專利名稱：赤蘚醇用于預防或治療高血壓的用途的制作方法
技術領域：
本申請涉及赤蘚醇用于上調哺乳動物的S0D2酶和預防或治療高血壓的用途。更具體而言，赤蘚醇防止內皮功能障礙的形成和相關的血管擴張減少，并且赤蘚醇防止溶血誘導的血管收縮。
背景技術：
高血壓(hypertension)或高血壓(high blood pressure)是動脈血壓長期升高的病癥。隨著每一次心跳，心臟將血液通過動脈泵入身體其他部分。血壓是血液對血管壁的推動力。如果壓力過高，心臟泵動的負擔更大，這可能會導致器官損傷和某些疾病，例如心臟病、中風、心力衰竭、動脈瘤或腎衰竭。與高血壓病癥有關的因素包括但不限于吸煙、肥胖癥或超重、糖尿病、久坐的生活方式、缺乏體力活動、代謝綜合征、高水平的鹽攝入、鈣、鉀和鎂消耗不足、維生素D缺乏、大量飲酒、應激、老化、包括口服避孕藥在內的藥物、遺傳和高血壓家族史、慢性腎臟疾病、腎上腺和甲狀腺病癥或某些形式的癌癥。這些因素中有許多涉及以下兩種引起高血壓升高的機制中的一種或兩種(I)內皮功能障礙的形成，以及⑵紅細胞的溶血。內皮功能障礙(ED)是最早的臨床可檢測的心血管疾病階段，其特征為內皮作用向血管舒張減少、促炎狀態和促凝血形成性質(prothrombic properties)的轉變。ED導致高血壓、冠心病、慢性心力衰竭、外周動脈疾病、動脈粥樣硬化、糖尿病、代謝綜合征、肥胖癥、炎癥和慢性腎衰竭。整個循環系統樹襯有上皮樣的一層血管內皮細胞(EC) (Pober等，2009)。盡管不同的解剖部位(包括器官系統和血管類型(即動脈、小動脈、毛細血管、小靜脈、靜脈))的 EC具有不同的特點，但是所有的EC具有使它們區別于其他細胞類型并讓它們完成關鍵的自身穩態功能的共同特點。關鍵的自身穩態功能包括保持血液、調節血流、調節與組織的大分子和液體交換、防止白細胞活化以及協助對病原體的免疫監視。損傷或細胞死亡損害或防止了這些活動的開展，導致功能障礙。大多數內皮細胞死亡是凋亡性的，涉及胱天蛋白酶類的激活，但已有非凋亡性死亡的描述。可引起內皮細胞損傷或死亡的刺激包括環境應激， 例如氧化應激、內質網應激、代謝應激和遺傳毒性應激，以及由先天和適應性免疫系統介導的損傷途徑。溶血是若干疾病的組成部分，例如高血壓、貧血中見到的血管內溶血、微血管病性溶血性貧血、鐮狀細胞病、陣發性睡眠性血紅蛋白尿、地中海貧血、遺傳性球形紅細胞增多癥。溶血相關的高血壓可由不同的機制引起。主要且直接的是由通過向血漿中釋放紅細胞內容物引起的血管收縮引起的。此外，特別是可溶性血紅蛋白和精氨酸酶釋放入血漿導致一氧化氮缺乏和內皮功能障礙的狀態，其與高血壓的臨床形成有關。另一種機制牽涉到腺苷脫氨酶從受損的紅細胞釋放到血漿中，以及腺苷通過腺苷脫氨酶代謝轉化為肌苷，從而降低細胞外腺苷水平。腺苷主要通過腺苷A2A受體的活化來介導減少溶血誘導的血管病變和高血壓風險的各種生物反應。由從受損的紅細胞釋放的腺苷脫氨酶嚴重地削弱了腺苷的血管保護作用。任何對血管內皮功能障礙或紅細胞的溶血的預防都會有助于減少形成高血壓的風險或其治療。發明概述本發明圍繞下述新的意外發現通過暴露于赤蘚醇，細胞中的S0D2表達被顯著上調。赤蘚醇激活了細胞自身的抗氧化機制。該激活或上調提供對內皮的保護作用，防止內皮功能障礙和溶血。內皮功能障礙和溶血之間的因果關系已在本領域中有充分記載。因此，赤蘚醇的這種S0D2上調作用可用作治療或預防高血壓的手段。本發明涉及赤蘚醇用于制備刺激動物或人的S0D2表達的產品或組合物的用途。在本發明的另一個優選的實施方案中，要預防或治療的疾病是內皮功能障礙和內皮功能障礙誘導的高血壓。在本發明的另一個優選的實施方案中，要預防或治療的疾病是紅細胞溶血和溶血誘導的高血壓。在一個特別優選的實施方案中，本發明的目的是預防或治療動物或人的高血壓。本發明包括通過向動物或人施用有效量的赤蘚醇來治療高血壓的方法。本發明還包括通過向動物或人施用有效量的赤蘚醇來預防或治療內皮功能障礙的方法。第三，本發明還包括通過向動物或人施用有效量的赤蘚醇來治療高血糖的并發癥的方法。在另一個優選的實施方案中，上述產品或組合物是口服施用的。此外，所述產品或組合物可配制成藥用產品或組合物，例如是片劑、膠囊、混懸劑、 溶液、散劑或乳劑的形式。特別地，所述產品或組合物可配制成補充了赤蘚醇作為高血壓防護劑的飲料或食品的形式。附圖
簡述圖I顯示血糖正常的大鼠(實心圈)、服用赤蘚醇(lg/kg/天,空心圈)的血糖正常大鼠和糖尿病大鼠(二角形)的卡巴膽喊濃度-響應曲線。圖2顯示糖尿病的大鼠(實心圈)和服用赤蘚醇(lg/kg/天,空心圈)的糖尿病大鼠的卡巴膽堿濃度-響應曲線。圖3顯示赤蘚醇(0_50mM)對AAPH-誘導的溶血的作用。數據點是三個獨立實驗的平均值。曲線經擬合(3參數S形)。赤蘚醇濃度依賴性地使曲線向右偏移。圖4顯示赤蘚醇對內皮細胞的作用，該作用導致錳超氧化物歧化酶(S0D2)轉錄增加。將培養的人臍靜脈內皮細胞(CRL-1730，其可從ATCC獲得)在標準條件下與赤蘚醇一起溫育(5mM，24小時)。通過qPCR測定，暴露于赤蘚醇誘導或刺激S0D2的表達增加到9. 4 倍。發明詳述本發明基于下列新發現(I)赤蘚醇的施用顯著增加重要的抗氧化酶——猛超氧化物歧化酶(S0D2)的表達；以及(2)赤蘚醇能夠延遲和減少紅細胞溶血。這兩個發現提供了高血壓或與之相關的并發癥或疾病的長期預防或治療的治療性策略。S0D2是局限于線粒體的抗氧化酶，但可被釋放到細胞外空間。像發現于細胞質 (SODl)和細胞外(S0D3)的其他SOD—樣，S0D2將超氧自由基轉化為過氧化氫和氧，從而限制超氧自由基的毒性作用。這些自由基可引起脂質過氧化，并可與一氧化氮反應形成反應性過氧亞硝酸鹽，從而將舒血管的一氧化氮轉化成血管毒性的過氧亞硝酸鹽。內皮細胞之中和周圍的超氧自由基在高血壓發病中的重要作用已被公認了約20年。已知S0D2的表達和活性在肺動脈高壓中下降。血管氧化應激也認為是糖尿病和高血壓之間的普遍聯系。我們發現赤蘚醇刺激內皮細胞中S0D2的表達，這一發現與之前的關于超氧自由基在高血壓(的發病)中的作用以及超氧化物岐化酶的抗高血壓作用的大量發現一起清楚地表明赤蘚醇可用于預防和減輕高血壓以及預防溶血。因此，本發明涉及赤蘚醇用于制備預防或治療內皮功能障礙和高血壓的產品或組合物的用途。因此，S0D2酶的上調使糖尿病大鼠血管平滑肌的受損或弱化的內皮依賴性舒張恢復至與在血糖正常大鼠中見到的水平基本相同的水平，并且赤蘚醇能夠延遲和減少紅細胞的溶血。因此，SOD表達增加會有助于維持正常的內皮功能、血管張力和正常的血壓。赤蘚醇是一種多元醇(1，2，3，4_ 丁四醇)，其以少量存在于瓜類和桃中，目前被大量生產，在糕餅、口香糖、飲料和焙烤食品中用作無熱量的、對牙友好的甜味劑。赤蘚醇對血胰島素或葡萄糖水平無影響，這使其成為高血糖患者、尤其是糖尿病患者的有效和安全的食品成分。此外，赤蘚醇可被快速且幾乎完全地從腸道吸收并且能夠通過機體的膜，這使其易于達到發揮其本文所述的抗高血壓作用所需的適當的全身濃度。此外，廣泛的臨床試驗表明，赤蘚醇耐受良好且無消化系統副作用，即使是在大量服用后。例如，已表明高達50g 的沖擊劑量(bolus dose)和聞達80g的日劑量的赤鮮醇耐受良好。在本發明的上下文中，術語“疾病”意在表示動物或人的任何部分、器官、系統或其組合的正常結構或功能的任何偏離或中斷，其表現為特征性的癥狀和體征，并且其病因、病理和預后可能是已知或未知的。本文所用術語“動物”包括除人以外的哺乳動物，例如馬、 豬、牛、鼠、犬或貓科個體。根據本發明，術語“高血糖”是指血清中存在過量的葡萄糖的病癥。生理的血糖水平約為5-7mmol/l。lOmmol/1 (或長期高于7mmol/l)或更高的血糖水平被認為是高血糖的。 異常高的血糖水平由多種原因導致，包括但不限于糖尿病(尤其是I型或II型糖尿病)、 腎上腺機能亢進、垂體機能亢進、副腫瘤綜合征、使用某些藥物的治療(例如β_受體阻滯劑、噻嗪類利尿劑、糖皮質激素、煙酸、噴他脒、某些蛋白酶抑制劑、L-門冬酰胺酶、若干抗精神病藥物)、胰腺疾病、心肌梗死、中風或其他神經系統疾病、腎功能不全、肝功能不全、肢端肥大癥、庫欣綜合征、嗜鉻細胞瘤、甲狀腺功能亢進癥、胰升糖素瘤、淀粉樣變。本發明所用術語“預防”包括(i)任何避免動物或人形成疾病的活動，所述人或動物易患所述疾病但尚未診斷患有所述疾病；以及(ii)任何目的在于疾病早期檢測從而提高實施干預以防止疾病進展和癥狀出現的機會的活動。此外，本文所用術語“治療”覆蓋了
(i)任何通過抑制疾病來抵抗所述疾病(即阻止所述疾病的進展)的活動，以及(ii)任何減輕所述疾病(即導致所述疾病消退或消失)的活動。需要所述預防或治療的個體是哺乳動物個體，即人或任何其他分類為哺乳動物的動物，包括家養動物和農場動物，以及動物園、體育或寵物動物，例如狗、貓、牛、綿羊、豬、山羊、兔等。優選地，所述需要預防或治療的個體是人。在本發明的一個優選的實施方案中，要預防或治療的疾病是內皮功能障礙和內皮功能障礙誘導的高血壓。在本發明的另一個優選的實施方案中，要預防或治療的疾病是紅細胞溶血或溶血誘導的高血壓。根據本發明，術語“內皮功能障礙”是指通常特征為內皮介導的平滑肌血管舒張或松弛受損、衰減或甚至喪失的病癥。“內皮”表示襯在脈管、尤其是血管內表面并構成腔內循環血和管壁之間的界面的內皮細胞層。因此，換句話說，術語“內皮功能障礙”是指內皮依賴性血管舒張能力下降。根據術語“內皮功能障礙”的一個優選的含義，表示冠狀動脈循環或外周循環對乙酰膽堿或其他M3受體激動劑的內皮依賴性血管舒張能力下降。在一個特別優選的實施方案中，本發明涉及高血壓的預防或治療，其中所述高血壓與糖尿病有關。“與糖尿病有關”尤其表示包括“由糖尿病引起”。赤蘚醇尤其可用于預防或治療動物或人的高血壓。根據本發明，所述產品或組合物可通過多種途徑施用。對施用途徑沒有特別的限制，并由劑型、要預防或治療的動物或人的情況例如年齡、性別和疾病程度決定。例如，所述產品或組合物可通過口服、腸胃外、皮下、靜脈內、肌肉內、吸入噴霧、局部、直腸、經鼻、含服、陰道或透皮施用。由于赤蘚醇被快速且幾乎完全地從腸道吸收，優選的施用途徑是口服。本發明的產品或組合物最優選被配制成以下形式飲料、食品或任何其他針對患有長期血糖水平升高的人或動物亞群的口服使用的產品。本文所用術語“飲料”是指專為動物或人服用而制備的飲料，其主要由水組成。用于本發明的飲料的實例包括現有的或新開發的軟飲料、乳飲料、果汁系飲料及其混合物。本文所用術語“食品”包括任何現有的或新開發的除飲料以外的旨在被動物或人攝入的食品。赤蘚醇的優點在于其易于加入到食品、飲料或其他口服的產品中，例如通過將特定的現有或新開發的飲料或食品與赤蘚醇一起簡單混合。如上文所述，赤蘚醇尤其適合加入到飲料和食品中，因為其被快速且幾乎完全地從腸道吸收，耐受良好且無消化系統不良反應，即使是在大量服用后。此外，赤蘚醇不是全身代謝的，因此可以繼續產生其在體內的有益作用，所述有益作用是該專利申請的主題。在施用赤蘚醇后約3天，其隨尿液完全排泄。本發明的產品或組合物也可配制成供人類或動物服用的藥用產品或組合物的形式。本文所用術語“藥用產品或組合物”是指當向患者適當施用時能誘導期望的治療作用的化學產品或組合物，并且其配制是通過將赤蘚醇和任選存在的其他活性成分與一種或多種公知的選自生理上可接受的載體、稀釋劑和通常摻入藥物制劑中以提供改良的轉移、遞送、 耐受等的其他試劑混合來進行的。此外，所述藥用產品或組合物也可包含諸如抗氧化劑、分散劑、乳化劑、調味劑、甜味劑、著色劑和防腐劑的化合物。本發明的藥用產品或組合物的適當形式包括例如固體劑型，如散劑、片劑、丸劑、 膠囊、扁囊劑(cachet)、栓劑和顆粒劑，以及液體形式，例如溶液、糖漿、混懸劑和乳劑。所述藥用產品或組合物的適當形式主要由施用途徑、期望的釋放特征和其他因素例如活性物質和藥用賦形劑的不相容性決定。藥物制劑領域的技術人員能夠參考已知的材料和工藝參數以常規的方式選擇所述形式和制備方法。例如，對于口服施用而言，片劑可含有載體，例如但不限于多元醇、乳糖和玉米淀粉，和/或潤滑劑，如硬脂酸鎂。此外，膠囊可含有稀釋劑， 包括但不限于多元醇、乳糖和干燥的玉米淀粉。此外，水溶液或混懸劑可含有乳化劑和助懸劑。已知赤蘚醇在高達約50g的單劑量和高達80g的日劑量下耐受良好。因為該耐受水平，所以可以預期赤蘚醇在很寬的日劑量范圍內顯示陽性作用，例如從每千克動物或人體重lmg-2500mg。優選的劑量包括每千克體重2mg-1000mg。優選地,本發明的含赤蘚醇的產品或組合物是單位劑型的形式。在此類劑型中，所述產品或組合物被分成含有適量赤蘚醇的單位劑量。單位劑量中的赤蘚醇的量可為10mg-50000mg，優選1000mg-25000mg。該水平的劑量可易于通過口服普通的食品、飲料或糖果產品獲得。例如，200克含有10%的赤蘚醇的酸奶會容易地提供20克的劑量。可制備含有赤蘚醇的小硬糖果或片劑，且各自含有 O. 5-5克。飲料通常可包含O. 5% -20%的赤蘚醇，并會方便地提供1-40克的單劑量。特定動物或人的具體日劑量會隨多種因素變化，包括所述動物或人的年齡、體重、 一般身體狀況、性別和飲食，以及施用形式和時間。確定合適劑量的因素是本領域技術人員公知的。根據本發明，可使用并視需要重復任何調節施用時間和順序的施用方案，以實現預防或治療高血壓及由其引起的疾病。此外，本發明的含赤蘚醇的產品或組合物可與一種或多種其他活性劑聯合施用。或者或此外，本發明的產品或組合物可含有一種或多種其他活性劑。現通過實施例說明本發明，所述實施例不應認為是對本發明的限制。實施例I下面，本發明的發明人通過體內實驗證實了赤蘚醇用于預防或治療內皮功能障礙誘導的高血壓的用途。在這些體內實驗中，研究了接受正常飲水或補充了赤蘚醇的水的血糖正常大鼠或糖尿病大鼠的內皮依賴性平滑肌舒張。更具體而言，在器官浴中使用胸主動脈(主動脈環)的切片測定了赤蘚醇對內皮功能的作用。通過用α-腎上腺素能受體激動劑去氧腎上腺素(PE)刺激引起收縮，隨后，通過測定毒蕈堿受體激動劑卡巴膽堿(CAR)的濃度-響應曲線來分析內皮依賴性舒張。最后,通過加入釋放NO從而繞過內皮的NO生成的化合物硝普鈉(SNP)誘導最大舒張。 結果發現糖尿病大鼠中響應血管舒張劑卡巴膽堿的內皮依賴性舒張顯著下降。赤蘚醇的施用導致對CAR的舒張反應，其與血糖正常大鼠中的舒張反應基本相同。因此，所進行的體內實驗(在下文中進一步描述)表明鑒定了一種通過以適當的施用模式和量向患有長期高血糖水平的動物或人(例如患有糖尿病的動物或人)施用赤蘚醇來預防或治療高血壓的新治療策略。試驗方法這些體內研究使用了 20只Wistar大鼠(10只雄的，10只雌的，體重200_250g)， 這些體內研究是經馬斯特里赫特大學動物倫理委員會批準進行的。大鼠由Charles River Nederland BV提供，并保持在標準條件下，其中不加限制地提供標準食物 (Ssniff Spezialdiaten GmbH, Soest, Germany)和酸化的飲用水。根據 Hasselbaink 等人的實驗方案誘導糖尿病，根據所述實驗方案，大鼠用氟烷麻醉，隨后通過尾靜脈注射70mg/kg 含鏈脲霉素(STZ)的檸檬酸緩沖液(100mM，pH 4. 5)進行處理。對照僅接受檸檬酸緩沖液。 7 天后，使用血糖儀(LIFESCAN BV, Maastricht, Netherlands)測定血糖。將由此獲得的10只糖尿病大鼠分成兩組1)糖尿病大鼠，其接受正常的飲用水 (組D，N = 5)，和2)糖尿病大鼠，其持續21天接受補充了赤蘚醇的水(組DE，N= 5)。10 只非糖尿病大鼠也分成兩組1)血糖正常大鼠，其接受正常的飲用水(組N，N= 5)，和2) 血糖正常大鼠，其持續21天接受補充了赤蘚醇的水(組NE，N=5)。監測每只大鼠飲用的溶液量，并每日重新調整赤蘚醇溶液的濃度以保證組NE和DE的每只大鼠每日消耗每千克體重Ig赤蘚醇。不加限制地給予另兩組(N和D)正常的飲用水。每周測定大鼠的體重和血糖水平。3周后，大鼠用C02/02處死，并通過靜脈穿刺快速收集血液。隨后切除主動脈的胸部部分并立即放置在Krebs-Ringer 緩沖液中(118mM NaCl,4. 4mM KC1，2. 5mM CaCl2,1. 2mM KH2PO4,1. 2mM MgSO4, IOmM葡萄糖和25mM NaHCO3)，隨后除去多余的脂肪和結締組織。切取長約4mm的環,并安放在處于裝有Krebs-Ringer緩沖液的20ml器官浴中的不銹鋼鉤之間， 在37 °C下保存，并通入95% 02-5% CO2。將等長的力傳感器(Grass FT03)連接到每個條帶上，然后將靜止張力恒定地調節至I. Og持續60分鐘。使用去氧腎上腺素(PE ；10μΜ)和卡巴膽堿(CAR5IOO μ Μ)檢查組織的完整性，隨后清洗30分鐘。隨后用去氧腎上腺素(10 μ Μ)使主動脈環進行次于極限的收縮。當建立穩定的收縮時，記錄卡巴膽堿濃度-響應曲線(ΙΟηΜ-ΙΟΟμΜ)。當在最后一次加入卡巴膽堿后獲得穩定的舒張時，向器官浴中加入硝普鈉(SNP，100yM)以誘導最大舒張。結果與對照大鼠的6.7±0.2mM相比，用鏈脲菌素(STZ)處理后7天所測得的STZ糖尿病大鼠的血糖水平升高到了 25.0±1.4禮。通過測定分離的主動脈環對去氧腎上腺素 (PE)、卡巴膽堿(CAR)和硝普鈉(SNP)的響應測定了 4個不同實驗組(N，NE，D和DE)的內皮功能。結果不于表I中。激1主動脈反應性測定
權利要求
1.赤蘚醇用于制備刺激S0D2表達的產品或組合物的用途。
2.赤蘚醇用于制備預防或治療內皮功能障礙或溶血的產品或組合物的用途。
3.赤蘚醇用于制備預防或治療高血壓的產品或組合物的用途。
4.權利要求3的用途，其中預防或治療的高血壓是內皮功能障礙誘導的高血壓。
5.權利要求3的用途，其中預防或治療的高血壓是溶血誘導的高血壓。
6.權利要求2的用途，其中內皮功能障礙與高血糖、糖尿病、代謝綜合征、心血管疾病、 肥胖癥、動脈粥樣硬化或炎癥有關。
7.權利要求2的用途，其中所述溶血與冠狀動脈疾病、慢性心力衰竭、外周動脈疾病、 動脈粥樣硬化、糖尿病、代謝綜合征、肥胖癥、炎癥和慢性腎衰竭有關。
8.權利要求1-7之一的用途，其中所述產品或組合物是口服施用的。
9.權利要求8的用途，其中所述產品或組合物是飲料或食品。
10.權利要求8的用途，其中所述產品或組合物是藥用產品或組合物。
全文摘要
本申請涉及赤蘚醇用于上調哺乳動物的SOD2酶和預防或治療高血壓的用途。更具體而言，赤蘚醇防止內皮功能障礙的形成和相關的血管擴張減少，并且赤蘚醇防止溶血誘導的血管收縮。
文檔編號C07C31/18GK102596872SQ201080041343
公開日2012年7月18日 申請日期2010年7月26日 優先權日2009年7月27日
發明者A·巴斯特, A·貝格爾, G·J·M·登哈爾托赫, P·W·H·A·德科克 申請人:嘉吉公司