專利名稱：Fgf21突變體及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及編碼FGF21突變體多肽的核酸分子、FGF21突變體多肽、包含FGF21突變體多肽的藥物組合物和使用這類核酸、多肽或藥物組合物用于治療代謝紊亂的方法。
背景技術：
FGF21是屬于包括FGF19、FGF21和FGF23的成纖維細胞生長因子(FGF)亞家族的分泌多肽(Itoh等，2004，Trend Genet. 20 :563-69)。FGF21是非典型的FGF，因為它不依賴于肝素，并且在葡萄糖、脂質和能量代謝的調節中起激素的作用。 從肝cDNA文庫中分離出作為肝分泌因子的FGF21。它在肝和胰腺中高表達，并且是主要在肝中表達的FGF家族的唯一成員。過量表達FGF21的轉基因小鼠具有生長速率緩慢、血漿葡萄糖和甘油三酯水平低下的代謝表型，并且不存在年齡相關性2型糖尿病、胰島增大和肥胖癥。在嚙齒動物和靈長類模型中藥理性給予重組FGF21蛋白導致血漿葡萄糖水平正常化、甘油三酯和膽固醇水平降低以及葡萄糖耐量和胰島素敏感性得到改善。另外，FGF21通過增加能量消耗、體力活動和代謝率而減輕體重和體脂肪。實驗研究為藥理性給予FGF21以治療人的2型糖尿病、肥胖癥、血脂異常(dyslipidemia)和其它代謝病況或代謝紊亂提供了支持。人FGF21具有短的體內半壽期。在小鼠中，人FGF21的半壽期為1-2小時，在食蟹猴(cynomolgus monkey)中，半壽期為2. 5_3小時。在開發在2型糖尿病的治療中用作治療劑的FGF21蛋白時，可能需要延長半壽期。具有半壽期延長的FGF21蛋白可允許較低頻率地給予待給予該蛋白質的患者。本文中描述了這類蛋白質。發明概述本發明公開ー種分離的多肽，包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列，并且還包含(a)至少ー個在180位的氨基酸取代；和(b)選自以下的至少ー個氨基酸取代(i)在171位的取代；和(ii)在98位的取代；以及(c)它們的組合。在一個實施方案中，分離的多肽包含在98位的取代和在180位的取代，并且其中
(a)所述在98位的取代選自精氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸和蘇氨酸；和(b)所述在180位的取代選自甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸或谷氨酸；以及(c)它們的組合。在ー個實施方案中，98位的殘基是精氨酸并且180位的殘基是谷氨酸。還提供了ー種融合多肽，包含與異源氨基酸序列融合的分離的多肽。在一個實施方案中，異源氨基酸序列是Fe結構域或其片段，并且可包含SEQ ID N0:11的氨基酸序列。在另ー實施方案中，多肽通過接頭與Fe結構域融合，以及在又一實施方案中，接頭包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO :31)。在一個特定實施方案中，多肽包含SEQ ID N0:47。還公開了一種多聚體，包含兩個或更多個融合多肽。也公開ー種藥物組合物，包含分離的多肽和諸如水凝膠等藥學上可接受的配制劑(formulation agent)。在另一方面,提供了ー種治療代謝紊亂的方法以及在一個實施方案中，該方法包括向有需要的人患者給予本文提供的藥物組合物。在一個實施方案中，代謝紊亂是糖尿病和在另ー個中，代謝紊亂是肥胖癥。也提供了編碼分離的多肽的核酸，以及在一個實施方案中核酸包含SEQ ID NO :46。核酸可存在于載體中,所述載體可自身存在于宿主細胞中。在又一實施方案中，多肽包含(a)不超過8個氨基酸殘基的氨基末端截短，其中多肽能夠降低哺乳動物的血糖；(b)不超過12個氨基酸殘基的羧基末端截短，其中多肽能夠降低哺乳動物的血糖；或(c)不超過8個氨基酸殘基的氨基末端截短和不超過12個氨基酸殘基的羧基末端截短，其中多肽能夠降低哺乳動物的血糖。還在其它的實施方案中，多肽共價連接一種或多種聚合物，例如PEG。在另ー實施方案中，分離的多肽包含在171位的取代和在180位的取代，并且其中(a)所述在180位的取代選自甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸和谷氨酸；(b)所述在171位的取代選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸和酪氨酸；以及(c)它們的組合。在一個實施方案中，在171位的殘基是甘氨酸和在180位的殘基是谷氨酸。也提供ー種融合多肽，包含與異源氨基酸序列融合的分離的多肽。在一個實施方案中，異源氨基酸序列是Fe結構域或其片段，并且可包含SEQ ID NO :11的氨基酸序列。在另ー實施方案中，多肽通過接頭與所述Fe結構域 融合，以及在另ー實施方案中，接頭包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO 31)。在ー個特定實施方案中，多肽包含SEQ ID NO 470還公開一種多聚體，包含兩個或更多個融合多肽。也公開ー種藥物組合物，包含分離的多肽和諸如水凝膠等藥學上可接受的配制劑。在另一方面，提供ー種治療代謝紊亂的方法，以及在一個實施方案中，該方法包括給有需要的人患者給予本文提供的藥物組合物。在一個實施方案中，代謝紊亂是糖尿病和在另ー個中，代謝紊亂是肥胖癥。也提供了編碼分離的多肽的核酸，以及在一個實施方案中核酸包含SEQ IDN0:46。核酸可存在于載體中，所述載體可自身存在于宿主細胞中。在又一實施方案中，多肽包含(a)不超過8個氨基酸殘基的氨基末端截短，其中多肽能夠降低哺乳動物的血糖；
(b)不超過12個氨基酸殘基的羧基末端截短，其中多肽能夠降低哺乳動物的血糖；或(c)不超過8個氨基酸殘基的氨基末端截短和不超過12個氨基酸殘基的羧基末端截短，其中多肽能夠降低哺乳動物的血糖。還在其它的實施方案中，多肽共價連接ー種或多種聚合物，例如 PEG。在又一實施方案中，多肽包含SEQ ID NO :4的在98位的取代、在171位的取代和在180位的取代，并且其中(a)在171位的取代選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸或酪氨酸；(b)在98位的取代選自精氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸或蘇氨酸；以及(c)在180位的取代選自甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸或谷氨酸；及其組合。在又一個實施方案中，在98位的殘基是精氨酸，在171位的殘基是甘氨酸和在180位的殘基是谷氨酸。也提供ー種融合多肽，包含與異源氨基酸序列融合的分離的多肽。在一個實施方案中，異源氨基酸序列是Fe結構域或其片段，并且可包含SEQ ID NO :11的氨基酸序列。在另ー實施方案中，多肽通過接頭融合至所述Fe結構域，以及在另ー實施方案中，接頭包含GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:
31)。在ー個特定實施方案中，多肽包含SEQ ID N0:47。還公開一種多聚體，包含兩個或更多個融合多肽。也公開ー種藥物組合物，包含分離的多肽和諸如水凝膠等藥學上可接受的配制劑。在另一方面，提供ー種治療代謝紊亂的方法，以及在一個實施方案中，該方法包括給有需要的人患者給予本文提供的藥物組合物。在一個實施方案中，代謝紊亂是糖尿病和在另ー個中，代謝紊亂是肥胖癥。也提供了編碼分離的多肽的核酸，以及在一個實施方案中核酸包含SEQ ID N0:46。核酸可存在于載體中，所述載體可自身存在于宿主細胞中。在又一實施方案中，多肽包含(a)不超過8個氨基酸殘基的氨基末端截短,其中多肽能夠降低哺乳動物的血糖；(b)不超過12個氨基酸殘基的羧基末端截短，其中多肽能夠降低哺乳動物的血糖；或(c)不超過8個氨基酸殘基的氨基末端截短和不超過12個氨基酸殘基的羧基末端截短，其中多肽能夠降低哺乳動物的血糖。還在其它的實施方案中，多肽共價連接ー種或多種聚合物，例如PEG。根據下面某些實施方案更詳細的說明和權利要求書，本發明的具體實施方案將是顯而易見的。附圖簡述
圖1A-1B顯示對FGF21截短突變體7_181和8_181 (圖1A)及FGF21截短突變體1-172、1-171、1-169和1-164(圖1B)進行的ELK-螢光素酶活性測定結果；各圖表示所得到的對于人FGF21対照的結果。圖2 顯示對人FGF21 對照及 FGF21 截短突變體 3-181、4-181、5-181、7-181、8-181、1-180、1-178、1-177、1-176、1-175、1-174、1-173、1-172、9-181 和 1-149 進行的 ELK-螢光素酶活性測定結果。圖3顯示在注射PBS (實心條形柱)、人FGF21對照(空心條形柱)或FGF21截短突變體8-181 (灰色條形柱)和9-181 (點狀條形柱)的小鼠中測定的血糖水平。圖4顯示在注射PBS (實心圓)、Fc_FGF21對照(WT)(空心圓)或者包含氨基酸殘基5-181 (實心三角)或7-181 (空心三角)的截短FC-FGF21融合蛋白的小鼠中測定的血糖水平變化百分比。圖5顯示在注射PBS (實心圓)、FGF21-Fc對照(WT)(空心圓)、包含殘基1-175的截短FGF21-FC融合蛋白(實心三角)或包含氨基酸殘基1-171的截短FC-FGF21蛋白(空心三角)的小鼠中測定的血糖水平變化百分比。圖6A-6D 顯示人 Fc-(G5)-FGF21 (SEQ ID NO :107)對照樣品(圖 6A)和注射后 6小時(樣品D6 ;圖6B)、24小時(樣品D24 ;圖6C)和48小時(樣品D48 ;圖6D)從小鼠中抽取的Fc-(G5)-FGF21樣品的液相色譜-質譜法(LC-MS)分析結果。圖7A-7D顯示哺乳動物衍生的人FGF21-(G3)-Fc(SEQ ID NO :105)對照樣品(圖7A)和注射后6小時(樣品E6 ；圖7B)、24小時(樣品E24 ；圖7C)和48小時(樣品E48 ；圖7D)從小鼠中抽取的FGF21-(G3)-Fc樣品的LC-MS分析結果。圖8A-8D 顯示 Fc-(L15)-FGF21 (SEQ ID NO :49)對照樣品(圖 8A)和注射后 6 小時(圖8B)、24小時(圖8C)和48小時(圖8D)從小鼠中抽取的Fe-(L15)-FGF21樣品的LC-MS分析結果。圖9A-9D 顯示 FGF21-(L15)-Fe (SEQ ID NO 41)對照樣品(圖 9A)和注射后 6 小時(圖9B)、24小時(圖9C)和48小時(圖9D)從小鼠中抽取的FGF21-(L15)-Fe樣品的LC-MS分析結果。圖10A-10B 顯示由注射入小鼠的 Fc-(L15)-FGF21(圖 10A, SEQ ID NO 49)和FGF21-(L15)-Fc (圖10B, SEQ ID NO 41)融合蛋白的LC-MS分析而鑒定出的切割位點。
圖11顯示在注射PBS (實心條形柱)、Fc-(L15)-FGF21 (SEQ IDNO :49)(空心條形柱)或者 Fc-(L15)-FGF21 突變體 Fc-(L15)-FGF21 G170E(SEQ ID NO :51)(灰色條形柱)、Fc-(L15)-FGF21 P171A(SEQ ID NO :53)(點狀條形柱)、Fe-(L15)-FGF21 S172L(SEQ IDNO :55)(空心斜線交叉條形柱)、Fc-(L15)-FGF21(G170E, P171A, S172L) (SEQ ID NO :59)(實心水平交叉條形柱)或Fc-(L15)-FGF21G151A(SEQ ID NO :61)(空心斜線交叉條形柱)的小鼠中測定的血糖水平。圖12 顯示在注射 PBS(實心圓)、Fc-(L15)-FGF21(SEQ ID NO :49)(空心圓)、或者 Fc-(L15)-FGF21 突變體 Fe-(L15)-FGF21 G170E(SEQ IDNO :51)(實心三角)、Fc-(L15)-FGF21 P171A(SEQ ID NO :53)(空心三角)、Fe-(L15)-FGF21 S172L(SEQ ID NO:55)(實心菱形)、Fc-(L15)-FGF21(G170E，P171A, S172L) (SEQ ID NO :59)(空心菱形)或Fc-(L15)-FGF21 G151A(SEQ ID NO :61)(實心方形)的小鼠中測定的血糖水平變化百分比。圖13顯示在注射PBS (實心條形柱)、Fc-(L15)-FGF21 (SEQ IDNO :49)(空心條形
柱)、或者 Fc-(L15) -FGF21 突變體 Fc_(L15) -FGF21 (P150A，G151A，I152V)(灰色條形柱)、Fe-(L15)-FGF21G170E(SEQ ID NO 51)(空心斜線交叉條形柱)、Fe-(L15)-FGF21 (G170E，P171A) (SEQ ID NO :63)(灰色斜線交叉條形柱)、或 Fc-(L15)-FGF21(G170E，S172L) (SEQIDNO 67)(空心斜線交叉條形柱)的小鼠中測定的血糖水平。圖14 顯示在注射 PBS (實心方形)、Fc-(L15)-FGF21 (SEQ IDNO :49)(空心方形)、或者Fc-(L15)-FGF21 突變體Fc-(L15)-FGF21(P150A，G151A，I152V) (SEQ ID NO :65)(實心倒三角)、Fc-(L15)-FGF21 G170E(SEQ ID NO :51)(空心倒三角)、Fe-(L15)-FGF21 (G170E，P171A) (SEQ IDNO 63)(實心圓)或 Fe-(L15)-FGF21 (G170E，S172L) (SEQ ID NO 67)(空心圓)的小鼠中測定的血糖水平變化百分比。圖15顯示在注射PBS(實心條形柱)或者Fc-(L15)-FGF21突變體Fc-(L15)-FGF21G170E(SEQ ID NO :51)(空心條形柱)、Fc-(L15)_FGF21G170A(SEQ ID NO :69)(灰色條形柱)、Fc-(L15)-FGF21 G170C(SEQ IDNO :71)(空心交叉條形柱)、Fe-(L15)-FGF21Gl7OD (SEQ ID NO:73)(灰色與白色條形柱)、Fc-(Ll5)-FGF2I Gl7ON (SEQ ID NO :75)(實心交叉條形柱)、或者Fc-(L15)-FGF21 G170S(SEQ ID NO :77)(空心交叉條形柱)的小鼠中測定的血糖水平。圖16顯示在注射PBS(實心圓)或者Fc-(L15)-FGF21突變體Fc-(L15)-FGF21G170E(SEQ ID NO :51)(空心圓)、Fe-(L15)-FGF21 G170A(SEQ ID NO :69)(實心三角)、Fe- (L15) -FGF21G170C (SEQ ID NO :71)(空心三角)、Fe- (L15) -FGF21G170D (SEQID NO 73)(實心菱形)、Fe- (L15) -FGF21G170N (SEQ ID NO 75)(空心菱形)、或者Fc-(L15)-FGF21G170S(SEQ ID NO :77)(實心倒三角)的小鼠中測定的血糖水平變化百分比。圖17顯示在注射PBS(實心條形柱)或者Fc-(L15)_FGF21突變體Fe-(L15)-FGF21G170E(SEQ ID NO :51)(空心條形柱)、Fe-(L15)-FGF21P171E(SEQID NO :79)(灰色條形柱)、Fc-(L15)-FGF21P171H(SEQ IDNO :81)(實心交叉條形柱)Fc-(L15)-FGF21P171Q(SEQ ID NO :83)(空心交叉條形柱)、Fe-(L15)-FGF21P171T (SEQ IDNO :85)(點狀條形柱)、或者Fc-(L15)-FGF21P171Y(SEQ ID NO :87)(灰色交叉條形柱)的小鼠中測定的血糖水平。
圖18顯示在注射PBS(實心圓)或者Fc-(L15)_FGF21突變體Fe-(L15)-FGF21G170E(SEQ ID NO :51)(空心圓)、Fe-(L15)-FGF21P171E(SEQID NO 79)(實心三角)、Fc-(L15)-FGF21P171H(SEQ ID NO :81)(空心三角)、Fe-(L15)-FGF21P171Q(SEQ ID NO :83)(實心菱形)、Fc-(L15)_FGF21P171T(SEQ ID NO :85)(空心菱形)、或者Fc-(L15)-FGF21P171Y(SEQ ID NO :87)(實心方形)的小鼠中測定的血糖水平變化百分比。圖19A-19D 顯示 Fe-(L15)-FGF21 對照樣品(圖 19A, SEQ ID NO 49)和注射后 6 小時(圖19B)、24小時(圖19C)和48小時(圖19D)從小鼠中抽取的樣品的LC-MS分析結果。圖 20A-20D 顯示 Fe-(L15)-FGF21G170E 對照樣品(圖 20A，SEQ IDNO :51)和注射后6小時(圖20B)、24小時(圖20C)和48小時(圖20D)從小鼠中抽取的Fc-(L15)-FGF21G170E 樣品的 LC-MS 分析結果。圖21A-21D 顯示 Fe-(L15)-FGF21P171A 對照樣品(圖 21A, SEQ IDNO 53)和注射后6小時(圖21B)、24(圖21C)、48小時(圖21D)從小鼠中抽取的Fe-(L15)-FGF21P171A樣品的LC-MS分析結果。圖 22A-22D 顯示 Fe-(L15)-FGF21S172L 對照樣品(圖 22A，SEQ IDNO : 55)和注射后6小時(圖22B)、24小時(圖22C)和48小時(圖22D)從小鼠中抽取的Fc-(L15)-FGF21S172L 樣品的 LC-MS 分析結果。圖23A-23D 顯示由注射入小鼠中的 Fe-(L15)-FGF21 (圖 23A, SEQ IDNO 49)、Fc-(L15)-FGF21G170E (圖 23B，SEQ ID NO :51)、Fc_ (L15)-FGF21P171A (圖 23C，SEQ ID NO:53)和Fc-(L15)-FGF21S172L(圖23D，SEQ IDNO :55)融合蛋白的LC-MS分析而鑒定出的切割位點。圖 24A-24C 顯示對 FGF21 突變體 FGF21L99R(SEQ ID NO :109)、FGF21L99D (SEQ IDNO 111)和 FGF21A111T(SEQ ID NO :113)(圖 24A) ；FGF21 突變體 FGF21A129D (SEQ ID NO 115)、FGF21A129Q(SEQ IDNO :117)和 FGF21A134K (SEQ ID NO :119)(圖 24B);以及 FGF21突變體 FGF21A134Y(SEQ ID NO :121)、FGF21A134E (SEQ ID NO :123)和 FGF21A129K (SEQ IDNO 125)(圖24C)進行的ELK-螢光素酶活性測定結果；各圖表示所得到的對于人FGF21對照的結果。圖 25A-25D 顯示對 Fe-(L15)-FGF21 突變體 Fe-(L15)-FGF21P171G (SEQ IDNO :89)、Fc-(L15)-FGF21 P171S(SEQ ID NO :91)和 Fe-(L15)-FGF21P171T (SEQ IDNO 85)(圖 25A) ；Fc-(L15)-FGF21 突變體 Fe-(L15)-FGF21P171Y(SEQ ID NO :87)、Fe- (L15)-FGF2IP17Iff(SEQ IDNO :93)和 Fe-(L15)-FGF21P171C(SEQ ID NO :95)(圖 25B)；Fc-(L15)-FGF21 (SEQ ID NO :49)、Fe-(L15)-FGF21 (A45K、G170E) (SEQ IDNO :97)和 FGF21A45K(SEQ ID NO :99)(圖 25C);以及 Fe-(L15)-FGF21 (SEQ ID NO :49)、Fe-(L15)-FGF21P171E(SEQ ID NO :79)和 Fe-(L15)-FGF21 (A45K、G170E) (SEQ ID NO :97)(圖 25D)進行的ELK-螢光素酶活性測定結果；各圖表示所得到的對于人FGF21対照的結果。圖26A-B顯示野生型成熟FGF21和各種FGF21突變體隨時間而變化的聚集；圖26A顯示將65mg/mL蛋白質在4°C下溫育I天、2天和4天后FGF21對照(WT，實心菱形)和FGF21A45K(實心圓)的聚集百分比變化，而圖26B顯示將65mg/mL蛋白質在4°C下溫育 I 天、6 天和 10 天后 FGF21 對照(WT) (SEQ ID NO 4)和 FGF21P78C (SEQ ID NO :127)、FGF21P78R(SEQ ID NO : 129)、FGF21L86T (SEQ ID NO : 131)、FGF21L86C (SEQ ID NO :133)、FGF21L98C(SEQ ID NO :135)、FGF21L98R (SEQ ID NO :137)、FGF21A111T(SEQ ID NO :113)、FGF21A129D(SEQ IDNO :115)、FGF21A129Q (SEQ ID NO :117)、FGF21A129K (SEQ IDNO :125)、FGF21A134K(SEQ ID NO :119)、FGF21A134Y (SEQ ID NO :121)和 FGF21A134E (SEQ ID NO:123)(在圖中均有標記)的聚集百分比變化。圖27 顯示對人 FGF21 對照和 FGF21 突變體 FGF21A45K (SEQ IDNO :99)、FGF21L52T(SEQ ID NO :139)和 FGF21L58E (SEQ ID NO :141)進行的 ELK-螢光素酶活性測
定結果。圖28A圖示在4 °C下溫育I天、4天和8天后Fe-(L15)-FGF21突變體Fe-(L15)-FGF21 (6-181，G170E) (SEQ ID NO :101)(實心菱形)、Fe-(L15)-FGF21 (A45K, G170E) (SEQ ID NO :97)(空心方形)、Fe-(L15)-FGF21P171E(SEQ ID NO :79)(實心三角)、Fc-(L15)-FGF21P171A(SEQ ID NO :53)(交叉線)、Fe-(L15)-FGF21G170E (SEQ IDNO 51)(空心三角)和FGF21對照(實心圓)聚集水平的變化，圖28B是同樣顯示溫育結果的柱狀圖。圖29顯示在注射PBS(溶媒)(實心圓)或者Fc-(L15)_FGF21突變體Fc-(L15)-FGF21(A45K, G170E) (SEQ ID NO :97)(空心圓)、Fe-(L15)-FGF21 (A45K，P171G)(SEQ ID N0:103)(實心三角)、或者 Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)(空心三角)的小鼠中測定的血糖水平。圖30 圖示對人 FGF21(實心圓，實線)、Fe-(L15)-FGF21 (SEQ IDNO 49)(空心圓，實線)和 Fc-(L15)FGF21(L98R，P171G) (SEQ IDNO :43)(實心三角，虛線)進行的 ELK-螢光素酶活性測定結果。圖31圖示在室溫(圖31A)和4 °C (圖31B)下9天后觀察到的FGF21 (SEQID NO 4)(實心圓，實線)、Fc-(L15)-FGF21(SEQ ID NO :49)(空心圓，實線)和Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)(實心三角，虛線)的高分子量聚集物百分比。圖32是顯示在168小時時間內在各個時間點上觀察到的Fe-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO 43)變化的系列MALDI質譜跡線。圖33圖示ob/ob小鼠中由PBS溶媒對照(空心圓)、野生型成熟FGF21 (實心方形)、以及 FGF21 突變體 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)(SEQ IDNO :43)(實心倒三角)；Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G，182P) (SEQ IDNO :143)(空心菱形)和Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G，182G) (SEQ IDNO :145)(實心圓)中的每ー種所引起的血糖水平變化百分比。圖34圖示ob/ob小鼠中由PBS溶媒對照(實心圓)及FGF21突變體Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)(SEQ ID NO :43)(實心三角)；Fc-(L15)-FGF21(L98R,P171G, 182G, 183G) (SEQ ID NO :147)(空心三角)、Fe-(L15)-FGF21 (L98R，P171G，182G) (SEQID NO 145)(實心菱形)和 Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G，182P) (SEQ ID NO :143)(空心菱形)中的每ー種所引起的血糖水平變化百分比。圖35圖示ob/ob小鼠中PBS溶媒對照(空心圓)及FGF21突變體Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)(SEQ ID NO :43)(實心方形)；Fc-(L15)-FGF21(L98R,P171G, Y179S) (SEQ ID NO :149)(空心三角)、Fe-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179A) (SEQID NO :153)(實心倒三角)、Fe-(L15)-FGF21(L98R，P171G，A180S) (SEQ ID N0:155)(空心菱形)和 Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G，A180G) (SEQ ID NO :157)(實心圓)中的每ー種所引起血糖水平變化百分比。圖36圖示ob/ob小鼠中PBS溶媒對照(實心圓)和FGF21突變體Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)(SEQ ID NO :43)(空心方形)；Fc-(L15)-FGF21(L98R,P171G，Y179F) (SEQ ID NO :151)(實心三角)和 Fe-(L15)-FGF21 (L98R，P171G，A180E) (SEQID NO :57)(空心菱形)中的每ー種所引起的血糖水平變化百分比。圖37圖示稱猴(Rhesus monkey)中進行6周劑量遞增研究的研究設計簡圖；圖中，陰影符號表示在空腹狀態下抽血，點狀符號表示在進食狀態下抽血。圖38A-D是描述獼猴在OGTT分布曲線、OGTT AUC和體重方面如何隨機化的系列 圖；圖38ム表示在化合物或溶媒分配給各組前在OGTTl中的基線葡萄糖水平，實心方形對應于A組，實心圓、實線對應于B組，和空心圓、短劃線對應于C組；圖38B表示在化合物或溶媒分配給各組前，在0GTT2中的基線葡萄糖水平，實心方形對應于A組，實心圓、實線對應于B組，和空心圓、實線對應于C組；圖38(表示以AUC顯示的OGTT I和2的基線葡萄糖水平，點狀條形柱對應于A組，陰影條形柱對應于B組，空心條形柱對應于C組；圖38D表示基線體重，點狀條形柱對應于A組，陰影條形柱對應于B組，空心條形柱對應于C組。圖39 圖示獼猴中溶媒、FGF21(SEQ ID NO 4)和 Fe-(L15)-FGF21 (L98R，P171G)(SEQ ID NO 43)相對于基線的體重變化百分比；陰影條形柱I和2對應于低劑量下的第I周和第2周，空心條形柱3和4對應于中等劑量下的第3周和第4周，實心條形柱5和6對應于高劑量下的第5周和第6周，點狀條形柱7、8和9對應于洗凈期(washout peroid)的第7-9周。圖 40 圖示溶媒、FGF21 (SEQ ID NO 4)和 Fe-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ IDNO 43)對獼猴空腹胰島素水平的相對于基線的空腹胰島素變化百分比；陰影條形柱I和2對應于低劑量下的第I周和第2周，空心條形柱3和4對應于中等劑量下的第3周和第4周，實心條形柱5和6對應于高劑量下的第5周和第6周，點狀條形柱7和8對應于洗凈期的第7和8周。圖41圖示在研究第5和第6周期間得到的以高劑量給予的溶媒、FGF21 (SEQ IDNO 4)和Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)對獼猴的餐后胰島素水平的作用；實心條形柱對應于第5周，陰影條形柱對應于第6周。圖42 圖示在兩周高劑量 Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G) (SEQ IDNO :43)治療結束時進行的0GTT5的葡萄糖分布；實心圓、實線對應于溶媒，空心方形、虛線對應于FGF21，以及實心三角、實線對應于Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)。圖43 圖示在兩周高劑量 Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G) (SEQ IDNO :43)治療結束時進行的0GTT5的胰島素分布；實心圓、實線對應于溶媒，空心方形、虛線對應于FGF21，以及實心三角、實線對應于Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)。圖44圖示在獼猴的各劑量期(低、中和高劑量)結束時測定的葡萄糖OGTTAUC3-5自基線的變化百分比；空心條形柱對應于在0GTT3期間由葡萄糖測量值計算的AUC3，實心條形柱對應于在0GTT4期間由葡萄糖測量值計算的AUC4，陰影條形柱對應于在0GTT5期間由葡萄糖測量值計算的AUC5。圖45 圖示溶媒、FGF21 和 Fe-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ IDNO :43)對獼猴各組的空腹血漿甘油三酯水平自基線的變化百分比的作用；陰影條形柱I和2對應于低劑量下的第I周和第2周，空心條形柱3和4對應于中等劑量下的第3周和第4周，實心條形柱5和6對應于高劑量下的第5周和第6周和點狀條形柱7、8和9對應于洗凈期的第7_9周。圖46圖示在以高劑量用溶媒、？6 21或？(-(し15)ザ6 21(し981 ，？1716)(5￡0 IDNO 43)治療第5周和第6周期間測量的獼猴各組的餐后血漿甘油三酯水平；陰影條形柱對應于第5周，實心條形柱對應于第6周。圖47圖示給藥前以及5天、12天、19天和26天測定的每只猴的人FGF21水平，其中樣品在毎次注射后約21小時獲得。
圖48圖示給藥前以及5天、12天、19天和26天測定的每只猴的Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) (SEQ ID NO :43)水平，其中樣品在每次注射后約5天獲得。圖49圖示根據在各低、中和高劑量后進行的三次OGTT測定的FGF21和Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)水平的平均濃度；陰影條形柱對應于低劑量的0GTT3，實心條形柱對應于中等劑量的0GTT4，空心條形柱對應于高劑量的0GTT5。圖50 是 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R，P171G，A180E)融合蛋白(SEQ IDNO 47)的氨基酸序列；IgGl Fe殘基(SEQ ID NO 11)呈粗體，(G4S) 3接頭(SEQ ID NO 31)呈斜體，以及在FGF21序列(SEQ ID NO 39)中的點突變呈粗體和加下劃線的。圖51圖示在Erk-螢光素酶測定中試驗化合物的劑量反應；測試Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO :47)、Fe-(L15)-FGF21 (L98R, P171G,A180E) (SEQ ID NO :57)、野生型FGF21和含野生型FGF21的Fe融合物。圖 52 圖示 Fc-(G4S) 3-FGF21 (L98R，P171G，A180E) (SEQ ID NO :47)和Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)對人(右)和食蟹猴(cyno) P-Klotho (左)的 Biacore 溶液平衡結合測定法(Biacore solutionequilibrium binding assay)結果。圖53 圖示在單ー注射后在 db/db 小鼠中 Fe-(G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E)(SEQ ID NO -Al)的劑量反應的兩張圖；圖53A顯示在注射溶媒或Fc-(G4S)3-FGF21(L98R，P171G，A180E)后db/db小鼠在各個時間點的血糖水平，而圖53B顯示在單ー注射Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E)至 db/db 小鼠后對體重的影響。圖 54 是圖示在 DIO 小鼠中 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R，P171G，A180E) (SEQ ID NO :47) Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) (SEQ ID NO :43)的給藥頻率研究的示意圖。圖55圖示在不同的給藥頻率下用溶媒、Fc-(G4S)3-FGF21(L98R，P171G，A180E)(SEQ ID NO 47)或 Fe-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQID NO :43)治療的小鼠的 GTT 分布圖。圖56圖示在不同的給藥頻率下用溶媒、Fc-(G4S)3-FGF21(L98R，P171G，A180E)(SEQ ID NO 47)或 Fe-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQID NO :43)治療的小鼠中自基線(0天)的體重改變。圖57圖示包含FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO 37)FGF21突變體的水凝膠的體內
研究結果。
圖58圖示給予各種水凝膠制劑對8周大db/db小鼠的血糖水平的影響。圖59圖示給予各種水凝膠制劑對8周大db/db小鼠的血糖水平的影響。圖60圖示給予各種水凝膠制劑對8周大db/B6小鼠的血糖水平的影響；實心圓表示給予水凝膠對照的小鼠，實心方形表示給予10mg/kg含FGF21(L98R，P171G) (SEQ ID NO 37)的水凝膠的小鼠，實心三角表示給予30mg/kg含FGF21(L98R，P171G)的水凝膠的小鼠，以及倒三角表示單獨給予 Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G，A180E) (SEQ ID NO :57)的小鼠。圖61圖示給予各種水凝膠制劑的8周大db/B6小鼠的血糖水平的變化百分比；實心圓表示給予水凝膠對照的小鼠，實心方形代表給予10mg/kg含FGF21(L98R，P171G) (SEQID NO 37)的水凝膠的小鼠，實心三角表示給予30mg/kg含FGF21(L98R，P171G)的水凝膠 的小鼠，以及倒三角表示單獨給予Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G，A180E) (SEQ ID NO :57)的小鼠。圖62圖示給予各種水凝膠制劑對8周大db/B6小鼠的體重的影響；實心圓表示給予水凝膠對照的小鼠，實心方形代表給予10mg/kg含FGF21(L98R，P171G) (SEQ ID NO 37)的水凝膠的小鼠，實心三角表示給予30mg/kg含FGF21 (L98R，P171G)的水凝膠的小鼠，以及倒三角表示單獨給予ド(-(し15)ザ6 21(し981 ，？1716，六18( ) (SEQ ID NO 57)的小鼠。圖63圖示給予各種水凝膠制劑的8周大db/B6小鼠重量的變化百分比；實心圓表示給予水凝膠對照的小鼠，實心方形代表給予10mg/kg含FGF21(L98R，P171G) (SEQ ID NO 37)的水凝膠的小鼠，實心三角表示給予30mg/kg含FGF21(L98R，P171G)的水凝膠的小鼠，以及倒三角表示單獨給予 Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G，A180E) (SEQ ID NO :57)的小鼠圖64是圖示在有葡萄糖耐量降低(IGT)的食蟹猴中進行的九周劑量遞增研究的研究設計的圖。圖65 圖示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO :47)對研究的 IGT 食蟹猴的 AM 餐食物攝入的影響。圖66 圖示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO 47)對研究的 IGT 食蟹猴的水果攝入的影響。圖67 圖示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO :47)對研究的 IGT 食蟹猴的 PM 餐食物攝入的影響。圖68 圖示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO :47)對研究的 IGT 食蟹猴的體重的影響。圖69 圖示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO 47)對研究的 IGT 食蟹猴的體重指數的影響。圖70 圖示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO 47)對研究的 IGT 食蟹猴的皮褶厚度的影響。
圖71 圖示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO :47)對研究的 IGT 食蟹猴的腹圍的影響圖72 圖示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO 47)對研究的 IGT 食蟹猴的血漿葡萄糖水平的影響。圖73 圖示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO 47)對研究的 IGT 食蟹猴的葡萄糖耐量的影響。圖74 圖示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO 47)對研究的 IGT 食蟹猴的血漿甘油三酷水平的影響。圖75 圖示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO 47)對研究的 IGT 食蟹猴的血漿總膽固醇水平的影響。圖76 圖示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO :47)對研究的 IGT食蟹猴的血漿HDL-膽固醇水平的影響。圖77是顯示在168小時時間段內的各個時間點下，觀察的Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G)(左圖，SEQ ID NO 43)和 Fe-(L15)-FGF21 (L98R，P171G，A180E)(右圖，SEQ ID NO:57)變化的一系列的MALDI質譜跡線。 圖78圖示在Asp-N消化后，如通過MRM LC/MS/MS分析的全長C-末端肽占由Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)和 Fe-(L15)-FGF21 (L98R，P171G, A180E)衍生的總 C-末端肽片段的相對豐度(％)。圖79圖示在給小鼠靜脈內注射后240小時內，完整全長的Fc_(L15)-FGF21(L98R, P 171G) (SEQ ID NO :43)和 Fc_(L 15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQID NO 57)的血漿濃度的ELISA測定結果，圖80圖示對陰性對照；人FGF21 (SEQ ID NO 4)；和FGF21糖基化突變體FGF21(Y179N，S181T) (SEQ ID NO :161)、FGF21Y179N (SEQ IDNO :163)和 FGF21P124S (SEQ IDNO 165)進行的ELK-螢光素酶活性測定結果。發明詳述可以采用本文公開的方法和標準分子生物學方法制備具有改進性質(例如半壽期延長和/或聚集減少)的人FGF21蛋白。任選可通過抗體或其部分與野生型FGF21序列的N末端或C末端融合而使半壽期進ー步延長。還可通過將氨基酸取代引入蛋白質中而進一步延長野生型FGF21蛋白的半壽期或減少聚集。這類經過修飾的蛋白質在本文被稱為突變體或FGF21突變體，并構成本發明的實施方案。本文(包括在實施例中)使用的重組核酸方法一般是Sambrook等，MolecularCloning A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)或CurrentProtocols in Molecular Biology (Ausubel 等，主編，Green Publishers Inc.和 Wiley 和Sons 1994)中給出的方法，兩個參考文獻均通過引用并入到本文中用于任何目的。I. 一般定義術語“分離的核酸分子”是指本文提供的核酸分子，其1)從當總核酸從來源細胞分離時與之天然共存的至少約50%的蛋白質、脂質、碳水化合物或其它材料中分離出來，
(2)不與“分離核酸分子”天然連接的多核苷酸的全部或部分連接，(3)與天然不與之連接的多核苷酸有效連接，或(4)天然不作為較大多核苷酸序列的部分存在。優選地，分離的核酸分子基本上無任何其它的污染核酸分子或在其自然環境存在的可能干擾其在多肽產生中的用途或其治療、診斷、預防或研究用途的其它污染物。術語“載體”用來指用于向宿主細胞傳遞編碼信息的任何分子(例如核酸、質粒或病毒)。 術語“表達載體”是指適于宿主細胞轉化并含有指導和/或控制插入異源核酸序列表達的核酸序列的載體。表達包括但不限于諸如轉錄、翻譯和RNA剪接(如果內含子存在的話)等過程。術語“有效連接”本文用來指側翼序列的排列方式，其中配置或裝配如此所述的側翼序列從而發揮其常規功能。因此，與編碼序列有效連接的側翼序列可能能夠實現編碼序列的復制、轉錄和/或翻譯。例如，當啟動子能夠指導編碼序列轉錄時，該編碼序列與該啟動子有效連接。側翼序列不必與編碼序列鄰接，只要其正確起作用即可。因此，例如，間插的非翻譯但卻轉錄的序列可存在于啟動子序列和編碼序列之間，啟動子序列仍可被視為與編碼序列“有效連接”。術語“宿主細胞”用來指被核酸序列(例如本文提供的核酸)轉化或能夠被所述核酸序列轉化然后能夠表達選定的目標基因的細胞。該術語包括親代細胞的子代，無論子代在形態或遺傳組成上是否與最初的親代相同，只要存在選定的基因。術語“分離的多肽”是指本發文提供的多肽，其(I)從當從來源細胞分離時與之天然共存的至少約50%的多核苷酸、脂質、碳水化合物或其它物質中分離出來，(2)不與“分離多肽”天然連接的多肽的全部或部分連接(通過共價或非共價相互作用)，(3)與天然不與之連接的多肽有效連接(通過共價或非共價相互作用)，或(4)天然不存在。優選分離多肽基本上無任何其它污染多肽或在其自然環境中存在的可能干擾其治療、診斷、預防或研究用途的其它污染物。術語“天然存在的”當與生物材料例如核酸分子、多肽、宿主細胞等聯用時，是指自然界中存在的且未受人為操作的材料。同樣，本文使用的“非天然存在的”是指自然界不存在的或經過人為在結構上修飾或合成的材料。當與核苷酸聯用吋，術語“天然存在的”是指堿基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。當與氨基酸聯用吋，術語“天然存在的”是指20種氨基酸，即丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、賴氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、纈氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。術語“FGF21多肽”是指在人體內表達的天然存在的野生型多肽。對于本公開內容的目的，術語“FGF21多肽”可互換使用，是指任何全長FGF21多肽，例如由209個氨基酸殘基組成并分別由SEQ ID NO :1和5的核苷酸序列編碼的SEQ ID NO 2和6 ;多肽的任何成熟形式，例如由181個氨基酸殘基組成并分別由SEQ ID NO 3和7的核苷酸序列編碼的SEQ ID NO :4和8，其中剔除了在全長FGF21多肽的氨基末端的28個氨基酸殘基(S卩，其構成信號肽)。全長和成熟FGF21多肽可但不要求包含氨基末端甲硫氨酸，其可由工程改造引入或作為細菌表達過程的結果。術語“FGF21多肽突變體”和“FGF21突變體”可互換使用，并且是指其中天然存在的FGF21氨基酸序列(例如，SEQ ID N0:2、4、6或8)已被修飾的FGF21多肽。這類修飾包括但不限于ー個或多個氨基酸取代，包括被非天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸類似物的取代；和截短。因此，FGF21多肽突變體包括但不限于本文所述的位點定向FGF21突變體、截短FGF21多肽、蛋白酶解抗性FGF21突變體、聚集減少的FGF21突變體、FGF21組合突變體和FGF21融合蛋白。為了鑒定本發明的FGF21突變體的具體截短和氨基酸取代，截短或突變的氨基酸殘基編號與成熟181-殘基FGF21多肽的編號相對應。FGF21突變體可以但不要求包含氨基末端甲硫氨酸，其可由工程改造引入或作為細菌表達過程的結果。在本發明的其它實施方案中，FGF21多肽突變體包含與突變體FGF21的氨基酸序列有至少約85%同一性的氨基酸序列，但是其中為FGF21多肽突變體提供所需性質(例如蛋白酶解抗性、半 壽期延長或聚集減少性質及其組合)的特定殘基不被進一歩修飾。換句話講，除已被修飾以提供蛋白酶解抗性、減少聚集或其它性質的FGF21突變體序列中的殘基之外，在FGF21突變體序列中約15%的所有其它氨基酸殘基都可被修飾。例如在FGF21突變體Q173E中，至多15%的所有氨基酸殘基都可被修飾，除取代173位上的谷氨酰胺的谷氨酸殘基以外。還在其它的實施方案中，FGF21多肽突變體包含與突變體FGF21的氨基酸序列有至少約90%，或約95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，但是其中賦予FGF21多肽突變體蛋白酶解抗性或聚集減少性質的特定殘基不被進一歩修飾。這類FGF21多肽突變體具有至少ー種野生型FGF21多肽的活性。本發明還涵蓋編碼FGF21多肽突變體的核酸分子，所述FGF21多肽突變體包含與突變體FGF21的氨基酸序列有至少約85%同一性的氨基酸序列，但是其中賦予FGF21多肽突變體所需性質(例如蛋白酶解抗性、半壽期延長或聚集減少性質及其組合)的特定殘基不被進ー步修飾。換句話講，除已被修飾以提供蛋白酶解抗性、減少聚集或其它性質的FGF21突變體序列的殘基之外，FGF21突變體序列中約15%的所有其它氨基酸殘基都可被修飾。例如在FGF21突變體Q173E中，至多15%的所有氨基酸殘基都可被修飾，除取代173位上的谷氨酰胺的谷氨酸殘基的氨基酸殘基以外。本發明還涵蓋包含與編碼FGF21突變體的核苷酸序列有至少約90%、或約95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列的核酸分子，但是其中編碼賦予編碼的FGF21多肽突變體蛋白酶解抗性或聚集減少性質的氨基酸殘基的核苷酸不被進ー步修飾。這類核酸分子編碼具有至少ー種野生型FGF21多肽的活性的FGF21突變體多肽。術語“有生物活性的FGF21多肽突變體”是指不論已引入FGF21多肽突變體的修飾的類型或數目，具有野生型FGF21多肽活性的本文所述的任何FGF21多肽突變體，所述活性為例如降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇的能力；減輕體重的能力；和改善葡萄糖耐量、能量消耗或胰島素敏感性的能力。雖然如此，與野生型FGF21多肽相比，FGF21活性的水平略微降低的FGF21多肽突變體仍可視為是有生物活性的FGF21多肽突變體。
術語“有效量”和“治療有效量”各自是指用來支持野生型FGF21多肽的ー種或多種生物活性的可觀察水平的FGF21多肽突變體的量，例如降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平的能力；減輕體重的能力；或改善葡萄糖耐量、能量消耗或胰島素敏感性的能力。本文使用的術語“藥學上可接受的載體”或“生理學上可接受的載體”是指適用于完成或促進FGF21多肽突變體遞送至人體或非人受試者的ー種或多種配制劑。該術語包括生理上相容的任何和所有溶劑、分散介質、包衣材料、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。藥學上可接受的載體的實例包括水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、右旋糖、甘油、こ醇等及其組合的ー種或多種。在一些情況下，優選在藥物組合物中包含等滲劑，例如，糖；諸如甘露醇、山梨醇等多元醇；或氯化鈉。増加FGF21多肽突變體的保存期或效カ的藥學上可接受的物質(例如潤濕物質或少量的輔助物質，例如潤濕劑或乳化剤、防腐劑或緩沖劑)也可作為或形成載體的組分。術語“抗原”是指能夠被抗體結合，并且還能夠用于動物中以產生能結合該抗原表位的抗體的分子或分子部分。抗原可具有ー個或多個表位。術語“天然Fe”是指不論是以単體形式還是以多聚體形式包含非抗原結合片段的序列的分子或序列，并且可含有鉸鏈區，所述非抗原結合片段由整個抗體消化得到或通過其它方法產生。天然Fe最初的免疫球蛋白源優選、但并不一定為人源的，并可以是任ー種免疫球蛋白，盡管優選為IgGl和IgG2。也可使用IgG4。天然Fe分子由可通過共價(即ニ硫鍵)和非共價締合連接成ニ聚體或多聚體形式的単體多肽構成。天然Fe分子的單體亞基之間的分子間ニ硫鍵的數目為I至4的范圍，這取決于類別(例如IgG、IgA和IgE)或亞類(例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgGA2)。天然Fe的ー個實例是由木瓜蛋白酶消化IgG得到的ニ硫鍵鍵合的ニ聚體(參見Ellison等，1982,Nucleic Acids Res. 10 :4071-9)。本文使用的術語“天然Fe”通用于單體、ニ聚體和多聚體形式。Fe多肽序列的實例見SEQID NO: 11，其由人IgGl分子衍生。天然Fe可以但不要求包括氨基末端甲硫氨酸，其可通過工程改造或作為細菌表達過程的結果引入；這類Fe分子依然被認為是“天然Fe”分子。術語“Fe變體”是指是自天然Fe修飾但仍包含補救受體(salvagereceptor)FcRn (新生Fe受體)的結合位點的分子或序列。國際申請號W097/34631和WO 96/32478描述示例性Fe變體以及與補救受體的相互作用，并通過引用并入本文。因此，術語“Fe變體”可包含從非人類天然Fe人源化的分子或序列。此外，天然Fe包含可被剔除的區域，因為它們提供本發明FGF21突變體的融合分子不需要的結構特征或生物活性。因此，術語“Fe變體”包含缺失ー個或多個天然Fe位點或殘基，或者其中ー個或多個Fe位點或殘基被修飾的分子或序列，所述Fe位點或殘基影響或參與(1) ニ硫鍵形成，(2)與所選的宿主細胞不相客，(3)在選定宿主細胞中表達時的N末端異質性，(4)糖基化，(5)與補體相互作用，
(6)與補救受體以外的Fe受體結合，或(7)抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。下文中將進ー步詳述Fe變體。Fe變體可以但不要求包含氨基末端甲硫氨酸，其可通過工程改造或作為細菌表達過程的結果引入；這類Fe分子依然被認為是“Fe變體”。術語“Fe結構域”涵蓋天然Fe和Fe變體及如上定義的序列。至于Fe變體和天然Fe分子，術語“Fe結構域”包括単體或多聚體形式的分子，不論是由整個抗體消化還是通過其它方法產生。在本發明的一些實施方案中，Fe結構域可通過例如Fe結構域和FGF21 序列之間的共價鍵與FGF21或FGF21突變體(包括FGF21或FGF21突變體的截短形式)融合。這類融合蛋白可通過Fe結構域的締合形成多聚體，這些融合蛋白及其多聚體兩者均屬于本發明的方面。Fe結構域可以但不要求包含氨基末端甲硫氨酸，其可通過工程改造或作為細菌表達過程的結果引入。2. FGF21 突奪體術語“FGF21突變體”是指具有以下氨基酸序列的FGF21突變體多肽，所述氨基酸序列因ー個或多個氨基酸而不同于天然存在的FGF21多肽序列(例如SEQ ID N0:2、4、6或8)的氨基酸序列。FGF21突變體可通過利用天然或非天然存在的氨基酸在FGF21多肽的特定位置引入保守或非保守的一個或多個氨基酸取代，來產生。“保守氨基酸取代”可包括天然氨基酸殘基(即存在于野生型FGF21多肽序列給定位置上的殘基)被非天然殘基(即不存在于野生型FGF21多肽序列給定位置上的殘基)取代，使得對該位置上的氨基酸殘基的極性或電荷幾乎沒有或沒有影響。保守氨基酸取代還包括通常通過化學上的肽合成而不是通過在生物系統中的合成而摻入的非天然存在的氨 基酸殘基。這些包括肽模擬物(peptidomimetics)和氨基酸部分的其它反轉形式或反向形式。可根據共同的側鏈性質將天然存在的殘基分為以下幾類(I)疏水性:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile ；(2)中性親水性Cys、Ser、Thr ;(3)酸性Asp、Glu ;(4)堿性:Asn、Gin、His、Lys、Arg ;(5)影響鏈方向的殘基Gly、Pro ;和(6)芳族的Trp、Tyr、Phe。保守取代可包括這些類別之ー的成員被同一類別的另ー個成員交換。非保守取代可包括這些類別之ー的成員被另ー類別的成員交換。本領域的技術人員在需要這類取代時，可確定所需要的氨基酸取代(不管是保守還是非保守)。示例性(但不是限制性的)氨基酸取代表見表I。激I氨基酸取代
初始殘基示例性取代
AlaVal, Leu, He
ArgLys, Gin, Asn
AsnGln
AspGlu
CysSer, Ala
GlnAsn
權利要求
1.一種分離的多肽，包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列，并且還包含 (a)至少ー個在180位的氨基酸取代；和 (b)至少ー個選自以下的氨基酸取代 ⑴在171位的取代；和 (ii)在98位的取代；以及 (c)它們的組合。
2.權利要求I的分離的多肽，其中所述多肽包含在98位的取代和在180位的取代，并且其中 (a)所述在98位的取代選自精氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸和蘇氨酸；和 (b)所述在180位的取代選自甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸或谷氨酸；以及 (c)它們的組合。
3.權利要求2的分離的多肽，其中98位的殘基是精氨酸并且180位的殘基是谷氨酸。
4.ー種融合多肽，包含與異源氨基酸序列融合的權利要求3的分離多肽。
5.權利要求4的融合多肽，其中所述異源氨基酸序列是Fe結構域或其片段。
6.權利要求5的融合多肽，其中所述Fe結構域包含SEQID NO 11的氨基酸序列。
7.權利要求6的融合多肽，其中所述多肽通過接頭與Fe結構域融合。
8.權利要求7的融合多肽，其中所述接頭包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO :31)。
9.權利要求8的融合多肽，其中所述多肽包含SEQID NO -Al.
10.一種多聚體，包含兩個或更多個權利要求9的融合多肽。
11.ー種藥物組合物，包含權利要求2的分離的多肽和藥學上可接受的配制劑。
12.權利要求11的藥物組合物，其中所述藥學上可接受的配制劑是水凝膠。
13.ー種治療代謝紊亂的方法，包括向有需要的人患者給予權利要求12的藥物組合物。
14.權利要求13的方法，其中所述代謝紊亂是糖尿病。
15.權利要求13的方法，其中所述代謝紊亂是肥胖癥。
16.—種編碼權利要求2的多肽的分離的核酸。
17.權利要求16的分離的核酸，其中所述核酸包含SEQID N0:46。
18.—種載體,包含權利要求17的核酸分子。
19.ー種宿主細胞,包含權利要求18的核酸分子。
20.權利要求2的分離的多肽，其中所述多肽包含 (a)不超過8個氨基酸殘基的氨基末端截短，其中所述多肽能夠降低哺乳動物的血糖； (b)不超過12個氨基酸殘基的羧基末端截短，其中所述多肽能夠降低哺乳動物的血糖；或 (c)不超過8個氨基酸殘基的氨基末端截短和不超過12個氨基酸殘基的羧基末端截短，其中所述多肽能夠降低哺乳動物的血糖。
21.權利要求2的分離的多肽，其中所述多肽與一種或多種聚合物共價連接。
22.權利要求21的分離的多肽，其中所述聚合物是PEG。
23.權利要求I的分離的多肽，其中所述多肽包含在171位的取代和在180位的取代，并且其中(a)所述在180位的取代選自甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸和谷氨酸； (b)所述在171位的取代選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸和酪氨酸；以及 (C)它們的組合。
24.權利要求23的分離的多肽，其中在171位的殘基是甘氨酸和在180位的殘基是谷氨酸。
25.ー種融合多肽，包含與異源氨基酸序列融合的權利要求24的分離的多肽。
26.權利要求25的融合多肽，其中所述異源氨基酸序列是Fe結構域或其片段。
27.權利要求26的融合多肽，其中所述Fe結構域包含SEQID NO 11的氨基酸序列。
28.權利要求27的融合多肽，其中所述多肽通過接頭與所述Fe結構域融合。
29.權利要求28的融合多肽，其中所述接頭包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO :31)。
30.權利要求29的融合多肽，其中所述多肽包含SEQID NO :47。
31.一種多聚體，包含兩個或更多個權利要求30的融合多肽。
32.—種藥物組合物，包含權利要求30的分離的多肽和藥學上可接受的配制劑。
33.權利要求32的藥物組合物，其中所述藥學上可接受的配制劑是水凝膠。
34.ー種治療代謝紊亂的方法，包括向有需要的人患者給予權利要求32的藥物組合物。
35.權利要求34的方法，其中所述代謝紊亂是糖尿病。
36.權利要求34的方法，其中所述代謝紊亂是肥胖癥。
37.ー種編碼權利要求23的多肽的分離的核酸。
38.權利要求37的分離的核酸，其中所述核酸包含SEQID NO :46。
39.ー種載體,包含權利要求38的核酸分子。
40.ー種宿主細胞，包含權利要求39的核酸分子。
41.權利要求23的分離的多肽，其中所述多肽包含 (a)不超過8個氨基酸殘基的氨基末端截短，其中所述多肽能夠降低哺乳動物的血糖； (b)不超過12個氨基酸殘基的羧基末端截短，其中所述多肽能夠降低哺乳動物的血糖；或 (c)不超過8個氨基酸殘基的氨基末端截短和不超過12個氨基酸殘基的羧基末端截短，其中所述多肽能夠降低哺乳動物的血糖。
42.權利要求23的分離的多肽，其中所述多肽與一種或多種聚合物共價連接。
43.權利要求42的分離的多肽，其中所述聚合物是PEG。
44.權利要求I的分離的多肽，其中所述多肽包含SEQID NO :4的在98位的取代、在171位的取代和在180位的取代，并且其中 (a)所述在171位的取代選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸或酪氨酸； (b)所述在98位的取代選自精氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸或蘇氨酸；以及 (c)所述在180位的取代選自甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸或谷氨酸；及其組合。
45.權利要求44的分離的多肽，其中在98位的殘基是精氨酸，在171位的殘基是甘氨酸和在180位的殘基是谷氨酸。
46.ー種融合多肽，包含與異源氨基酸序列融合的權利要求45的分離的多肽。
47.權利要求46的融合多肽，其中所述異源氨基酸序列是Fe結構域或其片段。
48.權利要求47的融合 多肽，其中IgG恒定結構域包含SEQID NO 11的氨基酸序列。
49.權利要求48的融合多肽，其中所述多肽通過接頭與所述Fe結構域融合。
50.權利要求49的融合多肽，其中所述接頭包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO :31)。
51.權利要求50的融合多肽，其中所述多肽包含SEQID NO -Al.
52.—種多聚體，包含兩個或更多個權利要求51的融合多肽。
53.—種多肽,包含 (a)SEQ ID NO 4的多肽，其中 (i)98位的亮氨酸被精氨酸取代； (ii)171位的脯氨酸被甘氨酸取代；以及 (iii)180位的丙氨酸被谷氨酸取代； (b)包含SEQID NO 31的接頭序列；以及 (c)包含SEQID NO : 11的Fe結構域。
54.一種多肽，包含SEQ ID NO 47的序列。
55.ー種由SEQ ID NO :46的核酸序列編碼的多肽。
56.ー種藥物組合物，包含權利要求44或53的分離多肽和藥學上可接受的配制劑。
57.權利要求56的藥物組合物，其中所述藥學上可接受的配制劑是水凝膠。
58.ー種治療代謝紊亂的方法，包括向有需要的人患者給予權利要求57的藥物組合物。
59.權利要求58的方法，其中所述代謝紊亂是糖尿病。
60.權利要求58的方法，其中所述代謝紊亂是肥胖癥。
61.ー種編碼權利要求44或53的多肽的分離核酸。
62.權利要求61的分離核酸，其中所述核酸包含SEQID NO 460
63.—種載體,包含權利要求62的核酸分子。
64.—種宿主細胞，包含權利要求63的核酸分子。
65.權利要求44或53的分離的多肽,其中所述多肽包含 (a)不超過8個氨基酸殘基的氨基末端截短，其中所述多肽能夠降低哺乳動物的血糖； (b)不超過12個氨基酸殘基的羧基末端截短，其中所述多肽能夠降低哺乳動物的血糖；或 (c)不超過8個氨基酸殘基的氨基末端截短和不超過12個氨基酸殘基的羧基末端截短，其中所述多肽能夠降低哺乳動物的血糖。
66.權利要求44或53的分離的多肽，其中所述多肽與一種或多種聚合物共價連接。
67.權利要求66的分離的多肽，其中所述聚合物是PEG。
全文摘要
本發明提供編碼FGF21突變體多肽的核酸分子、FGF21突變體多肽、包含FGF21突變體多肽的藥物組合物、以及使用這類核酸、多肽或藥物組合物來治療代謝紊亂的方法。
文檔編號C07K14/50GK102655877SQ201080031036
公開日2012年9月5日 申請日期2010年5月4日 優先權日2009年5月5日
發明者A·E·漢伯格, E·J·貝羅斯基, M·L·邁克爾斯, M·M·埃利森, R·I·赫奇特, Y-S·李, 宣廷勛, 徐京 申請人:安姆根有限公司