專利名稱：二硫鍵穩定的多價抗體的制作方法
ニ硫鍵穩定的多價抗體 本發明涉及新的雙特異性抗體融合蛋白質。此類抗體包含針對目的抗原的第一特異性，和針對第二目的抗原(例如用于延長它們的體內血清半衰期的血清載體蛋白)的第 ニ特異性。還提供用于產生此類分子的方法和包含它們的藥物組合物。抗體的高特異性和親合性使得它們成為理想的診斷和治療試劑，特別是用于調節蛋白蛋白相互作用。重組抗體技術領域的發展已導致抗體片段例如Fv、Fab、Fab' 和F(ab' )2片段及其他抗體片段的產生。這些較小的分子保留了完整抗體的抗原結合活性并且還可以呈現與完整免疫球蛋白分子相比改善的組織穿透和藥物動力學性質。甚至，從最近成功的產品(例如1^(^1"0@并且11^611113 )來看，抗體片段經證明是多用途的治療劑。雖然此類片段顯現出許多優于完整免疫球蛋白的優點，但它們也受累于增加的血清清除率，因為它們缺乏賦予其體內長存在期的Fc結構域(Medasan等人，1997， J.Immunol. 158 :2211-2217)。之前已經描述了具有雙特異性的抗體，即其與兩個不同的抗原結合(關于綜述，參見 Segal 等人，1999，Curr.Opin. Immunol. 11 :558-562 ；Pluckthun & Pack， 1997， Immunotechnology，3:83-105 ；Fischer 禾ロ Leger，2007，Pathobiology，74，3—14)。 W002/02773、US2007065440、US2006257406、US2006106203 和 US2006280734 中也描述了雙特異性抗體。之前的制備異-雙特異性基于抗體的分子的方法通常使用化學交聯或者蛋白質工程技木。化學交聯受累于異-和同ニ聚體形成的低產量以及它們隨后的色譜分離的要求。蛋白工程方法已經進行了非常詳細的描述(例如knobs-into-holes engineering ； Ridgway等人，1996，ProteinEng. 9 (7) :617-621)或已經用于具有不適當的穩定性特征的分子(例如雙抗體(diabody)，scFv)。在一些情況下，雙特異性抗體還可受累于空間位阻問題，其使得兩個抗原不能同時結合到各個抗體臂。單可變結構域抗體又名單域抗體或dAb，相當于抗體的重鏈(VH)或輕鏈(VL)的可變區。Ward等人，1989，Nature，；341，討4づ46已經描述了鼠單域抗體。也已經描述了人和〃路馬它化(camelised)“人單域抗體(Holt 等人，2003，Trends in Biotechnology, 21, 484-490)。也已經從駱駝(駱駝和美洲駝)和軟骨魚(斑紋須鯊和鉸ロ鯊)中獲得了單域抗體。這些生物已經進化出高親和カ單V樣結構域(駱駝中稱為VhH，鯊魚中稱為V-NAR)， 所述結構域裝配到Fc-等價恒定結構域構架作為它們的免疫系統的完整和重要的元件(關于綜述，參見 Holliger & Hudson ；2005, Nature Biotechnology, 23 (9) :1126-1136) EP0368684中已經描述了單域抗體-酶融合物，W02004/058820中也已經描述了單域效應子群融合物，其包含單可變結構域。W02007/024715中已經描述了雙可變結構域免疫球蛋白。EP1517921中已經描述了包含具有不同特異性的兩個單域抗體的雙特異性配體。用于改進抗體片段例如Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2及其他抗體片段的半衰期的方法是已知的。ー種方法將所述片段與聚合物分子綴合。因此，通過與聚乙ニ醇(PEG;參見，例如 W098/25791、W099/64460 和 W098/37200)綴合改善動物中 Fab'、F(ab' )2 片段的短的循環半衰期。另ー種方法通過與和Fcfoi受體相互作用的試劑綴合來修飾抗體片段(參見例如W097/34631)。另ー個用于延長半衰期的方法使用結合血清白蛋白的多肽(參見例如Smith 等人，2001，Bioconjugate Chem. 12 :750-756 ；EP0486525 ；US6267964 ；W004/001064 ； W002/076489 ；和W001/45746)。然而，仍然需要產生具有長的體內半衰期的抗原結合免疫球蛋白，作為具有長的半衰期的免疫球蛋白的替代物，因為它們與Fcfoi受體相互作用，不必通過與PEG綴合進行化學修飾或與人血清白蛋白綴合。多種蛋白質存在于血漿中并且包括甲狀腺素結合蛋白、轉甲狀腺素蛋白、α 1酸糖蛋白、轉鐵蛋白、纖維蛋白原和白蛋白，或其任何片段。體內的血清載體蛋白循環具有以天計的半衰期，例如對于甲狀腺素結合蛋白，5天或對于轉甲狀腺素蛋白，2天(Bartalena & Robbins, 1993, Clinics in Lab. Med. 13 :583-598)，或碘化 α 1 酸糖蛋白的周轉的第二階段，65 小時(Bree 等人，1986，Clin. Pharmacokin. 11 :336-342)。來自 Gitlin 等人(1964， J.Clin. Invest. 10:1938-1951)的數據表明孕婦中，α 1酸糖蛋白的半衰期是3. 8天，轉鐵蛋白12天和纖維蛋白原2.5天。血清白蛋白是血管和血管外區室中豐富的蛋白，其在人體中具有大約 19 天的半衰期(Peters, 1985，Adv Protein Chem. 37 :161-245)。這與 IgGl 的半衰期(大約 21 天)相似(Waldeman & Strober, 1969，Progr. Allergy, 13 :1-110)。本發明提供了改善的雙特異性抗體融合蛋白，其可以重組產生并且能夠同時結合兩個抗原，特別是兩個不同/相異抗原。因此，本發明提供雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對目的抗原的第一特異性的免疫球蛋白部分(例如Fab或Fab'片段)，并且進一歩包含具有對第二目的抗原的特異性的單域抗體(dAb)，特別地其中第一抗原和第二抗原是不同的實體。如本文使用的，單域抗體并非指單鏈Fv。單鏈Fv特征在于彼此連接的2個可變結構域，其形成獨立實體，或僅通過其中的一個可變結構域與另ー實體連接。如本文使用的，多價是指具有兩個或多個結合位點例如兩個或三個結合位點(例如兩個結合位點)的實體。各結合位點可以結合相同抗原上的相同表位或不同表位，或可以結合不同(相異)抗原。本發明還提供雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對目的抗原的第一特異性的免疫球蛋白部分(例如Fab或Fab'片段)，并且進一歩包含至少ー個具有對第二目的抗原的特異性的單域抗體。本發明的雙特異性抗體融合物將能夠選擇性地結合兩個目的抗原。在一個實施方案中，第一和第二抗原是相同抗原。在一個實施方案中，Fab或Fab'片段所結合的目的抗原可以是細胞相關蛋白， 例如細胞(例如細菌細胞、酵母細胞、T細胞、內皮細胞或腫瘤細胞)上的細胞表面蛋白， 或其可以是可溶性蛋白。目的抗原還可以是任何醫學上相關的蛋白，例如在疾病或感染期間上調的那些蛋白，例如受體和/或它們相應的配體。細胞表面蛋白的具體實例包括粘著分子例如整聯蛋白例如β 1整聯蛋白例如VLA-4、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白或L-選擇蛋白、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CDlla, CDllb, CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、 CD40、CD45、CDW52、CD69、CD134 (0X40)、I COS, BCMP7、CD137、CD27L、CDCPl、DPCRl、DPCRl、 dudulin2、FLJ20584, FLJ40787, HEK2、KIAA0634、KIAA0659、KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、 LTK, MAL2、MRP2、連接素樣 2、NKCCl、PTK7、RAIGl、TCAMl、SC6、BCMP101、BCMP84、BCMPl 1、 DTD、癌胚抗原(CEA)、人乳脂肪球蛋白(HMFG1和2)、MHC I類和MHC II類抗原、和VEGF，和當適當時，其受體。
可溶性抗原包括白細胞介素(例如IL-I、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、 IL-12、IL-16或IL-17)，病毒抗原(例如呼吸道合胞病毒或巨細胞病毒抗原)，免疫球蛋白 (例如IgE)，干擾素(例如干擾素α、干擾素β或干擾素Y)，腫瘤壞死因子-α，腫瘤壞死因子-β，集落刺激因子(例如G-CSF或GM-CSF)和血小板源性生長因子(例如PDGF- α 和PDGF-β)和當適當時，其受體。其他抗原包括細菌細胞表面抗原、細菌毒素、病毒(例如流感病毒、EBV, H印A、B和C)、生物恐怖試劑、放射性核素和重金屬、及蛇和蜘蛛毒和毒素。在一個實施方案中，本發明的抗體融合蛋白質可以用于功能性地改變目的抗原的活性。例如，抗體融合蛋白質可以直接或間接地中和、拮抗或激動(agonise)所述抗原的活性。在一個實施方案中，被本發明的雙特異性抗體融合蛋白中的單域抗體結合的第二目的抗原可以是細胞相關蛋白，例如細胞(例如細菌細胞、酵母細胞、T細胞、內皮細胞或腫瘤細胞)上的細胞表面蛋白，或其可以是可溶性蛋白。目的抗原還可以是任何醫學上相關的蛋白，例如在疾病或感染期間上調的那些蛋白，例如受體和/或它們相應的配體。細胞表面蛋白的特別的實例包括粘著分子例如整聯蛋白例如β 1整聯蛋白例如VLA-4、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白或 L-選擇蛋白、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CDlla, CDllb, CD18、CD19、 CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD45、CDW52、CD69、CD134 (0X40)、ICOS、BCMP7、CD137、 CD27L、CDCPU DPCRU DPCRU dudulin2、FLJ20584, FLJ40787, HEK2、KIAA0634、KIAA0659、 KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、LTK、MAL2、MRP2、連接素樣 2、NKCCl、PTK7、RAIGl、TCAMl、SC6、 BCMP101、BCMP84、BCMP11、DTD、癌胚抗原(CEA)、人乳脂肪球蛋白(HMFG1 和 2)、MHC I 類和 MHC II類抗原、和VEGF，和當適當時，其受體。可溶性抗原包括白細胞介素(例如IL-I、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、 IL-12、IL-16或IL-17)，病毒抗原(例如呼吸道合胞病毒或巨細胞病毒抗原)，免疫球蛋白 (例如IgE)，干擾素(例如干擾素α、干擾素β或干擾素Y)，腫瘤壞死因子-α，腫瘤壞死因子-β，集落刺激因子(例如G-CSF或GM-CSF)和血小板源性生長因子(例如PDGF- α 和PDGF-β)和當適當時，其受體。其他抗原包括細菌細胞表面抗原、細菌毒素、病毒(例如流感病毒、EBV, H印A、B和C)、生物恐怖試劑、放射性核素和重金屬、及蛇和蜘蛛毒和毒素。可以被單域抗體結合的其他抗原包括血清載體蛋白，允許細胞介導的效應子功能招募的多肽，和核素螯合蛋白。因此，在一個實例中本發明提供了雙特異性抗體融合蛋白，所述蛋白包含具有針對目的抗原的第一特異性的免疫球蛋白部分，并且進一歩包含具有針對第二蛋白的特異性的單域抗體，后者提供招募效應子功能的能力，例如補體途徑激活和/或效應子細胞招募。 此外，本發明的融合蛋白可以用于通過與核素螯合蛋白結合的單域抗體螯合放射性核素。 此類融合蛋白用于成像或用于治療的放射性核素靶向方法。因此，在一個實例中，提供分離的雙特異性抗體融合蛋白質，其包含具有針對目的抗原的特異性的抗體Fab或Fab'片段，所述片段與至少ー個dAb融合，所述dAb具有針對招募多肽的特異性，所述dAb通過與所述招募多肽結合，直接或間接地提供招募細胞介導的效應子功能的能力。可以直接招募效應子功能(effector function)，因為效應子功能與細胞相關，所述細胞在它的表面上具有招募分子。當dAb與招募分子的結合引起例如可以直接或間接地招募效應子功能或可以經由信號傳導途徑活化的因子的釋放吋，可發生間接招募。實例包括TNFa、IL2、IL6、IL8、IL17、IFN γ、組胺、Clq、調理素及經典的和可選擇的補體活化級聯的其他成員，例如C2、C4、C3-轉化酶，和C5至C9。如本文使用的，“招募多肽〃包括Fc γ R(例如Fc γ RI、Fc YRII和Fc γ RIII)、 補體途徑蛋白(例如但不限于Clq和C3)、CD標志物蛋白(分化標志物群)(例如但不限于 CD68、CDl 15、CDl6、CD80、CD83、CD86、CD56、CD64、CD3、CD4、CD8、CD28、CD45、CD19、CD20 和⑶22)。其為CD標志物蛋白的其他招募多肽包括CDl，CDld, CD2, CD5, CD8, CD9,⑶10， CDl 1, CDlla, CDllb, CDllc, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD40, CD43, CD44, CD45, CD46, CD49, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD58, CD59, CD61, CD62, D62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CD66e, CD68, CD70, CD71, CD72, CD79, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD88, CD89, CD90, CD94, CD95, CD98, CD106, CD114, CD116, CD117, CD118, CD120, CD122, CD130, CD131, CD132, CD133, CD134, CD135, CD137, CD138, CD141, CD142, CD143, CD146, CD147, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD162, CD164, CD169, CD184, CD206, CD209, CD257, CD278, CD281, CD282, CD283 和 CD304，或保留直接或間接地招募細胞介導的效應子功能的能力的任何其片段。招募多肽還包括具有效應子功能的免疫球蛋白分子，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgE和IgA。在一個實施方案中，dAb對其具有特異性的第二蛋白是補體途徑蛋白，特別優選的
定 Clq0在優選實施方案中，dAb對其具有特異性的第二蛋白是CD標志物蛋白，特別優選的是 CD68、CD80、CD86、CD64、CD3、CD4、CD8、CD45、CD16 和 CD35。因此，還提供分離的雙特異性抗體融合蛋白質，其包含對目的抗原具有特異性的抗體片段，所述片段與至少ー個dAb融合，所述dAb對選自CD68、CD80、CD86、CD64、CD3、CD4、 ⑶8、⑶45、⑶16和⑶35的⑶分子具有特異性。在一個實施方案中，單域抗體為具有第一特異性的免疫球蛋白部分提供延長的半衰期。因此，在一個實施方案中，提供雙特異性抗體融合蛋白質，其包含對目的抗原具有特異性的抗體Fab或Fab ‘片段，所述片段與至少ー個單域抗體融合，所述單域抗體對血清載體蛋白、循環免疫球蛋白分子、或CD35/CR1具有特異性，所述單域抗體通過與所述血清載體蛋白、循環免疫球蛋白分子或CD35/CR1結合，為對所述目的抗原具有特異性的抗體片段提供延長的半衰期。在一個實施方案中，提供分離的雙特異性抗體融合蛋白質，其包含對目的抗原具有特異性的抗體Fab或Fab ‘片段，所述片段與至少ー個單域抗體融合，所述單域抗體對血清載體蛋白、循環免疫球蛋白分子、或CD35/CR1具有特異性，所述單域抗體通過與所述血清載體蛋白、循環免疫球蛋白分子或CD35/CR1結合，為對所述目的抗原具有特異性的抗體片段提供延長的半衰期。如本文使用的，“血清載體蛋白"包括甲狀腺素結合蛋白、轉甲狀腺素蛋白、α 酸糖蛋白、轉鐵蛋白、纖維蛋白原和白蛋白、或任何其片段。如本文使用的，“循環免疫球蛋白分子〃包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM和IgD、或任何其片段。⑶35/CR1是在紅細胞上存在的蛋白，其半衰期為36天(正常范圍為觀至47天； Lanaro 等人，1971，Cancer, 28 (3) :658-661)。在優選實施方案中，dAb對其具有特異性的第二蛋白是血清載體蛋白，特別優選的是人血清載體蛋白。在非常優選的實施方案中，血清載體蛋白是人血清白蛋白。因此，提供了雙特異性抗體融合蛋白質，其包含對目的抗原具有特異性的抗體Fab 或Fab'片段，所述片段與對人血清白蛋白具有特異性的至少ー種單域抗體融合。在一個實施方案中，本發明提供分離的雙特異性抗體融合蛋白質，其包含對目的抗原具有特異性的抗體Fab或Fab'片段，所述片段與對人血清白蛋白具有特異性的至少一種單域抗體融合。在一個實施方案中，對目的抗原具有特異性的抗體片段是Fab片段。在另ー個實施方案中，對目的抗原具有特異性的抗體片段是Fab'片段。因此，在一個優選的實施方案中，本發明的抗體融合蛋白是翻譯融合蛋白，即基因融合物，其各個序列通過表達載體編碼。可選地，已經使用化學方法(即通過化學綴合或化學交聯)來將抗體融合蛋白的組分融合。所述化學方法是本領域已知的。在一個實例中，抗體片段是具有天然或經修飾的絞鏈區的Fab'片段。當用于制備本發明的雙特異性抗體融合蛋白質的抗體片段是Fab'片段吋，通常在重鏈的C末端將所述片段延伸一個或多個氨基酸。因此，本發明的抗體融合物可以包括直接或經由連接體與dAb翻譯融合(或化學融合)的!^ab'片段。此外，適當的抗體Fab'片段的實例包括 W02005003170 和 W02005003171 中描述的那些。在另ー個實例中，抗體片段是Fab片段。因此，本發明的抗體融合物可以包括與連接體序列翻譯融合(或化學融合)的Fab片段，所述連接體序列又與dAb翻譯融合(或化學融合)。優選地，Fab片段是以鏈間半胱氨酸終止的Fab片段，如W02005/003169中描述的。因此，在一個實例中，Fab片段在IgGl的位置233處終止。 本發明中使用的抗體Fab或Fab ’片段可以來自任何物種，優選來源于單克隆抗體、人抗體，或是人源化片段。本發明所用的抗體片段可以來源于免疫球蛋白分子的任何種類(例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)或亞類并且可以從任何物種(包括例如小鼠、大鼠、鯊魚、兔子、豬、倉鼠、駱駝、美洲駝、山羊或人)獲得。在一個實施方案中，抗體Fab或Fab'片段是單克隆、完全人、人源化或嵌合抗體片段。在一個實施方案中，抗體Fab或Fab'片段是完全人的或人源化的。可以通過本領域已知的任何方法制備單克隆抗體，例如雜交瘤技術(Kohler & Milstein, Nature，1975，256，495-497)，三體雜交瘤技術，人B細胞雜交瘤技術(Kozbor 等人，Immunology iToday, 1983，4，72)和 EBV-雜交瘤技術(Cole 等人，“Monoclonal Antibodies and CancerTherapy" , pp. 77-96, Aian R. Liss,Inc.,1985)。還可以使用單淋巴細胞抗體法，通過克隆和表達免疫球蛋白可變區cDNA產生本發明使用的抗體，所述cDNA從選擇用于產生特異性抗體的單淋巴細胞產生，通過例如 Babcook，J.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996,93 (15), 7843-7848, WO 92/02551， W02004/051268 和 W02004/106377 描述的方法。人源化抗體是具有來自非人物種的ー個或多個互補決定區(CDR)和來自人免疫球蛋白分子的構架區的來自非人物種的抗體分子(參見例如US 5，585，089)。還可以使用本領域已知的各種噬菌體展示方法產生本發明使用的抗體，并且此類方法包括 Brinkman 等人，J. Immunol. Methods, 1995,182,41-50 ；Ames 等人，J. Immunol. Methods 1995，184，177-186 ；Kettleborough 等人 Eur. J. Immunol.，1994，24952-958 ； Persic 等人，Gene，1997187，9—18 ；禾ロ Burton 等人，Advances in Immunology,1994, 57,191-280 ；WO 90/02809 ；WO 91/10737 ；WO 92/01047 ；W092/18619 ；WO 93/11236 ； WO 95/15982 和 WO 95/20401 ；和 US 5, 698, 426 ；5,223, 409 ；5, 403, 484 ；5,580, 717 ； 5，427，908 ；5，750，753 ；5，821，047 ；5，571，698 ；5，427，908 ；5，516，637 ；5，780，225 ； 5，658，727 ；5, 733，743 ；和5，969，108中公開的方法。并且，轉基因小鼠或其他生物(包括其他哺乳動物)可以用來產生人源化抗體。完全人抗體是其中重鏈和輕鏈的可變區和恒定區(當存在時)全部為人來源，或與人來源的序列(不必來自相同抗體)基本上同一的那些抗體。完全人抗體的實例可以包括例如通過上述噬菌體展示方法產生的抗體和由其中鼠免疫球蛋白可變和/或恒定區基因已經被它們的人對應物取代的小鼠生產的抗體(例如，EP0M6073 BUUS 5, 545,806, US5, 569，825、US 5, 625, 126,US 5, 633, 425,US 5, 661, 016,US 5, 770, 429,EP 0438474 Bl 和EP0463151 Bl中一般性描述的)。本發明使用的抗體Fab或Fab'片段的起始材料可以使用任何適當的酶切割和/ 或消化技術(例如通過用胃蛋白酶處理)獲自任何完整抗體，特別是完整單克隆抗體。可選地，或另外，可以通過使用重組DNA技術(包括操作和重表達編碼抗體可變和/或恒定區的 DNA)制備抗體起始材料。標準分子生物學技術可以用于修飾、添加或缺失期望的氨基酸或結構域。如本文使用的，對可變或恒定區的任何改變仍然包括在術語"可變"和"恒定" 區內。抗體片段的起始材料可以獲自任何物種，包括例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠、駱駝、美洲駝、山羊或人。抗體片段部分可以獲自ー種以上的物種，例如抗體片段可以是嵌合的。在一個實例中，恒定區來自一個物種而可變區來自另ー個物種。抗體片段的起始材料還可以是經修飾的。在另ー個實例中，使用重組DNA工程技術產生抗體片段的可變區。此類工程改造的形式包括例如通過插入、缺失或改變天然抗體的氨基酸序列從天然抗體可變區產生的那些。這個類型的特別的實例包括那些工程改造的可變區結構域，所述結構域包含至少ー 個CDR和任選地，來自ー個抗體的一個或多個構架氨基酸和來自第二抗體的可變區結構域的其他部分。產生和制造這些抗體片段的方法是本領域公知的(參見，例如，Boss等人，US 4，816，397 ；Cabilly 等人，US 6，331，415 ；Shrader 等人，WO 92/02551 ；Ward 等人，1989， Nature,341, 544 ；Orlandi 等人，1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3833 ；Riechmann 等人，1988, Nature, 322，323 ；Bird 等人，1988，Science, 242,423 ；Queen 等人，US 5，585，089 ； Adair,W091/09967 ；Mountain 禾ロ Adair，1992Biotechnol. Genet. Eng. Rev, 10，1—142 ；Verma 等人，1998，Journalof Immunological Methods，216，165-181)。在本發明中，與Fab或Fab'片段融合的各個單域抗體可以直接或經由連接體連接。本文使用的直接連接是指，Fab或Fab'的"最后ー個"氨基酸通過肽鍵與單域抗體的"第一個"氨基酸相連(或反之亦然)。
用于將dAb與Fab或Fab'連接的適當的連接體區域的實例包括但不限于，柔性連接體序列和剛性連接體序列。柔性連接體序列包括在Huston等人1988，PNAS 85: 5879-5883 ；Wright & Deonarain，Mol.Immunol. ,2007,44(11) :2860-2869 ；Alfthan 等人， Prot. Eng. , 1995,8(7) :725-731 ；Luo 等人，J. Biochem. , 1995,118(4) :825-831 ；Tang 等人，1996，J. Biol. Chem. 271 (26) 15682-15686 ；和 Turner 等人，1997，JIMM 205，42-54 中公開的那些(關于代表性實例，參見表1)。表1.柔性連接體序列
權利要求
1.一種多價抗體融合蛋白，其包含對于目的抗原具有第一特異性的Fab或Fab'片段， 且進一歩包含其為對于第二目的抗原具有特異性的VH/VL對的兩個單域抗體(dAb)，其中所述兩個單域抗體通過在2個半胱氨酸殘基之間的ニ硫鍵連接，所述2個半胱氨酸殘基一個在VH中并且ー個在VL中，其中所述2個半胱氨酸殘基的位置選自VH37和VL95、VH44和 VL100、VH44 和 VL105、VH45 和 VL87、VH100 和 VL50、VHlOOb 和 VL49、VH98 和 VL46、VHlOl 和 VL46、VH105 和 VL43 以及 VH106 和 VL57。
2.根據權利要求1的多價抗體融合蛋白，其中VH的半胱氨酸在位置44上，并且VL的半胱氨酸在位置100上。
3.根據權利要求1或權利要求2的多價抗體融合蛋白，其中所述兩個單域抗體是協同結合所述第二抗原的互補VH/VL對。
4.根據權利要求1-3中任ー項的多價抗體融合蛋白，其中所述第一抗原和第二抗原是不同的實體。
5.根據權利要求1-4中任ー項的多價抗體融合蛋白，其中所述VHdAb與所述Fab或 Fab'重鏈直接或間接連接。
6.根據權利要求1-5中任ー項的多價抗體融合蛋白，其中所述VLdAb與所述Fab或 Fab'輕鏈重鏈直接或間接連接。
7.根據權利要求5或權利要求6的多價抗體融合蛋白，其中所述VHdAb與所述Fab或 Fab ‘重鏈的C末端直接或間接連接，并且所述VLdAb與所述Fab或Fab ‘輕鏈的C末端直接或間接連接。
8.根據權利要求5或權利要求6的多價抗體融合蛋白，其中所述ル(^13與所述Fab或 Fab ‘重鏈的N末端直接或間接連接，并且所述\dAb與所述Fab或Fab ‘輕鏈的N末端直接或間接連接。
9.根據權利要求1-8中任ー項的多價抗體融合蛋白，其中所述VH和/或VL結構域經由具有SEQ ID NO :2 或SEQ ID NO :225中給出的序列的連接體與所述Fab或Fab ‘片段連接。
10.根據權利要求8的多價抗體融合蛋白，其中所述VHdAb經由具有SEQ ID NO 228 中給出的序列的連接體與所述Fab或Fab'重鏈的N末端連接，并且所述VL dAb經由具有 SEQ ID NO 229中給出的序列的連接體與所述Fab或Fab'重鏈的N末端連接。
11.根據權利要求1-10中任ー項的多價抗體融合蛋白，其中所述第二抗原是白蛋白。
12.根據權利要求1-11中任ー項的多價抗體融合蛋白，其中所述第二抗原是人血清白蛋白。
13.根據權利要求12的多價抗體融合蛋白，其中所述VH單域抗體包含對于CDR-Hl 具有圖5(e) SEQ ID NO :56或圖5 (k) SEQ ID NO :62中給出的序列的CDR，對于CDR-H2具有圖5(f) SEQ ID NO :57或圖5 (I)SEQ ID NO :63中給出的序列的CDR，和對于CDR-H3具有圖 5(g) SEQ IDNO :58 或圖 5(m)SEQ ID NO :64 中給出的序列的 CDR。
14.根據權利要求12的多價抗體融合蛋白，其中所述VL單域抗體包含對于CDR-Ll 具有圖5(h) SEQ ID NO :59或圖5 (n) SEQ ID NO :65中給出的序列的CDR，對于CDR-L2具有圖5⑴SEQ ID NO :60或圖5 (ο) SEQ ID NO :66中給出的序列的CDR，和對于CDR-L3具有圖 5 (j) SEQ IDNO :61 或圖 5 (ρ) SEQ ID NO :67 中給出的序列的 CDR0
15.根據權利要求12的多價抗體融合蛋白，其中所述VH單域抗體包含SEQID NO :202 中給出的序列，并且所述VL單域抗體包含SEQ IDNO :203中給出的序列。
16.根據權利要求12的多價抗體融合蛋白，其中所述VH單域抗體包含SEQID NO :204 中給出的序列，并且所述VL單域抗體包含SEQ IDNO :205中給出的序列。
17.一種結合白蛋白的Fv或scFv，其包含具有SEQ ID NO :202中給出的序列的VH結構域。
18.一種結合白蛋白的Fv或scFv，其包含具有SEQ ID NO :204中給出的序列的VH結構域。
19.根據權利要求17的結合白蛋白的Fv或scFv，其進ー步包含具有SEQID NO :203 中給出的序列的VL結構域。
20.根據權利要求18的結合白蛋白的Fv或scFv，其進ー步包含具有SEQID NO :205 中給出的序列的VL結構域。
全文摘要
多價抗體融合蛋白，其包含對于目的抗原具有第一特異性的免疫球蛋白部分，例如Fab或Fab′片段，且進一步包含其為VH/VL對的對于第二目的抗原具有特異性的兩個單域抗體(dAb)，其中所述兩個單域抗體通過二硫鍵連接。還提供的是通過二硫鍵穩定的特定雙特異性抗體融合蛋白及其他抗體片段。
文檔編號C07K16/46GK102549018SQ201080042387
公開日2012年7月4日 申請日期2010年9月24日 優先權日2009年9月25日
發明者L·漢庫克, R·亞當斯, S·P·海伍德 申請人:Ucb醫藥有限公司