專利名稱：用于評估作為疾病早期標志物的糖形的凝集素測定的制作方法
用于評估作為疾病早期標志物的糖形的凝集素測定交叉引用本申請要求保護于2009年8月5日提交的美國臨時申請號61/231400優先權的權益，其通過引用結合到本文中。
背景技術：
多種蛋白以兩種或更多種不同的同工型存在，其差異僅在于糖基化模式。這種差異，或差異糖基化的同工型的相對比例，可為疾病或病癥的指征并且因而需要能夠區分差異糖基化的同工型的測定系統。抗體用于區分內源性蛋白的差異糖基化同工型的應用是有問題的，因為產生特異性結合或優先結合內源性糖基化蛋白的特定同工型的抗體的成功率相對低。此外，已顯示對內源性蛋白差異糖基化同工型的相對濃度的測定在臨床上是重要的。Keir等論述 了患有糖蛋白糖鏈缺陷綜合征(carbohydrate deficient glycoprotein syndrome)或先天性糖蛋白糖基化缺陷(congenital disorder of glycosylation)的患者中轉移糖基化同工型的相對豐度異常(Keir等· Ann. Clin. Biochem. 36 :20-36 (1999)。具有翻譯后糖基化的任何蛋白質可潛在地以不同糖基化同工型存在。因此臨床相關蛋白質可以不同糖基化同工型存在，包括癌癥和其它疾病的糖基化標志物，所述標志物包括堿性磷酸酶、甲胎蛋白、人絨膜促性腺激素以及可能包括朊病毒蛋白(CD230)。本發明中其它與病癥相關并認為是用于開發測定法的潛在靶標的糖蛋白包括但不限于，α-l-酸糖蛋白、α-l-抗胰蛋白酶、觸珠蛋白、甲狀腺球蛋白、前列腺特異性抗原、 HEMPAS紅細胞帶3 (與先天性紅細胞生成異常II型貧血相關)、PC-I漿細胞膜糖蛋白、⑶41 糖蛋白IIb、CD42b糖盞蛋白(glyCOCaliCin)、CD43白細胞唾液酸糖蛋白、CD63溶酶體膜相關糖蛋白3、⑶66a膽汁糖蛋白、⑶66f妊娠特異性bl糖蛋白、⑶164多-糖基化核心蛋白 24以及Cd235血型糖蛋白家族。橙黃網胞盤菌凝集素(Aleuria aurantia lectin) (AAL)為312個氨基酸的蛋白質，其不含糖鏈而含有5個針對L-巖藻糖或L-巖藻糖-連接的寡糖的結合位點。與其它凝集素相比，AAL的多價性質賦予其針對糖類配體異常高的結合親和力(微摩爾)。商業化制備AAL基于通過與巖藻糖-淀粉柱的結合來分離并純化凝集素。用50mM L-巖藻糖將 AAL從柱洗脫出來(Fujihashi等)。然而,結構和生化分析顯示，由于此制備過程，市售AAL 的5個配體結合位點中的3至5個被巖藻糖占據(Olausson等，Amano等，Fujihashi等和 Wimmerova等)。因此，通過這些方法產生的AAL缺乏摻入到臨床顯著性診斷測定中所需的特異性和親和力。因此，需要可選擇性區分兩種或更多種具有不同糖基化模式的糖蛋白同工型的測定法，所述方法包括使用具有針對特定巖藻糖基化寡糖高親和力識別的重組形式AAL，接觸含有表達兩種或更多種糖形的糖蛋白的樣品，并且直接或間接檢測糖形差異作為疾病狀態的指示。發明概述本發明包括高親和力凝集素用于檢測蛋白質上靶糖部分中變化的用途并且提供用于在疾病早期檢測中自動診斷測定的方法。本發明的一個實施方案是針對患有炎性病癥、自身免疫病癥、癌癥、感染或其它病癥的個體的血試驗，其中特定蛋白質的糖基化模式的改變用作血清中的生物標志或用作在細胞表面上表達的生物標志。通過鑒定糖形或對表達這些糖形的蛋白質水平進行定量來對這些蛋白質水平進行分析，這提供了用于檢測患有疾病的人或處于疾病進展風險的人的簡單血試驗。包括將高親和力凝集素用作測定平臺 (例如但不限于基于板或基于珠的形式)中檢測物的測定法可容易地自動化用于臨床或現場護理(point-of-care)環境。
附圖
簡述
圖I :具有blade I至6的AAL單體的整體結構。橢圓體表明巖藻糖結合位點I至 5和相應位點6。在位點1、2和4的3個棍棒模式(stick mode)顯示巖藻糖分子。
圖2 :使用鎳NTA板用于IgGO配體的親和カ比較。
圖3 :使用與市售AAL蛋白競爭的重組AAL蛋白的間接ELISA。
發明詳述
本發明基于最近的發現(I)某些蛋白質的巖藻糖基化糖形的血清水平增加作為疾病例如癌癥的早期生物標志和⑵免疫球蛋白G的a半乳糖基化糖形 (agalactosylated glycoform)(稱作a-gal IgGO)的血清水平增加與肝病診斷相關(參見實施例I)。因此，與本 領域已知的任何報告分子(例如放射標記、發色團或熒光團)連接的重組或突變體形式的凝集素(AAL)用作a-gal IgGO檢測分子，所述分子對血液中巖藻糖基化蛋白是特異性的。并入ELISA或基于珠的測定系統提供了自動化平臺的基礎以測定患者疾病狀態。
本發明的一個實施方案涉及大腸桿菌細菌和/或酵母中重組野生型AAL蛋白的制備和分離。提供的方法包括通過定點誘變或隨機誘變而改變并且隨后選擇突變體AAL 蛋白產生和制備突變體AAL蛋白。這些AAL蛋白對外臂L-卩比喃巖藻糖基連接(outerarm L-fucopyranosyl linkage)具有高親和力，更具體而言突變AAL蛋白對a 1-2外臂L-卩比喃巖藻糖基連接、ct 1-3外臂L-批喃巖藻糖基連接或a 1-4外臂L-批喃巖藻糖基連接具有高親和力，所述連接存在于患有疾病例如但不限于癌癥的患者的血清蛋白生物標志中。
本發明的又一實施方案包括單獨的或與外臂連接聯合的核心巖藻糖(a 1-6連接的)糖形作為凝集素靶標的用途。核心連接的巖藻糖是癌癥的許多血清生物標志中主要的疾病指示物并且特異性檢測與外臂連接相反的a 1-6提供顯著的生物標志。N224Q突變體對1-6連接比對外臂更具選擇性。這提供了與現有技術相比顯著的優勢。因此，本發明的 AAL蛋白對核心a 1-6L-吡喃巖藻糖基連接具有高親和力，所述連接存在于患有疾病例如但不限于癌癥的患者的血清蛋白生物標志中。
AAL為312個氨基酸的蛋白質，其含有5個針對L-巖藻糖或L-巖藻糖-連接的寡糖的結合位點。與其它凝集素相比，AAL的多價性質賦予其針對糖類配體異常高的結合親和力(微摩爾)。AAL的商業化制備通過與巖藻糖-淀粉柱的結合來分離并純化。用50mM L-巖藻糖將AAL從柱洗脫出來(Fujihashi等)。結構和生化分析顯示，由于此制備過程，市售AAL的5個配體結合位點中的3至5個被巖藻糖占據(Olausson等,Amano等,Fujihashi 等和 Wimmerova 等)。
意想不到地發現，在細菌中產生并且采用鎳親和色譜從細菌分離的重組(r)AAL，與市售制備的AAL相比，具有對巖藻糖基化寡糖顯著更高的結合親和力，這通過表面等離振子共振研究、色氨酸熒光研究和酶聯凝集素測定法來測定。本發明的一個實施方案提供用于產生和制備高親和力(重組)rAAL和/或突變 rAAL的方法,這使得所有配體結合位點均可用于結合特定L-卩比喃巖藻糖基連接,所述連接存在于α-gal IgGO中以及疾病和癌癥的血清蛋白生物標志中。本發明的另一實施方案將作為檢測分子的高親和力rAAL并入靈敏和特異性的基于血液的測定中，以對處于疾病例如但不限于癌癥風險中的人進行測定。產牛并詵擇高親和力誘奪AAL通過遵循制造商的實驗方案將AAL-pUC57質粒轉化到XLl Red大腸桿菌增變株 (Strategene)來獲得隨機誘變的AAL。定點誘變集中在AAL中5個巖藻糖結合位點的數個的配體結合親和力改變。β -螺旋槳基序在AAL中重復6次。該基序在凝集素中普遍保守并且構成配體結合域。已描述基序中五(5)個巖藻糖結合位點(參見圖I)，并且每一位點對巖藻糖基化配體具有不同的親和力。如圖I所示，位點2和4是高親和力配體結合位點，而位點1、3和5的結合親和力較弱。每一 β折疊包含 具體參與巖藻糖結合的高度保守殘基。具體而言，位點2和4在Q22 和Q75的位置分別具有保守谷氨酰胺殘基，這使巖藻糖結合位點保持巖藻糖可接近的開放狀態。位點3和5的相應殘基是天冬酰胺Ν129和Ν224。因為這些天冬酰胺殘基(N)比谷氨酰胺(Q)少一個碳，所以它們不與鄰近的保守殘基發生必需的氫鍵接觸以使這些位點保持能量穩定的開放構型。開發了突變體AAL分子，Ν129和Ν224殘基分別和組合地換成谷氨酰胺(N129Q，N224Q)，即AALN129Q、AALN224Q以及AALN129Q，N224Q以使這些位點結構上類似高親和力結合位點。競爭實驗顯示，與野生型蛋白質相比，這些蛋白質對IgGO配體具有更高的親和力 (參見圖2)。這些結果表明隨機誘變方法將確定L-吡喃巖藻糖基連接的特異性且高親和力配體結合物，用于選擇突變體。本發明的另一實施方案涉及開發凝集素的突變體文庫，用于選擇本文特別提及的那些之外的其它糖結構。將基于酵母(釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))的展不和選擇系統用于篩選及選擇與特定L-吡喃巖藻糖基連接具有反應性的突變體AAL蛋白。簡言之，挑選用 AAL-pUC57 轉化并對其進行增變實驗方案(mutator protocol) (Strategene)的 200-400 XLl紅色菌落庫并制備質粒DNA。使用標準分子生物學技術將突變的AAL序列亞克隆到一種酵母展不載體PCT302中。該系統和載體在Broder和Wittrup and(2000)Methods Enzymology.第328卷,430-444中詳述。將含有突變體AAL文庫的酵母展示質粒轉化到單倍體酵母株EB Y100中并且如所述的培養。突變體AAL蛋白為誘導型表達并且在酵母的細胞表面上展示。根據在選擇條件下與含有特定L-吡喃巖藻糖基連接的生物素化配體的結合，對酵母展示突變體AAL文庫進行針對高親和力結合的富集(Bergan, L. , J. A. Gross, B. Nevin, N. Urban, N. Scholler. Cancer Lett 255，263-74 (2007))。對結合配體的細胞進行2輪鏈霉抗生物素磁珠富集(Miltenyi Macs),隨后進行3輪流式分選(Scholler等， Feldhaus等，Broder和Wittrup)。已顯示該系統消除了在卩遼菌體展示文庫中常見的表達偏袒和生長選擇，并且一致地產生對所選克隆的快速富集，IO5 (Feldhaus等)。
如Scholler等描述的，將展示文庫轉換成分泌的突變體AAL文庫。將突變體AAL DNA從富集的展示文庫分離并且通過缺ロ修復克隆到pTOR中以使突變體AAL蛋白分泌到培養基中。pTOR載體的特征包括；引導重組蛋白分泌的a前導序列(alpha prepro leader) 和符合讀框的6X His-標簽添加以及在突變體蛋白C-末端的Avitag序列(Scholler 等)。Avitag是生物素受體位點并且當用突變體AAL pTOR文庫轉化的單倍體細胞與表達大腸桿菌生物素連接酶基因(BirA)的相反交配型單倍體細胞交配時，其在特定賴氨酸殘基處被生物素化。在固體培養基上選擇分泌His-標簽的生物素化突變體AAL蛋白的二倍體細胞并且在誘導分泌所述蛋白的條件下于液體培養基中培養所述細胞。按照制造商的實驗方案，將二倍體細胞培養物上清液脫鹽、濃縮并經緩沖液調節，用于鎳-瓊脂糖柱純化 AAL-His (His-Trap, Amersham)。隨后可純化His-標簽的生物素化重組突變體AAL并且用于后續配體結合研究。
用于選擇配體和其它L-吡喃巖藻糖基寡糖的突變體和野生型AAL的定量平衡結合通過BIAcore分析和酶聯凝集素測定法來測定(Olausson等)。
突變體AAL蛋白對IgGO配體的高親和カ識別
將含有IOX組氨酸標簽的等量重組AAL (野生型或突變體)包被到鎳NTA板并且用漸增量IgGO配體(X軸)孵育。將無標簽的市購AAL(AAL-V)亦包被到鎳NTA板或到高親和カ結合ELISA板上(AAL-Vc)并且用漸增量IgGO配體孵育。將板洗滌并且用熒光標記的杭-人IgG孵育，洗滌并在熒光檢測器中讀數。漸增的相對熒光表明更高的結合親和力。 結果顯示在未飽和情況下，突變體AALmi(N129Q)展示最高信噪比，將檢測限提高10-100倍至 10ng/mL,并且將動態范圍從10ng/mL增加至100ug/mL(參見圖2)。這些結果表明重組突變體AAL蛋白將增加基于血液的測定的靈敏度和特異性從而檢測血清IgGO水平中的細微變化。
實施例I :對肝硬化患者具有選擇性的rAAL蛋白
與市售AAL相比，重組凝集素(rAAL)對IgGO配體顯示更高的親和カ。在基于競爭ELISA的實驗中 使用血清樣品，在肝硬化患者中與對照相比，rAAL具有顯著更高的親和力(參見圖3)。
實驗方案
將96孔板用經高碘酸鈉(NaIO4)處理的小鼠IgG(l. Oug/孔)包被。將3uL來自肝硬化患者的血清(Gish 342)或來自正常供體的血清(Sigma)稀釋至IOOuL并且將其加入抗體包被的孔中。將板洗滌并且隨后在振搖下，用等量的未生物素化市售(Vector)AAL,未生物素化重組IOX-His標簽的(rAAL 10X)、未生物素化重組IOX-His標簽突變體AAL(rAAL N129Q, N224Q))室溫孵育30分鐘。隨后向每孔加入等量生物素化AAL并且在振搖下室溫孵育I小吋。如先前所述，將板洗滌并且用鏈霉抗生物素-800-IRDye孵育。將板洗滌并且使用LiCor Odyssey設備進行熒光定量。在不存在未生物素化AAL下，測量對照樣品中生物素化AAL與IgGO的結合。
實驗結果
競爭實驗提供間接ELISA以測量未生物素化市售(Vector)蛋白和未生物素化 rAAL蛋白干擾生物素化AAL與IgGO配體結合的能力。這定性表明未標簽的AAL蛋白對IgGO配體的相對親和力。如圖3所示，在基于競爭ELISA的形式中，與市購(Vector)AAL相比，rAAL蛋白在更大程度上降低信號強度。在來自肝硬化患者(Gish 342)的血清樣品中，未生物素化市售 (Vector)AAL與生物素化AAL競爭而導致與對照相比信號強度降低(信號輸出從約35降至約20)。未生物素化野生型rAAL IOX和突變體rAAL(N129Q，N224Q)蛋白導致信號輸出更大地降低(對比對照)，表明在來自肝硬化患者的血清中對IgGO的親和力更高。Sigma = 陰性對照血清(來自未患肝病個體的血清)。本發明的又一實施方案提供用于本發明測定方法的試劑盒，所述試劑盒包括對特定巖藻糖基化寡糖具有高親和力識別的重組或突變體形式的AAL。盡管通過提及特定實施方案來描述本發明，但本領域技術人 員認識到可對其作出多種改變，例如改變本文描述的與AAL連接的檢測分子的具體選擇，并且將領會和理解的是，本發明的公開內容在不違背本發明更寬范圍和精神下僅顯示本發明的一些優選實施方案和優點。將領會和理解的是，本發明的這些發現僅僅是本領域普通技術人員可預期的許多另外潛在應用中說明性的那些，并且因此絕不以任何方式限制本發明。因此，根據詳細的說明書連同權利要求書，本發明的其它目標和優點對于本領域技術人員而言清楚明了。
權利要求
1.用于制備對巖藻糖基化蛋白具有高親和カ的凝集素的方法，所述方法包括a.獲得含有至少ー個針對L-巖藻糖或L-巖藻糖-連接的寡糖的結合位點的凝集素；b.在至少ー個所述結合位點中使凝集素突變；和c.富集所述突變的凝集素，其中所述凝集素具有對巖藻糖基化蛋白提高的結合親和力。
2.權利要求I的方法，其中所述凝集素為AAL。
3.權利要求I的方法，其中所述突變通過隨機誘變來進行。
4.權利要求I的方法，其中所述突變通過定點誘變來進行。
5.權利要求I的方法，其中所述提高的結合親和力針對所述巖藻糖基化蛋白上的外臂或核心L-批喃巖藻糖基連接。
6.權利要求5的方法，其中所述連接選自a1-2外臂L-吡喃巖藻糖基連接、a 1-3外臂レ批喃巖藻糖基連接、a 1-4外臂L-批喃巖藻糖基連接、核心a 1_6L_批喃巖藻糖基連接及其組合。
7.權利要求I的方法，其中所述凝集素獲自細菌。
8.權利要求I的方法，其中所述富集通過鎳色譜來進行。
9.權利要求I的方法，其中所述凝集素還與10個或更多個組氨酸殘基連接。
10.權利要求I的方法，其中所述凝集素還與報告分子連接。
11.用于區分兩種或更多種糖蛋白同エ型的方法，所述方法包括a.獲取含有糖蛋白的樣品；b.使所述糖蛋白與權利要求I的重組凝集素結合，其中所述凝集素對糖蛋白同エ型具有高親和カ并且其中所述凝集素與報告分子連接；和c.檢測所述報告分子的存在情況，存在所述報告分子表明存在所述同エ型。
12.權利要求11的方法，其中所述重組凝集素為與10個或更多個組氨酸殘基符合讀框連接的重組AAL。
13.權利要求11的方法，其中所述重組凝集素為具有與C-末端符合讀框連接的10個或更多個組氨酸殘基并且在第129或224位具有天冬酰胺或谷氨酰胺的用于檢測所述同エ 型的重組AAL。
14.權利要求13的方法，其中所述同エ型具有a-I，6連接的巖藻糖殘基。
15.權利要求14的方法，還具有在以下位點中的至少ー個突變結構域2中的R24A、 E36A、R77A、結構域2中的E898A、結構域4中的R179A、結構域4中的E191A及其組合。
16.用于檢測患者疾病的方法，所述方法包括a.從含有巖操糖基化糖形祀蛋白的患者獲取血清樣品；b.使權利要求I的重組凝集素與具有巖藻糖基化糖形的靶蛋白結合；c.檢測巖藻糖基化糖形的存在情況，其中存在的巖藻糖基化糖形的量改變表明存在疾病。
17.權利要求16的方法，其中所述疾病為癌癥。
18.權利要求16的方法，其中所述重組凝集素為與10個或更多個組氨酸殘基符合讀框連接的重組AAL。
全文摘要
本發明提供用于評估作為疾病的生物標志的蛋白糖形的方法、組合物、裝置和試劑盒。將純化的重組形式凝集素用作檢測分子以特異性標記在疾病狀態中表達的靶糖類。重組凝集素的高親和力使用于疾病例如但不限于癌癥或肝病診斷的測定得以自動化。
文檔編號C07K1/00GK102725417SQ201080044720
公開日2012年10月10日 申請日期2010年8月3日 優先權日2009年8月5日
發明者A·梅塔, P·R·羅馬諾, T·M·布洛克 申請人:肝炎和病毒研究所