾病的誘因可能是免疫介導的血小板破壞(Lunn and Butler，1991)。已報告的血小板減少性紫癜與近期的多價肉毒中毒類毒素接種或分別針對乳頭瘤病毒和梭狀芽胞桿菌的滅活疫苗相關(Lunn and Butler, 1991, Yeruham等人,2003)。本研究中的小牛未經接種。此外，母牛中骨髓破壞的發生與所描述的免疫介導的血小板減少不相一致。已知B或E型多殺巴氏桿菌感染在小牛中引起出血性敗血病(Rimler，1978)。內毒素在該感染的病理發生中發揮重要作用(Horadagoda等人，2001)。在本研究中，僅在3頭小牛中存在多殺巴氏桿菌。未進行分型。在我們的研究中，器官樣品的微生物研究揭示出患病小牛中的寬譜的潛在致病細菌。然而，未發現與出血性疾病相關的特定致病細菌的一致性證據。在29%的病例中(n= 16)，未檢測到致病性細菌。在17頭小牛中，分離的細菌與另外的炎性損傷、例如肺炎或腸炎相關。可以假設這些小牛中的淋巴組織和骨髓的消減導致了嚴重的與免疫抑制和次級感染相關的白細胞減少及粒細胞減少。
使用PCR，在一些臨床患病的小牛中檢測到了圓環病毒。目前，尚未令人信服地描述牛中的圓環病毒感染。關于圓環病毒特異性抗體的血清學研究產生了矛盾的結果(Allan等人，2000，Ellis等人，2001，Tischer等人，1995)。僅有一篇論文顯示了可以在牛的肺組織和胎兒中檢測到與PCV2密切相關的圓環病毒(Nayar等人，1999)。PCR結果的分析有時是困難的，尤其是就DNA污染而言。然而，在我們的研究中，我們使用了嚴格的方案以排除實驗室的DNA污染。從I例樣品成功擴增了完整PCV2基因組，這駁斥了短的PCR產物的污染。常規PCV2特異性PCR程序的陰性結果可以這樣解釋相對于寬譜PCR的巢式程序，該程序的靈敏性較低。圓環病毒PCV2_Ha08的全基因組序列分析揭示了與PCV2b的密切關系。源自牛組織的唯一圓環病毒序列(Nayar等人，1999)(可從GenBank數據庫中獲得)也與PCV2密切相關。然而，詳細分析顯示兩個株簇集進入不同的亞型，因此，排除了能夠感染牛的獨特的PCV2株的存在。同時，分離了另外兩個株PCV2-Ha09和PCV2-HalO。圓環病毒一般被認為具有窄的宿主范圍，詳細的系統發生分析表明了圓環病毒與它們的宿主的嚴格的共進化(Johne等人，2006)。然而，對于PCV2，已經描述了稍有不同的進化和流行病學式樣，其與該病毒以前的有限傳播的延長的時間段、然后是該病毒的最近的世界范圍內的擴散是一致的(Hughes and Piontkivska, 2008)。可以推測PCV2已經獲得了特定的允許迅速擴散的性質，并且在極少病例中，跨越物種屏障而傳播。另外，在來自對照組的小牛之一中檢測到了 PCV2。對照動物已經被送去進行病理學檢查以確定除了出血性疾病以外的原因。PCV2與豬中的不同癥狀和疾病相關。據此可以推測圓環病毒造成小牛中的數種疾病。還可以想象具有HD的小牛中的免疫抑制增強對其它感染的易感性。在本例中，小牛中的PCV2檢測可以反映出機會性感染。最后，眾所周知的是，圓環病毒感染可能在不同的時間段、或甚至在被感染個體的終身維持臨床隱性。圓環病毒感染將與很多所觀察到的臨床跡象一致，因為多數圓環病毒引起淋巴細胞消減，相關的CIAV也在被感染的雞中引起再生障礙性貧血和出血。然而，在我們的研究中，使用可用的診斷方法，在所有臨床病例中都未檢出PCV2。同樣，通過PCR進行的檢測不一定意味著被復制性病毒感染。然而，在一些個體骨髓細胞中通過免疫組織化學方法檢測到PCV2抗原指示著病毒基因組表達和復制。表格表I :動物病例和對照組的特性，包括通過PCR檢測圓環病毒基因組序列和最終的
診斷
權利要求
1.圓環病毒(CV)核酸分子,其包含 (a)如SEQID NO 1所示的序列或其片段；和/或 (b)根據(a)的核苷酸序列的互補物。
2.權利要求I的核酸分子，其包含 (a)如SEQID NO 7所示的序列或其片段；和/或 (b)根據(a)的核苷酸序列的互補物。
3.權利要求I的核酸分子，其包含 (a)如SEQID NO 11所示的序列或其片段；和/或 (b)根據(a)的核苷酸序列的互補物。
4.權利要求1-3任一項的核酸分子，其中所述片段包含SEQID N0:l、7或11所示的至少15個、至少20個、至少25個、至少30個或至少50個連續核苷酸，或其互補物。
5.權利要求1-4任一項的核酸分子 (a)與SEQID NO :1、7或11所示的核苷酸序列具有至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%的同一性； (b)在嚴格條件下與SEQID NO :1、7或11所示的核苷酸序列雜交；或 (c)(a)或(b)的互補物。
6.編碼CV多肽或其片段的CV核酸分子，其中所述核酸分子包含 (a)如SEQID NO 1所示的核苷酸序列的區域(i)核苷酸51-995 (Itep)(ii)核苷酸1034-1735 (Cap) (iii)核苷酸357-671 (ORF3)； 和/或⑴、(ii)和/或(iii)的互補物； (b)在遺傳密碼簡并性范圍內對應于(a)的序列的核苷酸序列；或 (c)根據(a)或(b)的核苷酸序列的片段。
7.權利要求6的CV核酸,其中所述核酸分子包含 (a)如SEQID NO 7所示的核苷酸序列的區域(i)核苷酸51-995 (Itep)(ii)核苷酸1034-1735 (Cap) (iii)核苷酸357-671 (ORF3)； 和/或⑴、(ii)和/或(iii)的互補物 (b)如SEQID NO 11所示的核苷酸序列的區域(i)核苷酸51-995 (Itep) (ii)核苷酸1033-1734(Cap) (iii)核苷酸357-671 (ORF3);或 和/或⑴、(ii)和/或(iii)的互補物 (c)在遺傳密碼簡并性范圍內對應于(a)或(b)的序列的核苷酸序列；或 (d)根據(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的片段。
8.權利要求6或權利要求7的核酸分子，其中所述多肽或其片段包含如SEQID NO2-4,8-10或12-14所示任意氨基酸序列的至少6個、至少8個、至少10個、至少20個或至少30個連續氨基酸。
9.權利要求6-8任一項的CV核酸，其編碼與SEQID NO =2-4,8-10或12-14所示的氨基酸序列的任意項具有至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%同一丨I"生的多肽。
10.權利要求1-9任一項的核酸分子，其可操作地連接于異源表達控制序列。
11.以權利要求1-10任一項的核酸分子轉化或轉染的非人宿主細胞。
12.權利要求1-10任一項的核酸分子，其用作診斷劑。
13.權利要求12的核酸分子，其攜帶報告基團。
14.權利要求12或13的核酸分子，其用于診斷出血性體質(HD)。
15.權利要求14的核酸分子，其用于診斷牛中的HD。
16.權利要求1-10任一項的核酸分子，其用作治療劑。
17.權利要求16的核酸分子，用于預防和/或治療HD。
18.權利要求16或17的核酸分子，用于預防和/或治療牛中的HD。
19.權利要求16-18任一項的核酸分子,其作為基于核酸的疫苗或用于產生基于多肽的疫苗。
20.由根據權利要求1-10任一項的核酸分子編碼的多肽。
21.圓環病毒(CV)多肽，其包含 (a)選自下列的氨基酸序列 ⑴氨基酸序列SEQ ID NO 2 (Rep)， (ii)氨基酸序列SEQ ID NO 3(Cap)， (iii)氨基酸序列SEQ ID NO 4(ORF3);或 (b)其片段。
22.權利要求21的圓環病毒(CV)多肽，其包含 (a)選自下列的氨基酸序列 ⑴氨基酸序列SEQ ID NO 8和12 (Rep)，(ii)氨基酸序列SEQ ID NO 9 和 13 (Cap)， (iii)氨基酸序列SEQ ID NO 10 和 14(ORF3);或 (b)其片段。
23.權利要求20-22任一項的多肽，其包含如SEQID NO :2-4、8_10或12-14所示任意氨基酸序列的至少6個、至少8個、至少10個、至少20個或至少30個連續氨基酸。
24.權利要求20-23的多肽，其與SEQID NO :2-4、8_10或12-14所示的氨基酸序列的任意項具有至少90 %、至少92 %、至少94%、至少96 %、至少98 %或至少99 %的同一性。
25.權利要求20-24任一項的多肽，其用作診斷劑。
26.權利要求25的多肽，其攜帶報告基團。
27.權利要求25或26的多肽，其用于診斷HD，特別是牛中的HD。
28.權利要求20-24任一項的多肽，其用作免疫原。
29.權利要求28的多肽，其用于產生抗-CV抗體。
30.權利要求20-24任一項的多肽，其用于預防和/或治療HD，特別是牛中的HD。
31.權利要求30的多肽，其用作疫苗。
32.針對權利要求20-24任一項的多肽的抗體或其抗原結合片段。
33.權利要求32的抗體，其特異于CV株PCV2-Ha08。
34.權利要求32或33的抗體，其用作診斷劑。
35.權利要求32或33的抗體，其用于預防和/或治療HD，特別是牛中的HD。
36.包含權利要求1-10任一項的核酸分子的圓環病毒。
37.權利要求36的病毒，其是滅活的圓環病毒。
38.權利要求37的病毒，其是減毒的圓環病毒。
39.包含權利要求1-10任一項的核酸分子、或權利要求20-24任一項的多肽、權利要求32或33的抗體、或權利要求36-38任一項的病毒，以及可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑的組合物。
40.權利要求39的組合物，其是疫苗。
41.權利要求40的組合物，其是基于多肽的疫苗。
42.權利要求40的組合物，其是基于病毒的疫苗。
43.權利要求39的組合物，其是免疫原性組合物。
44.權利要求43的組合物，其是基于多肽的免疫原性組合物。
45.權利要求43的組合物，其是基于病毒的免疫原性組合物。
46.權利要求39-45任一項的組合物，其用于診斷用途。
47.權利要求39-45任一項的組合物，其用于治療用途。
48.診斷HD、特別是牛中的HD的方法，其包括 將來自待診斷的受試者的樣品與權利要求46的診斷組合物接觸，并測定所述樣品中CV或抗-CV抗體的存在和/或數量。
49.預防或治療HD、特別是牛中的HD的方法，其包括 向有此需要的受試者施用有效量的權利要求47的治療組合物。
全文摘要
本發明涉及作為牛中的骨髓再生障礙伴出血性疾病的誘因劑的新的圓環病毒(CV)。本發明提供了用于診斷和治療用途的新的核酸和蛋白序列。
文檔編號C07K14/01GK102711816SQ201080047391
公開日2012年10月3日 申請日期2010年10月22日 優先權日2009年10月22日
發明者B·沙德, E·凱普, H·米勒, J·伯切爾, M·Y·哈拉米 申請人:動物健康服務拜恩非營利組織, 萊比錫大學