針對流感病毒的中和分子的制作方法

專利名稱：針對流感病毒的中和分子的制作方法
技術領域：
本發明涉及鑒別、制備和工程化針對甲型流感病毒的中和分子的方法和手段以及所制備的中和分子。本發明還涉及所制備的分子的各種用途，包括利用靶甲型流感病毒上的本發明的中和分子的結合位點來設計和生產疫苗。
背景技術：
流感是由流感病毒引起的傳染性呼吸道疾病。其引起輕度至重度疾病，且有時會導致死亡。美國每年有5-20%的人口染上流感，約200，000人住院，且引起約36，000人死亡。流感病毒通過咳嗽和打噴嚏所產生的呼吸飛沫傳播，其通常在人之間傳播。對流感表面抗原(尤其是血凝素)的免疫降低感染的可能性和疾病的嚴重性(如果發生感染)。 雖然有流感疫苗可用，但因為針對一種流感病毒類型或亞型的疫苗對于保護免于另一類型或亞型的流感有限或無效，所以有必要在每年的流感疫苗中并入一種或多種新菌株。流感病毒是片段型負鏈RNA病毒且屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)家族。甲型流感病毒由9種結構蛋白質組成且另外編碼一種具有調節功能的非結構NSl蛋白質。非結構NSl蛋白質在復制周期期間大量合成且定位于受感染細胞的細胞溶質和細胞核中。病毒基因組的片段性質使得在細胞受不同病毒菌株混合感染期間發生基因重排(基因組片段的交換)的機制。依據其表面上所呈現的不同血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)病毒蛋白質，甲型流感病毒可進一步分為各種亞型。通過兩種病毒表面糖蛋白，血凝素(HA或H)和神經氨酸酶(NA或N)，來鑒別甲型流感病毒亞型。各流感病毒亞型通過它的H和N蛋白質的組合來鑒別。有16種已知的HA亞型和9種已知的NA亞型。甲型流感病毒可感染人、禽類、豬、馬和其它動物，但野生禽類是這些病毒的天然宿主。雖然目前僅一些甲型流感亞型 (即，H1N1、H1N2和H3N》在人群中傳播，但在鳥類物種，尤其野生水禽和沙禽中已鑒別到 16種H和9種NA亞型的所有組合。另外，越來越多的證據表明，H5和H7流感病毒也可引起人疾病。甲型流感病毒的HA包含兩個結構不同的區，S卩，球狀頭部區和莖部區。球狀頭部區含有負責病毒附著于靶細胞且參與HA的血細胞凝集活性的受體結合位點。莖部區含有對于病毒包膜與細胞內吞體膜之間的膜融合所必需的融合肽，且因此與融合活性有關 (Wiley 等，Ann. Rev. Biochem.，56 :365-394 (1987))。大流行是全球性疾病爆發。當新甲型流感病毒(1)出現，而人群體對此幾乎沒有免疫性，(2)開始引發嚴重疾病，并接著(3)在世界范圍內容易地在人之間傳播時，則發生流感大流行。20世紀期間，曾有三次這樣的流感大流行。第一次，在1918年，“西班牙流感” 流感大流行，引起美國至少500，000人死亡且在世界范圍內多達40，000, 000人死亡。這次大流行由甲型流感Hmi亞型引起。第二次，在1957年，“亞洲流感”流感大流行，由甲型流感H2N2亞型引起，導致美國至少70，000人死亡，且在世界范圍內導致1_2百萬人死亡。最近，在1968年，“香港流感”流感大流行，由甲型流感H3N2亞型引起，導致美國約34，000人死亡且在世界范圍內導致700，000人死亡。
在1997年，香港報道了第一起甲型流感H5m病例。雖然這是這一類型的鳥類病毒第一次直接感染人，但是未發生大流行，因為未觀察到人之間的傳播。Lu 等，Resp. Res. 7 :43(2006) (doi :10. 1186/1465-992-7-43)報道從接種滅活的H5m病毒的疫苗的馬制備抗H5migG，和制備H5m特異性F(ab' )2片段，描述所述抗 H5NlIgG和H5m特異性F(ab' )2片段可保護感染有H5W病毒的BALB/c小鼠。Hanson等，Resp. Res. 7 :126(doi :10. 1186/1465-9921-7-126)描述對甲型流感H5 病毒血凝素具有特異性的嵌合單克隆抗體用于小鼠的被動免疫的用途。2008年1月17日公布的美國申請公布第20080014205號公開了針對流感病毒的中和抗體。鑒于由某些甲型流感病毒引起的呼吸道疾病的嚴重性和潛在大流行的威脅，極需要有效的預防和治療方法。本發明通過提供針對所述病毒的各種H亞型的甲型流感中和分子解決這一需要，所述H亞型包含但不限于甲型流感病毒的Hl和H3亞型以及H5亞型。本發明還提供能夠中和甲型流感病毒的給定亞型的一種以上且優選所有分離株(菌株)的分子，所述分離株包含但不限于從各種人和非人物種獲得的分離株和來自各種流感流行病和 /或大流行的受害者和/或存活者的分離株。所述交叉反應性中和分子可用于預防和/或治療流感病毒感染，包括已感染或有風險感染流行病或大流行的人群的被動免疫。另外，交叉反應性抗體可用作未來疫苗發現的設計指導和當前疫苗臨床開發的評估工具。
發明概要在一方面，本發明提供包含來自重鏈和輕鏈多肽的高變區的結合分子。在一個實施方案中，結合分子包含一個、兩個或三個選自由SEQ ID NO 7,SEQ ID NO :8和SEQ ID NO: 9組成的組的來自重鏈的高變區序列，或其功能活性片段。在另一實施方案中，結合分子包含所有高變區序列SEQ ID NO 7, SEQ ID NO :8和SEQ ID NO :9。在一個其它實施方案中， 結合分子是當與輕鏈締合時能夠結合靶標的結合分子。在一個實施方案中，輕鏈或結合分子包含多肽序列的一個、兩個或三個高變序列SEQ ID NO 13,SEQ ID N0:14和SEQ ID NO: 15。在另一實施方案中，輕鏈或結合分子包含多肽序列的一個、兩個或三個高變序列SEQ ID NO 16, SEQ ID N0:17和SEQ ID NO :18。在一個其它實施方案中，輕鏈或結合分子包含多肽序列的一個、兩個或三個高變序列SEQ ID NO 19,SEQ ID N0:20和SEQ ID N0:21。在另一實施方案中，輕鏈或結合分子包含所有高變區序列SEQ ID NO :13、SEQ ID NO 14和SEQ ID NO :15ο在另一實施方案中，輕鏈或結合分子包含所有高變區序列SEQ ID NO 16、SEQ ID Ν0:17和SEQ ID NO 18。在一個其它實施方案中，輕鏈或結合分子包含所有高變區序列 SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO :20 禾口 SEQ ID N0:21。在另一實施方案中，結合分子包含一個、兩個或三個選自由SEQ ID NO 10,SEQ ID N0:11和SEQ ID NO :12組成的組的來自重鏈的高變區序列，或其功能活性片段。在一個其它實施方案中，結合分子包含所有高變區序列SEQ ID NO 10,SEQ ID N0:11和SEQ ID N0: 12。在一個其它實施方案中，結合分子是當與輕鏈締合時能夠結合靶標的結合分子。在一個實施方案中，輕鏈或結合分子包含多肽序列的一個、兩個或三個高變序列SEQ ID NO 22, SEQ ID N0:23和SEQ ID NO :24。在一其它實施方案中，輕鏈或結合分子包含所有高變區序列 SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23 和 SEQ ID NO :24。在一個實施方案中，結合分子是抗體。在另一實施方案中，結合分子是替代抗體 (surrobody)0在另一方面，本發明提供包含VpreB序列和/或λ 5序列的結合分子。在一個實施方案中，結合分子包含含有VpreB序列和/或λ 5序列的多肽。在另一實施方案中，結合分子還包含含有與λ 5序列融合的VpreB序列的多肽。在一個其它實施方案中，結合分子還包含含有V κ樣和/或JC κ序列的κ樣替代輕鏈(SLC)的構建體。在所有實施方案中，結合分子(i)中和甲型流感病毒的一種以上亞型和/或一種以上分離株，( )結合所述病毒的血凝素(HA)抗原，和(iii)抑制血細胞凝集。在另一實施方案中，結合分子中和Hl和H3甲型流感病毒亞型中的至少一者。在一實施方案中，結合分子中和Hl和H3甲型流感病毒亞型。在另一實施方案中，結合分子阻止甲型流感病毒的球狀頭部區結合細胞的表面。在一個其它實施方案中，結合分子阻止甲型流感病毒附著于欲感染的細胞。在另一實施方案中，結合分子結合HlHA抗原。在一個實施方案中，結合分子結合至少一種另外的HA抗原。在另一實施方案中，另外的HA抗原是H3。在另一實施方案中，結合分子結合H2HA抗原。在一個實施方案中，本發明提供包含重鏈的抗體，所述重鏈包含如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列。在另一實施方案中，抗體還包含輕鏈，所述輕鏈包含選自由SEQ ID NO 3、SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5組成的組的氨基酸序列。在一個其它實施方案中，抗體是 (i)中和甲型流感病毒的一種以上亞型和/或一種以上分離株，(ii)結合所述病毒的血凝素(HA)抗原，和(iii)抑制血細胞凝集的抗體。在另一實施方案中，抗體是中和Hl和H3 甲型流感病毒亞型中至少一者的抗體。在一個實施方案中，抗體是中和Hl和H3甲型流感病毒亞型的抗體。在另一實施方案中，抗體是阻止甲型流感病毒的球狀頭部區結合細胞的表面的抗體。在一個其它實施方案中，抗體是阻止甲型流感病毒附著于欲感染的細胞的抗體。在另一實施方案中，抗體是結合HlHA抗原的抗體。在一個實施方案中，抗體是結合至少一種另外的HA抗原的抗體。在另一實施方案中，另外的HA抗原是H3。在另一實施方案中，抗體包含重鏈，所述重鏈包含如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。在一個其它實施方案中，抗體還包含輕鏈，所述輕鏈包含如SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列。在一個其它實施方案中，抗體是(i)中和甲型流感病毒的至少一種亞型和/或至少一種分離株，和(ii)結合所述病毒的血凝素(HA)抗原的抗體。在一個實施方案中，抗體是結合HA抗原的H5亞型的表位的抗體。在另一實施方案中，抗體是中和HlHA抗原、中和 H5HA抗原或中和Hl和H5甲型流感病毒亞型的抗體。在另一實施方案中，抗體或結合分子結合和/或中和甲型流感病毒的一種以上亞型和/或一種以上分離株和/或與甲型流感病毒的一種以上亞型和/或一種以上分離株反應。在一個實施方案中，病毒是具有感染人的能力的病毒。在另一實施方案中，分離株是已從人受試者獲得的分離株。在一個其它實施方案中，分離株是已從非人動物獲得的分離株。 在另一實施方案中，非人動物是禽類。在一個實施方案中，禽類是野禽或雞。在一個其它實施方案中，非人動物是豬。在另一實施方案中，抗體或結合分子是結合HA抗原的Hl亞型的表位的抗體或結合分子。在一個其它實施方案中，抗體或結合分子是結合HA抗原的H3亞型的表位的抗體或結合分子。在另一實施方案中，抗體或結合分子是結合HA抗原的Hl亞型的表位和結合 HA抗原的H3亞型的表位的抗體或結合分子。在一個實施方案中，抗體或結合分子是結合 HA抗原的H9亞型的表位的抗體或結合分子。在另一實施方案中，抗體或結合分子是結合 HA抗原的H5亞型的表位的抗體或結合分子。在另一實施方案中，抗體或結合分子是結合 HA抗原的H2亞型的表位的抗體或結合分子。在所有實施方案中，抗體或結合分子結合呈現于甲型流感病毒表面的表位。在所有實施方案中，Hl亞型是，或HA來自Hl病毒的新喀里多尼亞/20/99分離株； Hl亞型是，或HA來自Hl病毒的索羅門群島/3/06分離株或Hl病毒的孟菲斯/3/2008分離株。在所有實施方案中，H3亞型是，或HA來自H3病毒的威斯康星州/67/05分離株； 或H3亞型是，或HA來自H3病毒的香港/68分離株。在所有實施方案中，H9亞型是，或HA來自H9病毒的香港/1073/99分離株。在所有實施方案中，H5亞型是，或HA來自H5病毒的越南/1203/04分離株。在所有實施方案中，H2亞型是，或HA來自H2病毒的Adachi/1/1957分離株。在所有實施方案中，抗體或結合分子是與HlHA抗原和H3抗原交叉反應的抗體或結合分子。在一個其它實施方案中，本發明提供結合與對于包含重鏈多肽的抗體的表位實質上相同的表位的抗體或結合分子，所述重鏈多肽包含如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列或基于所述氨基酸序列的共有或變體序列。在另一實施方案中，抗體或結合分子結合與對于包含輕鏈多肽的抗體的表位實質上相同的表位，所述輕鏈多肽包含選自由SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5組成的組的氨基酸序列或基于所述氨基酸序列的共有或變體序列。在一個其它實施方案中，抗體或結合分子是(i)中和甲型流感病毒的一種以上亞型和/或一種以上分離株，( )結合所述病毒的血凝素(HA)抗原，和(iii)抑制血細胞凝集的抗體或結合分子。在一個實施方案中，本發明提供結合與對于包含重鏈多肽的抗體的表位實質上相同的表位的抗體或結合分子，所述重鏈多肽包含如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或基于所述氨基酸序列的共有或變體序列。在另一實施方案中，抗體或結合分子結合與對于包含輕鏈多肽的抗體的表位實質相同的表位，所述輕鏈多肽包含如SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列或基于所述氨基酸序列的共有或變體序列。在一個其它實施方案中，抗體或結合分子是(i)中和甲型流感病毒的一種以上亞型和/或一種以上分離株和(ii)結合所述病毒的血凝素(HA)抗原的抗體或結合分子。在另一實施方案中，本發明提供包含本文所述的結合分子或抗體的組合物。在另一方面，本發明提供在治療和/或預防有需要的受試者體內甲型流感病毒感染的方法。在一個實施方案中，所述方法包括對所述受試者施用有效量的本文所述的組合物。在另一實施方案中，所述方法包括對所述受試者施用有效量的本文所述的中和抗體或結合分子。在一個其它實施方案中，受試者是人患者。在另一方面，本發明提供有效針對甲型流感病毒感染的疫苗。在一實施方案中，疫苗包含在功能上模擬由本文所述的抗體或結合分子所結合的中和表位的肽或多肽。在另一實施方案中，疫苗是合成疫苗。在一個其它實施方案中，疫苗包含減毒的甲型流感病毒或CN 102482345 A說明書5/40 頁
其一部分。在另一實施方案中，疫苗包含滅活的甲型流感病毒或其一部分。在一個其它實施方案中，抗體或結合分子選自由以下組成的組(a)結合與對于包含重鏈多肽的抗體的表位實質上相同的表位的抗體或結合分子，所述重鏈多肽包含如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列或基于所述氨基酸序列的共有或變體序列；(b)包含含有重鏈多肽的重鏈多肽的抗體，所述重鏈多肽包含如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列或基于所述氨基酸序列的共有或變體序列；(c)結合與對于包含重鏈多肽的抗體的表位實質上相同的表位的抗體或結合分子，所述重鏈多肽包含如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或基于所述氨基酸序列的共有或變體序列，或其片段；和(d)包含重鏈多肽的抗體，所述重鏈多肽包含如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列或基于所述氨基酸序列的共有或變體序列，或其片段。在所有實施方案中，抗體結合HA抗原。HA抗原可選自由H3亞型、Hl亞型、H2亞型、Hl亞型和H3亞型、H5亞型、H9亞型和其任何組合組成的組。在一個實施方案中，抗原呈現于甲型流感病毒的表面上。在另一實施方案中，在功能上模擬由本文所述的抗體或結合分子所結合的中和表位的肽或多肽包含募集中和抗體的抗原決定簇。在另一實施方案中，疫苗適用于口服施用；經皮施用或腸胃外施用。在另一實施方案中，疫苗適用于經粘膜遞送。在一個其它實施方案中，經粘膜遞送是鼻內施用。在另一實施方案中，疫苗用于兒童期免疫。在一方面，本發明提供具有長度經修飾的重鏈環的流感中和抗體或結合分子。長度經修飾的鏈可為延長的重鏈環或縮短的重鏈環。在一個實施方案中，抗體或結合分子是結合能夠感染人的甲型流感病毒的血凝素的中和抗體或結合分子，其中和甲型流感病毒的至少一種分離株，抗體具有延長的重鏈環。在一個其它實施方案中，長度經修飾的重鏈環是 ⑶R3環或⑶Rl環。在另一實施方案中，⑶R3環包含氨基酸序列SEQ ID NO :9。在又一抗體中，⑶Rl環包含氨基酸序列SEQ ID NO :7。在另一方面，本發明提供具有降低的氧化電位的工程抗體或結合分子。在一個實施方案中，具有降低的氧化電位的工程抗體或結合分子是結合能夠感染人的甲型流感病毒的血凝素的抗體，其中和甲型流感病毒的至少一種分離株，在重鏈可變域中具有一個或多個蛋氨酸取代。在另一實施方案中，重鏈可變域是CDR3區。在一個其它實施方案中，根據 Kabat編號系統，蛋氨酸取代位于位置96和/或98處。在又一實施方案中，蛋氨酸被亮氨酸取代。在一個實施方案中，重鏈可變域包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29。


圖1說明通過重組平行發現的池以產生/增加交叉反應性來增加對兩個不同靶標 (靶標A和B)的反應強度的策略。重組抗體文庫的每一輪選擇增加所得池對兩個靶標的反
應強度。圖2說明增加與靶標B的交叉反應性同時維持與靶標A的反應性的策略。首先，選擇與靶標A反應的克隆，然后制備與靶標A反應的克隆的誘變文庫，且如同所示進行選擇， 得到一個或多個顯示與靶標A和靶標B的強反應性的抗體克隆。圖3說明通過“目的性誘變”方法產生不同多功能抗體集合的代表性誘變方法。圖4示出U86-C5抗體對來自HI、H3和H9的血凝素抗原的結合能力。圖5示出1286-A11抗體對來自H1、H3、H5和H9的血凝素抗原的結合能力。
圖6說明產生合并的抗體文庫的代表性方法。圖7A-E說明流感中和抗體的治療和保護作用。圖7A-B示出C05抗體針對高效價致命性H3N2病毒激發的預防作用。圖7C-D示出C05抗體針對致命性H3N2病毒激發的治療作用。圖7E示出C05抗體針對高效價季節性Hmi病毒激發的預防作用。圖8說明C05變體維持Hl和H3HA蛋白質的識別。圖9說明C05變體維持Hl和H3HA蛋白質的識別。發明詳述A.定義除非另外定義，否則本文所使用的技術和科學術語具有與本發明本領域的技術人員通常理解的含義相同的含義。Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 第 2 版，J. Wiley &Sons (New York, NY 1994)向本領域的技術人員提供本申請中所用的許多術語的一般指導。本領域的技術人員應認可可用于實踐本發明的與本文所述的方法和材料類似或等價的許多方法和材料。實際上，本發明無論如何不局限于所述方法和材料。出于本發明的目的，以下術語定義如下。術語“甲型流感亞型”或“甲型流感病毒亞型”可互換使用，且指以血凝素(H)病毒表面蛋白質為特征的甲型流感病毒變體，且因此用H編號標記，諸如H1、H3、H5和H9。另夕卜，亞型還可以神經氨酸酶(N)病毒表面蛋白質為特征，用N編號指示，諸如m和N2。同樣，亞型可用H與N編號提及，諸如Hmi、H2N2、H3N2、H5Nl、H5N2和H9N2。該術語特別包括各亞型內的所有菌株(包括滅絕的菌株)，通常由突變造成且顯示不同病原概況。所述菌株還將指病毒亞型的各種“分離株”，包含所有過去、現在和未來的分離株。因此，于此，術語 “菌株”和“分離株”可互換使用。亞型含有基于甲型流感病毒的抗原。抗原可基于血凝素病毒表面蛋白質且可稱為“HA抗原”。在一些情況下，所述抗原基于特定亞型的蛋白質，諸如Hl亞型和H3亞型，其可分別稱為Hl抗原和H3抗原。術語“流感”用于指由流感病毒引起的傳染性疾病。在本發明的情況下，術語“結合分子”以廣義使用且包括包含特異性結合靶標的多肽序列的任何分子。所述定義包括但不限于抗體和抗體片段、抗體樣分子和其片段，無論呈單體還是多聚形式，諸如同二聚或異二聚形式。多聚結合分子可通過共價和/或非共價相互作用保持其構形，且可彼此綴合和/或與分子或部分綴合，只要其保持結合靶標(例如， 在抗體的情況下，是抗原)的必需性質。“特異性結合”特定多肽或特定多肽上的表位或“對特定多肽或特定多肽上的表位特異的”的結合分子是結合特定多肽或特定多肽上的表位而基本上不結合任何其它多肽或多肽表位的分子。術語“綴合”是指共價或非共價鍵的任何和所有形式，且包括但不限于直接基因或化學融合、通過連接子或交聯劑偶合和例如通過范德華力或使用亮氨酸拉鏈的非共價締
I=I O術語“抗體”(Ab)以廣義使用且包括對特定抗原表現結合特異性的多肽以及缺乏抗原特異性的免疫球蛋白和其它抗體樣分子。后種多肽例如由淋巴系統以低水平產生且由骨髓瘤以高水平產生。在本申請中，術語“抗體”特別涵蓋但不限于單克隆抗體、多克隆抗體和抗體片段。術語“降低的氧化電位”或“降低的氧化異質性電位”是指含有具有至少一個從可氧化氨基酸取代為不可氧化氨基酸的氨基酸取代的多肽的抗體。氨基酸序列可為取代蛋氨酸的取代。抗體多肽可被選擇性地工程化以用不可氧化的氨基酸殘基置換蛋氨酸氨基酸殘基，從而提供具有降低的氧化電位的抗體。舉例來說，蛋氨酸可經亮氨酸、絲氨酸或丙氨酸取代。“天然抗體”通常是約150，000道爾頓的異四聚糖蛋白，包含兩條相同輕(L)鏈和兩條相同重(H)鏈。各輕鏈通過共價二硫鍵連接重鏈，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈的二硫鍵的數目不同。各重鏈和輕鏈還具有規律間隔的鏈內二硫鍵。各重鏈在一端具有可變域(VH)，接著是許多恒定域。各輕鏈在一端具有可變域(VL)且在它的另一端具有恒定域；輕鏈的恒定域與重鏈的第一恒定域對準，且輕鏈可變域與重鏈的可變域對準。認為特定氨基酸殘基在輕鏈可變域與重鏈可變域之間形成界面，Chothia等，J. Mol. Biol. 186 651 (1985) ；Novotny 和 Haber，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 82 :4592 (1985)。提及抗體鏈時術語“可變”用于指抗體鏈的在抗體間于序列方面廣泛不同且參與各特定抗體對它的特定抗原的結合和特異性的部分。在輕鏈與重鏈可變域中，所述可變性集中在三個稱為高變區的片段中。可變域的更高度保守的部分稱為骨架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各包含四個FR(分別為FR1、FR2、FR3和FR4)，主要采用由形成環連接的三個高變區連接的折疊構型，且在一些情況下，形成折疊結構的一部分。各鏈的高變區由FR緊密靠近地結合在一起，且與來自其它鏈的高變區一起有助于形成抗體的抗原結合位點(參看 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 片反.Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，Md. (1991)，第 647-669頁)。雖然恒定域并不直接參與抗體與抗原結合，但表現各種效應功能，諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性。術語“高變區”當在本文使用時是指抗體的負責抗原結合的氨基酸殘基。高變區包含來自“互補決定區”或“⑶R”的氨基酸殘基，即在輕鏈可變域中，指殘基30-36 (Li)、 46-55 (L2)和 86-96 (L3)且在重鏈可變域中，指殘基 30-35 (HI)、47_58 (H2)和 93-101 (H3)； MacCallum等，J Mol Biol. 1996。“骨架”或“FR”殘基是除如本文所定義的高變區殘基以外的那些可變域殘基。取決于其重鏈的恒定域的氨基酸序列，抗體可歸屬于不同的類別。有5種主要類別的抗體IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且其中數個可進一步分成亞類(同種型)，例如，IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4、IgA 和 IgA2。對應于免疫球蛋白不同類別的重鏈恒定域分別稱為α、δ、ε、Y和μ。來自任何脊椎動物物種的“輕鏈”，基于其恒定域的氨基酸序列，可歸屬于兩個稱為κ和λ的明顯不同類型中的一個。術語“抗體片段”是全長抗體的一部分，一般是其抗原結合域或可變域。抗體片段的實例包含但不限于Fab、Fab'、F(ab' )2和由抗體片段形成的Fv片段、線性抗體、單鏈抗體分子、雙鏈抗體和多特異性抗體。抗體片段的其它實例包含但不限于scFv、(ScFv)2, dAb (單域抗體)和互補決定區(CDR)片段和微抗體，微抗體是兩個環能夠組合誘變的最小可變域。
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術語“單克隆抗體”用于指由B細胞的單個克隆合成的抗體分子。修飾語“單克隆” 指示從基本上均一的抗體群獲得的抗體特性，且不應理解為需要由任何特定方法來制備抗體。因此，單克隆抗體可由 Kohler 和Milstein，Nature 256 :495(1975) ；Eur. J. Immunol. 6 511(1976)第一次描述的雜交瘤方法通過重組DNA技術制備，或還可從噬菌體抗體文庫中分離出來。術語“多克隆抗體”用于指由B細胞群合成的抗體分子群。“單鏈Fv”或“sFv”抗體片段包含抗體的VH和VL域，其中這些域存在于單個多肽鏈中。Fv多肽一般還包含VH與VL域之間的多肽連接子，該連接子使得sFv能夠形成抗原結合所需的結構。關于sFv之綜述,參看PlUckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 編著 Springer-Verlag, New York,第 269-315 頁(1994)。單鏈抗體例如公開在WO 88/06630和WO 92/01047中。術語“雙鏈抗體”是指具有兩個抗原結合位點的小抗體片段，所述片段包含于同一多肽鏈(Vh-VJ中與輕鏈可變域連接的重鏈可變域(Vh)。通過使用太短而不允許在同一鏈上的兩個域之間配對的連接子，迫使這些域與另一鏈的互補域配對并建立兩個抗原結合位點。雙鏈抗體更全面地描述于例如EP 404, 097 ；WO 93/11161 ；和Hollinger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444-6448(1993)中。術語“微抗體”用于指自裝配成SOkDa的二價二聚物(scFV-CH3)2的scFV-CH3融
合蛋白ο術語“適體”在本文中用于指以高特異性和親和力結合蛋白質靶標的合成核酸配體。適體被認為是具有蛋白質功能的有效抑制劑。dAb 片段(Ward 等，Nature 341 :544546(1989))由 Vh 域或 Vl 域組成。如本文所用的術語“抗體結合區”是指能夠結合抗原的免疫球蛋白的一個或多個部分或抗體可變區。抗體結合區通常是例如抗體輕鏈(VL)(或其可變區)、抗體重鏈(VH) (或其可變區)、重鏈Fd區、組合的抗體輕鏈和重鏈(或其可變區)，諸如Fab、F(ab' )2、單域或單鏈抗體(scFv)，或全長抗體，例如IgG (例如，IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞型)、IgAl、 IgA2、IgD、IgE 或 IgM 抗體。術語“雙特異性抗體”是指對兩種不同類型的抗原顯示特異性的抗體。如本文所用的術語特別包括但不限于對靶抗原和促進向特定組織遞送的另一靶標顯示結合特異性的抗體。類似地，多特異性抗體具有兩種或多種結合特異性。表述“線性抗體”用于指包含一對串聯Fd片段(Vh-ChI-Vh-ChI)，所述片段形成一對抗原結合區。線性抗體可以是雙特異性的或單特異性的，且由例如Zapata等，Protein Eng. 8(10) :1057-1062(1995)描述。出于本發明的目的，術語“抗體樣分子”包括除如上文所定義的抗體片段以外的能夠結合和中和病毒抗原的任何分子。所述術語特別包括但不限于前B細胞受體(pre-BCR) 樣結構，稱為“替代抗體”，包含替代輕鏈(SLC)元件，如例如以下中所描述2008年10月 2 日公開的 PCT 公開第 WO 2008/118970 號，和 Xu 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105 (31) 10756-61 (2008)。SLC是包含非共價締合的Vpre-B和λ 5蛋白質的非多樣性的異二聚體。 分別地，VpreB鏈與V λ Ig域同源，且λ 5鏈與典型的抗體的C λ域同源。在前BCR復合物中，異二聚SLC通過CX域與前BCR HC的第一恒定域之間的二硫鍵與重鏈共價締合。SLC的獨特特征在于VpreB 1和λ 5域各具有非典型的肽延伸。VpreBl在它的C末端具有另外的21個殘基，且λ 5在它的N末端具有50個氨基酸長的尾(參看例如Vettermarm等， Semin. Immunol. 18 :44-55 (2006)) 0替代抗體結構特別包含但不限于前BCR的天然三聚前 BCR樣功能單元、VpreBl與λ 5的融合物和消除λ 5Ν末端50個氨基酸或VpreBlC末端21 個氨基酸或這兩個肽延伸的三聚物。另外，替代抗體的定義內特別包括使用典型抗體輕鏈的恒定組分的嵌合構建體。如本文所定義的“抗體樣分子”的其它代表物具有類似結構，包含抗體替代κ輕鏈序列，其中κ輕鏈序列任選地與另一多肽(諸如抗體重鏈和/或輕鏈域序列)搭配。已利用K樣替代輕鏈(K樣SLC)鑒別K樣B細胞受體(K樣BCR) (Frances等，EMBO J 13 :5937-43(1994) ；Thompson 等，Immunogenetics 48:305-11(1998) ；Rangel 等，J Biol Chem280 17807-14 (2005)) Rangel 等，J Biol Chem 280(18) :17807-17814(2005)報道了 Vk樣蛋白質的鑒別和分子表征，該Vk樣蛋白質是未重排的VK基因的產物，其證明與 Thompson 等，Immunogenetics48 :305-311 (1998)先前報道的 cDNA 序列一致。而 Frances 等，EMBO J13 =5937-43(1994)報道了重排生殖系JCk的鑒別和表征，該重排生殖系JC κ 能夠在B細胞前體的表面與μ重鏈締合，從而提供B細胞發育的λ5通路的替代物。已提出，κ樣和λ樣pre-BCR協同作用以促進輕鏈重排且確保B細胞祖細胞的突變。對于綜述，參看 McKeller 禾口 Martinez-Valdez Seminars in Immunology 18:4043(2006)。術語“ λ 5”在本文中以廣義使用且是指任何天然的序列或變體λ 5多肽，特別包括但不限于天然序列人和其它哺乳動物λ 5多肽和由翻譯后修飾形成的變體以及所述天然序列多肽的變體。術語“變體VpreB多肽”和“VpreB多肽的變體”可互換使用，且在本文中定義為因氨基酸修飾而在一個或多個氨基酸位置與天然序列VpreB多肽不同的多肽。如本文所定義的“變體VpreB多肽”將與天然抗體λ或κ輕鏈序列或其片段不同。“變體VpreB多肽” 優選將保留至少約65%、或至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約98%的與天然序列VpreB多肽的序列同一性。在另一優選的實施方案中，“變體VpreB多肽”在它的氨基酸序列與天然抗體λ或κ輕鏈序列的同一性方面將小于95%、或小于90%、或小于85%、或小于80%、或小于75%、或小于 70%、或小于65%或小于60%。變體VpreB多肽特別包含但不限于VpreB多肽，其中VpreB 序列的C末端的非Ig樣獨特的尾部被部分或完全去除。術語“變體λ5多肽”和“λ5多肽的變體”可互換使用，且在本文中定義為因氨基酸修飾而在一個或多個氨基酸位置與天然序列λ 5多肽不同的多肽。如本文所定義的“變體λ 5多肽”將與天然抗體λ或κ輕鏈序列或其片段不同。“變體λ 5多肽”優選將保留至少約65%、或至少約70%、或至少約 75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%或至少約98%的與天然序列λ5多肽的序列同一性。在另一優選的實施方案中，“變體λ 5多肽”在它的氨基酸序列與天然抗體λ或κ輕鏈序列的同一性方面將小于95%、或小于90%、或小于85%、或小于80%、或小于75%、或小于70%、或小于65%或小于60%。變體λ 5多肽特別包含但不限于λ5多肽，其中λ 5序列的N末端的獨特的尾部被部分或完全去除。術語“VpreB序列”在本文中用于指如上文所定義的“VpreB”序列或其片段。術語“ λ 5序列”在本文中用于指如上文所定義的“ λ 5”序列或其片段。
如本文所定義的術語“替代輕鏈序列，，意指包含如上文所定義的“VpreB序列，，和 /或“ λ 5序列，，的任何多肽序列。術語“ κ樣替代輕鏈可變域”、“VK樣SLC”和“VK樣”可互換使用，且指未重排 Vk基因的產物的任何天然的序列多肽和其變體。在一個實施方案中，天然序列VK樣多肽的變體包含相對于抗體κ輕鏈序列的C末端延伸(尾部)。在一特定的實施方案中，天然序列Vκ樣多肽的變體保留區分Vκ樣多肽與相應抗體κ輕鏈的獨特C末端延伸(尾部)的至少一部分且優選全部。在另一實施方案中，變體Vk樣多肽的C末端尾部是與序列的剩余部分非天然締合的序列。在后者實施方案中，天然Vk樣序列與變體序列中天然存在的C末端尾部之間的差異可由一個或多個氨基酸變化(取代、插入、缺失和/或添加) 造成，或C末端尾部可與不同的Vk樣蛋白質中天然存在的尾部相同。VK樣多肽可在對應于一個或多個抗體κ輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列的區中含有氨基酸變化。在所有情況下，相對于天然抗體κ輕鏈可變區序列，變體可且優選地包含具有至少4個、或至少5個、 或至少6個、或至少7個、或至少8個、或至少9個、或至少10個氨基酸，優選4-100個、或 4-90個、或4-80個、或4-70個、或4_60個、或4_50個、或4_45個、或4_40個、或4_35個、 或4-30個、或4-25個、或4-20個、或4_15個、或4_10個氨基酸殘基的C末端延伸。如本文所定義，Vk樣多肽變體將與天然抗體κ或λ輕鏈序列或其片段不同，且優選將保留至少約65%、或至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、 或至少約95%、或至少約98%的與天然序列Vk多肽的序列同一性。在另一優選的實施方案中，Vk樣多肽變體在它的氨基酸序列與天然抗體λ或Κ輕鏈序列的同一性方面將小于95%、或小于90%、或小于85%、或小于80%、或小于75%、或小于70%、或小于65%、或小于60%、或小于55%、或小于50%、或小于45%、或小于40%。在其它實施方案中，序列同一性介于約40%與約95%之間、或介于約45%與約90%之間、或介于約50%與約85% 之間、或介于約55%與約80%之間、或介于約60%與約75%之間、或介于約60%與約80% 之間、或介于約65%與約85%之間、或介于約65%與約90%之間或介于約65%與約95% 之間。在所有實施方案中，Vk樣多肽優選能夠結合靶標。術語“ JC κ，，和“ JC κ樣”可互換使用，且是指包含與天然序列κ J恒定(C)區片段相同的一部分和獨特的N末端延伸(尾部)的天然序列多肽和其變體。在一個實施方案中，天然序列JCk樣多肽的變體包含區分其與抗體JC片段的N末端延伸(尾部)。在一個特定的實施方案中，天然序列JCk樣多肽的變體保留區分JCK樣多肽與相應抗體κ輕鏈JC片段的獨特N末端延伸(尾部)的至少一部分且優選全部。在另一實施方案中，變體 JCk樣多肽的N末端尾部是與序列的剩余部分非天然締合的序列。在后者實施方案中，天然JCk樣序列與變體序列中天然存在的N末端尾部之間的差異可由一個或多個氨基酸變化(取代、插入、缺失和/或添加)引起，或N末端尾部可與不同的JCk樣蛋白質中本質上存在的尾部相同。天然序列JCk樣多肽的變體可在與天然抗體κ可變域JC序列相同的序列的一部分中含有一個或多個氨基酸變化。在所有情況下，相對于天然抗體κ輕鏈JC 序列，變體可且優選確實包含具有至少4個、或至少5個、或至少6個、或至少7個、或至少8 個、或至少9個、或至少10個氨基酸，優選4-100個、或4-90個、或4_80個、或4_70個、或 4-60個、或4-50個、或4-45個、或4_40個、或4_35個、或4_30個、或4_25個、或4_20個、 或4-15個、或4-10個氨基酸殘基的N末端延伸(獨特的N末端)。如本文所定義，JC κ樣多肽變體將與天然抗體κ或λ輕鏈JC序列或其片段不同，且優選將保留與天然序列JC 多肽至少約65%、或至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約 90%、或至少約95%或至少約98%的序列同一性。在另一優選的實施方案中，JCk樣多肽變體在它的氨基酸序列與天然抗體λ或κ輕鏈JC序列的同一性方面將小于95%、或小于 90%、或小于85%、或小于80%、或小于75%、或小于70%、或小于65%或小于60%。在其它實施方案中，序列同一性介于約40%與約95%之間、或介于約45%與約90%之間、或介于約50%與約85%之間、或介于約55%與約80%之間、或介于約60%與約75%之間、或介于約60%與約80%之間、或介于約65%與約85%之間、或介于約65%與約90%之間或介于約65%與約95%之間。氨基酸序列同一性百分比可使用序列比較程序NCBI-BLAST2進行測定(Altschul 等，Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402 (1997))。NCBI-BLAST2 序列比較程序可從 http // www. ncbi. nlm. nih. gov下載或從the National Institute of Health, Bethesda,MD獲得。 NCBI-BLAST2使用數個搜索參數，其中這些搜索參數全部設定為默認值，包括例如unmask =yes, strand = all，expected occurrences = 10，minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0. 01,constant for multi-pass = 25,dropoff for final gapped alignment = 25 禾口 scoring matrix = BL0SUM62。術語“融合”在本文中用于指不同起源的氨基酸序列通過在框內組合其編碼核苷酸序列而組合于一個多肽鏈中。術語“融合”除融合于它的一個末端以外，還明確地涵蓋內部融合，即，將不同起源的序列插入多肽鏈內。如本文使用的術語“肽”、“多肽”和“蛋白質”都是指通過共價“肽鍵”連接的初級氨基酸序列。肽一般由幾個氨基酸組成，通常約2個至約50個氨基酸，且比蛋白質短。術語“多肽”如本文所定義涵蓋肽和蛋白質。術語“氨基酸”或“氨基酸殘基”通常是指具有它的領域所認可的定義的氨基酸， 諸如選自由以下組成的組的氨基酸丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；組氨酸(His) ’異亮氨酸(Ile)；亮氨酸(Leu)；賴氨酸(Lys)；蛋氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)； 絲氨酸Ger)；蘇氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和纈氨酸(Val)，但需要時，可使用經修飾的、合成的或稀有氨基酸。因此，37CFR1. 822 (b)(4)中所列的經修飾和非天然氨基酸特別包含在這一定義內且以明確引用的方式并入本文。氨基酸可再分成各種亞組。因此，氨基酸可分成以下組具有非極性側鏈Hfi^n，Ala、CyS、Ile、Leu、Met、Phe、Pr0、Val)； 具有帶負電側鏈(例如，Asp、Glu)；具有帶正電側鏈(例如，Arg, His、Lys)；或具有不帶電極性側鏈(例如，Asn, Cys、Gin、Gly、His、Met、Phe, Ser、Thr、Trp 和 Tyr)。氨基酸也可分成以下組小氨基酸(Gly、Ala)，親核氨基酸(kr、His、Thr, Cys)、疏水性氨基酸(Val、 Leu、lie、Met、ftx))、芳香族氨基酸(Phe、Tyr、Trp、Asp、Glu)、酰胺(Asp、Glu)和堿性氨基酸(Lys、Arg)。術語“多核苷酸”是指核酸，諸如DNA分子和RNA分子以及其類似物(例如，使用核苷酸類似物或使用核酸化學產生的DNA或RNA)。需要時，多核苷酸可例如使用領域內認可的核酸化學合成制備或使用例如聚合酶酶促制備，且需要時，可進行修飾。典型的修飾包括甲基化、生物素化(biotinylation)和其它的領域內已知的修飾。另外，核酸分子可為單
17鏈或雙鏈，且需要時，連接于可檢測的部分。關于參考多肽而言，術語“變體”是指與天然多肽相比，具有至少一個氨基酸突變或修飾(即，變化)的多肽。可例如通過取代、缺失、插入和/或化學修飾天然氨基酸序列的至少一個氨基酸來制備由“氨基酸修飾”產生的變體。“氨基酸修飾”是指預定氨基酸序列的氨基酸序列的變化。示例性的修飾包含氨基酸取代、插入和/或缺失。“指定位置的氨基酸修飾”是指指定殘基的取代或缺失，或鄰近指定殘基插入至少一個氨基酸殘基。所謂“鄰近”指定殘基插入意指在其一個至兩個殘基內插入。插入可為指定殘基的N末端或C末端。“氨基酸取代，，是指用另一不同“置換”氨基酸殘基置換預定氨基酸序列中的至少一個現有氨基酸殘基。置換殘基可為“天然存在的氨基酸殘基”(即，由遺傳密碼編碼)且選自由以下組成的組丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；組氨酸(His)；異亮氨酸(Ile)； 亮氨酸(Leu)；賴氨酸(Lys)；蛋氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；絲氨酸(Ser)； 蘇氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和纈氨酸(Val)。用一個或多個非天然存在的氨基酸殘基取代也為本文氨基酸取代的定義所涵蓋。“非天然存在的氨基酸殘基”是指除以上列出的那些天然存在的氨基酸殘基以外的殘基，其能夠共價結合鄰近的多肽鏈中的氨基酸殘基。非天然存在的氨基酸殘基的實例包括正亮氨酸、鳥氨酸、正纈氨酸、高絲氨酸和其它氨基酸殘基類似物，諸如Ellman等， Meth. Enzym. 202 :301 336(1991)中所述的氨基酸。為產生所述非天然存在的氨基酸殘基， 可使用Noren等，Science 244:182(1989)和Ellman等(同上)的程序。簡言之，這些程序包括用非天然存在的氨基酸殘基化學活化抑制基因tRNA，接著體外轉錄和翻譯RNA。“氨基酸插入”是指在預定氨基酸序列中并入至少一個氨基酸。雖然插入通常將由插入一個或兩個氨基酸殘基組成，但本申請涵蓋較大的“肽插入”，例如插入約3個至約5個或甚至多達約10個氨基酸殘基。如以上所公開，插入的殘基可以是天然存在的或非天然存在的。“氨基酸缺失”是指從預定氨基酸序列中移除至少一個氨基酸殘基。除非另有說明，否則術語“誘變”是指改變多核苷酸或多肽序列的任何本領域內認可的技術。優選的誘變類型包括易錯PCR誘變、飽和誘變或其它定點誘變。“定點誘變”是本領域的技術標準，且使用與單鏈噬菌體DNA互補的合成寡核苷酸引物實施，該單鏈噬菌體DNA欲進行除有限錯配以外的誘變處理，產生所需突變。簡言之， 使用合成的寡核苷酸作為引物以指導合成與單鏈噬菌體DNA互補的鏈，且將所得雙鏈DNA 轉化到噬菌體支撐的宿主細菌中。將所轉化細菌的培養物涂鋪于頂部瓊脂中，使得從含噬菌體的單一細胞形成菌斑。理論上，50%的新菌斑將含有具有突變形式作為單鏈的噬菌體； 50%將具有原始序列。通過在允許確切匹配的雜交但與原始鏈的錯配足以阻止雜交的溫度下與激酶化的合成引物雜交來選擇目標菌斑。然后選擇與探針雜交的菌斑，測序并培養，且回收DNA。術語“中和分子”在本文中廣義地使用且是指抑制病毒重復感染靶細胞的任何分子，而不管實現中和的機理。中和分子優選為如上文所定義的抗體或抗體樣分子或結合分子。中和可例如通過抑制病毒于細胞表面的附著或粘附，例如通過使分子工程化來實現，該分子諸如直接結合負責病毒的附著或粘附的位點的或結合在其附近的抗體或抗體樣分子或結合分子。中和也可通過指向病毒粒子表面的分子(諸如抗體或抗體樣分子的分子)實現，其中所述分子指向病毒粒子表面導致病毒粒子聚集。中和還可通過繼病毒附著于靶細胞之后抑制病毒與細胞膜的融合、通過抑制內吞作用、抑制來自受感染細胞的子代病毒等來發生。本發明的中和分子，諸如抗體或抗體樣分子或結合分子，不受實現中和的機理所限制。術語“抗體譜”在本文中廣義地使用且是指可用于對特定性質篩選的抗體或抗體片段的集合，所述特定性質諸如結合能力、結合特異性、胃腸運輸能力、穩定性、親和力等。 術語特別包括抗體文庫，包括所有形式的組合文庫，諸如抗體噬菌體展示文庫，包括但不限于任何來源的單鏈FV(SCFV)和Fab抗體噬菌體展示文庫，包括天然、合成和半合成文庫。類似地，“抗體樣分子譜”(如上文所定義)是指可用于對特定性質篩選的所述分子的集合，所述特定性質諸如結合能力、結合特異性、胃腸運輸能力、穩定性、親和力等。術語特別包括替代抗體文庫和K樣輕鏈構建體(如上文所定義)文庫，包括所有形式的組合文庫，諸如噬菌體展示文庫。組合替代抗體文庫公開在例如在Xu等，(2008)，同上。術語“抗體譜”在本文中廣義地使用且是指可用于對特定性質篩選的抗體或抗體片段的集合，所述特定性質諸如結合能力、結合特異性、胃腸運輸能力、穩定性、親和力等。 術語特別包括抗體文庫，包括所有形式的組合文庫，諸如抗體噬菌體展示文庫，包括但不限于任何來源的單鏈FV(SCFV)和Fab抗體噬菌體展示文庫，包括天然、合成和半合成文庫。“噬菌體展示文庫”是表達克隆的蛋白質序列的集合作為與噬菌體外殼蛋白的融合物的蛋白質表達文庫。因此，用語“噬菌體展示文庫”在本文中是指噬菌體(例如，絲狀噬菌體)的集合，其中噬菌體表達外部(通常異源)蛋白質。外部蛋白質能夠自由地與噬菌體接觸的其它部分相互作用(結合)。每一展示外部蛋白質的噬菌體都是噬菌體展示文庫的“成員”。“抗體噬菌體展示文庫”是指展示抗體或抗體片段的噬菌體展示文庫。抗體文庫包含噬菌體群或編碼所述噬菌體群的載體的集合或含有所述噬菌體或載體的集合的細胞。文庫可為單價的，平均每個噬菌體粒子展示一個單鏈抗體或抗體片段，或為多價的，平均每個病毒粒子展示兩個或多個抗體或抗體片段。術語“抗體片段”包括但不限于單鏈FV(SCFV) 片段和Fab片段。優選的抗體文庫平均包含IO6個以上、或IO7個以上、或IO8個以上或IO9 個以上不同的成員。術語“絲狀噬菌體”是指能夠在其表面上展示異源多肽的病毒粒子，且包括但不限于Π、fd、Pfl*M13。絲狀噬菌體可含有選擇標記，諸如四環素(例如，“fd-tet”)。 本領域技術人員熟知各種絲狀噬菌體展示體系(參看例如^cher等，Gene 9 127-140(1980) ；Smith 等，Science 228 :1315-1317(1985)；和 Parmley 和 Smith，Gene 73: 305-318(1988))。術語“淘選(panning) ”用于指鑒別和分離攜帶對靶標具有高親和力和特異性的化合物(諸如抗體)的噬菌體的多輪篩選過程。如本文所用的術語“非人動物”包括但不限于哺乳動物，諸如非人靈長類動物、嚙齒動物(例如，小鼠和大鼠)和非嚙齒動物(諸如兔、豬、綿羊、山羊、牛、豬、馬和驢)。它還包括禽類(例如，家雞、火雞、鴨、鵝等)。如本文所用的術語“非靈長類動物”是指除靈長類動物以外的哺乳動物，包括但不限于以上特別列出的哺乳動物。詞語“功能上不同的抗體”和其語法變體用于指至少一種性質彼此不同的抗體，所述性質包括但不限于結合特異性、結合親和力和任何免疫或生物功能，諸如中和靶標的能力、生物活性的程度或質量等。詞語“保守氨基酸殘基”用于指彼此比對的兩個或多個氨基酸序列之間相同的氨
基酸殘基。如本文所用的術語“表位”是指具有至少約3至5個、優選至少約5至10個或至少約5至15個氨基酸且通常不超過約500個或約1，000個氨基酸的序列，其界定單獨或作為較大序列的一部分而結合響應于所述序列所產生的抗體的序列。表位不局限于具有與衍生這一表位的母蛋白質的一部分相同的序列的多肽。實際上，病毒基因組處于恒定變化的狀態，且分離株之間表現相對較高程度的可變性。因此，術語“表位”涵蓋與天然序列相同的序列，以及天然序列的修飾，諸如缺失、取代和/或插入。雖然所述修飾在性質上一般是保守的，但也涵蓋非保守的修飾。術語特別包括“模擬表位(mimotope) ”，也就是不鑒別連續的線性天然序列或天然蛋白質中未必存在但功能上模擬天然蛋白質上的表位的序列。術語“表位”特別包括線性和構型表位。B. 一般技術進行本發明方法的技術在本領域中眾所周知，且描述于標準實驗室教科書中，包括例如 Ausubel 等，Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997) ；Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第 3 版，J. Sambrook 禾口 D. W. Russell 編著，Cold Spring Harbor,New York,USA, Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001 ；Antibody PhaRe Display-Methods and Protocols, P.M. 0 ' Brian 禾口 R. Aitken編著，Humana Press,Methods in Molecular Biology, M 178^ ；Phage Display A Laboratory Manual,C. F. Barbas III 等編著，Cold Spring Harbor,New York,USA,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001 ；禾口 Antibodies, G. Subramanian 編著，Kluwer Academic, 2004ο 誘變可例如使用定點誘變進行(Kunkel 等，Proc. Natl. Acad, ki USA 82 488-492(1985))。在一方面，本發明的病毒抗原中和分子是抗體，其通常使用抗體或多樣化多肽文庫選擇。雖然在以下描述中，本發明參考某些類型的抗體文庫說明，但本發明不局限于使用任何特定類型的抗體或多樣化多肽文庫。重組單克隆抗體文庫可基于免疫片段或天然片段。來自免疫抗體文庫的抗體通常用Vh和\基因池構建，將所述Vh和\基因池從源B 細胞克隆到用于表達的適當載體中以產生隨機組合文庫，這一文庫接著可被選擇和/或篩選。其它類型的文庫可包含來自不明確偏好結合抗原的克隆的基因來源的抗體片段。因此，天然抗體文庫從天然的未免疫的重排V基因衍生。合成抗體文庫完全通過體外方法構建，在一個或多個V基因的CDR中引入具有全簡并度或修整簡并度的區域。半合成文庫組合天然與合成的多樣性，且通常建立以增加天然多樣性，同時維持所需水平的功能多樣性。因此，所述文庫可例如通過改組天然CDR區(Soderlind等，Nat. Biotechnol. 18 852-856 (2000))，或通過組合來自人B細胞的天然重排的⑶R序列與合成c⑶Rl與⑶R2多樣性(Hoet等，Nat. Biotechnol. 23 :455-38(2005))來建立。本發明涵蓋使用天然、合成和半合成抗體文庫或其任何組合。類似地，本發明的方法不受用于抗體展示的任何特定技術限制。雖然本發明參考噬菌體展示說明，但本發明的抗體還可用其它展示和富集技術鑒別。抗體片段已展示于編碼抗體基因的絲狀噬菌體的表面上(Hoogenboom和Winter J. Mol. Biol, 222 381388(1992) ；McCafferty 等，Nature 348(6301) :552 554(1990) ；Griffiths 等， EMBO J. ,13(14) :3245-3260(1994)).關于選擇和篩選抗體文庫的技術的綜述，參看例如 Hoogenboom, Nature Biotechnol. 23(9) :1105-1116(2005)。另外，本領域中已知多種系統， 所述系統展示異源蛋白質和其片段于大腸桿菌(Escherichia coli)表面上(Agterberg 等，Gene 88 :37-45(1990) ；Charbit 等，Gene 70 :181-189(1988) ；Francisco 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :2713-2717 (1992))，和酵母上，諸如釀酒酵母(Saccharonyces cerevisiae)(Boder 禾口 Wittrup, Nat. Biotechnol. 15 :553-557(1997) ；Kieke 等，Protein Eng. 10 :1303-1310(1997)) ο其它已知的展示技術包括核糖體或mRNA展示(Mattheakis 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA91 :9022-9026(1994) ；Hanes 禾口 Pluckthun，Proc. Natl. Acad ki. USA94 :4937-4942(1997))、DNA 展示(Yonezawa 等，Nucl. Acid Res. 31(19) ell8(2003))；微生物細胞展示，諸如細菌展示(Georgiou等，Nature Biotech. 15 29-34 (1997))；展示于哺乳動物細胞上，孢子展示(Isticato等，J. Bacteriol. 183 6294-6301(2001) ；Cheng 等，Appl. Environ. Microbiol. 71 :3337-3341 (2005)和 2006 年 11月13日提交的共同代決臨時申請第60/865，574號)；病毒展示，諸如逆轉錄病毒展示 (Urban等，Nucleic Acids Res. 33 :e35 (2005))；基于蛋白質-DNA連接的展示(Odegrip 等， Proc. Acad. Natl. Sci. USA 101 :2806-2810(2004) ；Reiersen 等，Nucleic Acids Res. 33 el(K2005))，和微珠展示(S印ρ 等，FEBS Lett. 532 :455-458 (2002)) C.優選實施方案的詳細描述在一方面，本發明涉及單克隆抗體和抗體樣分子的選擇、制備和用途，所述單克隆抗體和抗體樣分子中和甲型流感病毒的一個以上亞型和/或一個以上分離株，結合所述病毒的血凝素(HA)抗原，但不抑制血細胞凝集。甲型流感病毒的病毒粒子含有8個片段的線性反義單鏈RNA。總基因組長度是 13600個核苷酸，且8個片段的長度分別為2350個核苷酸、2350個核苷酸、2250個核苷酸、 1780個核苷酸、1575個核苷酸、1420個核苷酸、1050個核苷酸和900個核苷酸。甲型流感病毒的宿主特異性和減毒已個別地或以病毒基因的組合歸因于病毒血凝素(H，HA)、核蛋白 (NP)、矩陣(M)和非結構(NS)基因(參看例如，Rogers 等，Virology 127 :361-373(1983)； Scholtissek Virologyl47 :287-294(1985) ；Snyder J. Clin. Microbiol. 24 467-469(1986) ；Tian J. Virol. 53 :771-775 (1985) ；Treanor Virology 171 1-9(1989))。甲型流感病毒和它們的表面蛋白質(包括血凝素和神經氨酸酶蛋白質)的核苷酸和氨基酸序列可從GenBank和其它序列數據庫，諸如洛斯阿拉莫斯國家實驗室(Los Alamos National Laboratory)的理論生物學和生物物理學組(Theoretical Biology and Biophysics Group)維護的流感序列數據庫(Influenza Sequence Database))獲得。甲型流感病毒血凝素的15種已知H亞型(H1-H15)的氨基酸序列示出在2008年1月17日公開的美國申請公開No. 20080014205中，所述申請公開以全文引用的方式并入本文中。
21最近從瑞典的黑頭鷗中分離出另外的甲型流感病毒血凝素亞型(H16)，且由Rmchier等， J. Virol. 79(5) =2814-22(2005)報道。還已知各H亞型的多種菌株。舉例來說，命名為H5A/ 香港/156/97的HA蛋白質的序列從1997年5月在香港由人分離的甲型H5W病毒測定，且在Suarez等，J. Virol. 72 :6678-6688(1998)中與從其它相關H5m分離株獲得的數種另外的菌株的序列比較顯示。流感病毒神經氨酸酶的催化和抗原位點的結構已由Colman等，Nature 303 41-4 (1983)公開，且神經氨酸酶序列可從GenBank和其它序列數據庫獲得。已知由受感染個體的免疫反應產生的病毒特異性抗體通常經由與病毒血凝素相互作用來中和病毒(Ada 等，Curr. Top. Microbiol. Immunol. 128 :1-54(1986) ；Couch 等， Annu. Rev. Micobiol. 37 =529-549 (1983)) 流感病毒血凝素的三維結構和流感病毒血凝素與中和抗體之間的復合物的晶體結構也已確定并公開，參看例如Wi 1 son等，Nature289 366-73(1981) ；Ruigrok 等，J. Gen. Viro. 169 (Pt 11) :2785-95(1988) ；Wrigley 等， Virology 131(2) :308-14(1983) ；Daniels 等，EMBO J. 6 1459-1465 (1987)；和 Bizebard 等，Nature 376 :92-94(2002)。根據本發明，具有所需性質的抗體從一個或多個抗體文庫中鑒別，而所述文庫可來自多種來源且可具有不同類型。綜合人流感抗體文庫綜合人流感抗體文庫可從自患各種先前流感、季節性爆發流行病和大流行的恢復期患者獲得的抗體建立，所述流感包括1968年香港流感(H3N2)、1957年亞洲流感(H2N2)、 1918年西班牙流感(HlNl)和2004/2005年禽流感(H5N1)。例如參看2008年1月17日公開的美國申請公開No. 20080014205，其以全文引用的方式并入本文中。為制備所述文庫， 從已知或懷疑感染流感病毒的個體收集血液或骨髓樣本。外周血液樣本、尤其是來自偏遠地區來源的外周血液樣本在運輸和使用之前可能需要穩定。用于這一目的的試劑盒眾所周知且市面上有售，諸如BDVacutainer CPT 細胞制備試管可用于離心純化淋巴細胞，且使用guanidium、Trizol或RNAlater穩定樣本。收到穩定的淋巴細胞或整個骨髓后，使用本領域已知的免疫球蛋白低聚引物進行RT-PCR以獲得重鏈和輕鏈系。遵循本領域已知的程序，使PCR譜產物與連接子低聚物組合以產生scFv文庫，從而與ml3PIII蛋白質直接克隆于框內。在典型方案中，人血清中的抗體可通過熟知的血清學測定檢測，包括例如通過熟知的血凝素抑制(HAI)測定(Kendal，Α. P.，Μ. S. Pereira 和 J. J. Skehel. 1982. Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance. U. S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control, Atlanta，Georgia)，或微中和測定(Harmon 等，J. Clin. Microbiol. 26 :333-337 (1988))。如果血清樣本已證實含有流感中和抗體，那么這一檢測步驟可能不是必要的。接著利用本領域已知的方法加工來自全血的淋巴細胞或骨髓中存在的淋巴細胞。用Tri BD試劑(Sigma) 從新鮮組織或RNAlater穩定的組織中提取全部RNA。接著，使用Oligotex純化^jiagen) 將分離的供體總RNA進一步純化為mRNA。接著，根據Accukript逆轉錄酶(Stratagene) 的方案，通過使用隨機九聚物寡核苷酸和或低聚((11%8引物產生第一鏈cDNA合成。簡言之， 在 65°C下將 Accuscript RT 緩沖液(Stratagene)中的 IOOng mRNA、0. 5mMdNTP 和 300ng 隨機九聚物和或500ng低聚((11%8引物孵育5分鐘，接著快速冷卻到4°C。然后，向各反應中添加IOOmM DTT、Accuscript RT和RNAse阻斷劑，并在42°C下孵育1小時，且通過在70°C 下加熱15分鐘使逆轉錄酶失活。可使用所獲得的cDNA作為模板來進行抗體重鏈和輕鏈V 基因的RT-PCR擴增，然后可克隆到載體中，或如果預期用噬菌體展示文庫，那么克隆到噬粒載體中。這一程序產生抗體重鏈和輕鏈可變區克隆譜(％和\庫)，其可分開或組合用于篩選。可以與上述方式類似的方式回收、穩定和獲取來自早期流行病和大流行(諸如 1918年西班牙流感)的存活者的外周淋巴細胞的免疫球蛋白譜。對于另外的Hl和H3文庫，可從適當計時的接種疫苗的局部源供體回收譜。作為另一方案，可從商業來源購買市面上有售的骨髓總RNA或mRNA以產生適合Hl和H3的文庫，且取決于供體背景，還適合H2抗體篩選。合成人樣譜在本發明的方法中，合成的人抗體譜可由合成的抗體文庫代表，所述文庫可利用本領域已知的方法制備或從商業來源獲得。因此，完全合成的人譜例如描述于Horowitz 等，2009年3月沈日公開的美國專利申請公開No. 20090082213中，其全文在此以引用的方式明確地并入本文。簡言之，這一專利申請描述免疫球蛋白文庫，其中已將預定氨基酸組合引入目標免疫球蛋白的一個或多個互補決定區中。另外，例如通用的免疫球蛋白文庫(包括所述庫的子集)描述于2003年12月11日公開的美國專利申請公開No. 20030228302中， 其全文在此以引用的方式明確地并入本文。具有各種突變的抗體重鏈和輕鏈的特異性子文庫可組合以提供本發明抗體的骨架構建體，接著在重鏈與輕鏈的CDR中引入多樣性。這一多樣性可利用本領域已知的方法實現，例如通過Kimkel誘變，且可重復數次以進一步增加多樣性。因此，例如可通過多輪 Kunkel誘變單獨或同時于重鏈與輕鏈⑶Rl和⑶2區中引入多樣性。必要時，可根據⑶R長度分離各種Kunkel克隆和/或可移除靶CDR(例如，CDRl或CDR3)中缺乏多樣性的克隆， 例如通過用模板特異性限制酶消化。這些步驟完成之后，文庫尺寸應超過約IO9個成員，但具有更少成員的文庫也適用。在一具體的實施方案中，使用免疫的抗體文庫與合成的抗體文庫鑒別本發明的中和抗體。這兩種類型的文庫根本上不同。合成的抗體文庫是具有預測的結合抗原的能力的人抗體的合成集合，而免疫譜視情況將含有特別地識別禽類H5血凝素和/或HI、H2或H3 血凝素的序列。因此，免疫譜理論上經優化以識別靶流感亞型的關鍵組件。由于這些差異， 這兩種方法產生不同的抗體組，且因此提供用于鑒別所需中和抗體的更有效的方法。高免疫的非人靈長類動物抗體文庫在這一方法中，從高免疫的非人靈長類動物(諸如獼猴或狒狒)獲得抗體文庫。具體地說，用甲型流感病毒的各種亞型或用各種血凝素(H)蛋白質使非人靈長類動物免疫。 將發展識別甲型流感病毒亞型或血凝素的抗體的效價的動物處死并采集它們的脾臟，其中用甲型流感病毒亞型或血凝素免疫動物。收集免疫動物的血液或骨髓，且如上所述收集所產生的抗體并擴增以獲得綜合流感抗體文庫。分離本發明中和抗體的策略無論所用抗體文庫的類型如何，都可發現具有雙特異性的抗體，諸如對兩種不同甲型流感亞型和/或同一亞型的兩個不同菌株(分離株)和/或人與非人分離株顯示反應性的抗體，且通過控制的交叉反應性選擇和/或定向組合和/或誘變工程化來優化。在圖1中所說明的典型的富集方案中，對包含對稱為靶標A和靶標B的兩個靶標顯示交叉反應性的抗體的文庫進行多輪富集(參看2008年1月17日公開的美國申請公開 No. 20080014205，其全文以引用的方式并入本文)。如果富集基于與靶A的反應性，那么每一輪富集都將增加池針對靶標A的反應強度。類似地，如果富集基于對靶標B的反應性，那么每一輪富集都將增加池針對靶標B的反應強度。雖然這一方法是指淘選，即篩選噬菌體展示文庫時所用的選擇方法(參看下文)，但是所述方法同樣適用于上文討論的任何類型的文庫，本領域以其它方式已知的其它文庫和任何類型的展示技術。靶標A與靶標B包含抗體結合的任何靶標，包括但不限于流感病毒的各種分離株、類型和亞型。因為本發明的目標是鑒別具有多種特異性的中和抗體，所以已開發交叉反應性發現選擇方案。為簡單起見，這一方案在示出具有雙特異性抗體的選擇的圖2中說明。在這一情況下，首先就對一個靶標(例如靶標A)的反應性對包含對兩個靶標(靶標A與靶標B) 顯示反應性的抗體的抗體文庫加以選擇，接著就對另一靶標(例如靶標B)的反應性加以選擇。每一輪連續選擇都增強所得池針對這兩個靶標的反應強度(也參看2008年1月17日公開的美國申請公開No. 20080014205，其全文以引用的方式并入本文)。因此，這一方法尤其適用于鑒別具有雙特異性的抗體。當然，通過包括針對其它靶標的另外輪富集，該方法可擴展到鑒別針對其它靶標顯示反應性的抗體。又，如果篩選的文庫是噬菌體展示文庫，那么通過交叉反應性淘選進行選擇，但也可使用其它文庫和其它選擇方法。以上討論的兩種方法的組合包括分別關于針對靶標A與靶標B反應性的兩輪分開的富集，重組兩個所獲得的池，接著是如上所述的交叉反應性選擇輪(參看2008年1月17 日公開的美國申請公開No. 20080014205，其全文以引用的方式并入本文)。這一方法在圖1 中說明。正如在純交叉反應性選擇中，重組文庫的每一輪選擇增加所得池針對兩個靶標的反應強度。在另一實施例中，在圖2中說明，首先鑒別對靶標A顯示強反應性且對靶標B具有可檢測的交叉反應性的克隆。基于這一克隆，制備誘變文庫，然后在交替輪中分別就對靶標 B和靶標A的反應性加以選擇。這一方案將產生對靶標A保持強反應性且對靶標B具有增加的反應性的抗體(參看2008年1月17日公開的美國申請公開No. 20080014205，其全文以引用的方式并入本文)。正如先前，如果篩選的文庫是噬菌體展示文庫，那么通過淘選進行選擇，但根據相同策略，也可使用其它文庫、其它展示技術和其它選擇法。如上所討論，靶標A與靶標B可例如為甲型流感病毒的兩種不同亞型、相同甲型流感病毒的兩個不同菌株(分離株)、兩個不同物種的亞型或分離株，其中一個物種優選為人。因此，例如靶標A可為Him病毒的新喀里多尼亞分離株的分離株，且靶標B可為H3N2 病毒的威斯康星州分離株。要強調的是，這些實施例僅僅是說明性的，且可以類似的方式鑒另O、選擇和優化對任何兩個靶標或多個靶標具有雙特異性和多特異性的抗體。或者，如果使用允許分離離散骨架和CDR長度的抗體文庫(諸如UAL)尋找對靶標 A的抗體，可篩選抗原B且可將該文庫限制為相似參數的多樣性集合。一旦發現針對抗原B 的抗體，那么可使用基于相應A和B抗體的嵌合或誘變抗體工程化雙特異性集合。噬菌體展示
在一特定的實施方案中，本發明利用噬菌體展示抗體文庫在功能上發現具有多 (包括雙)特異性的中和單克隆抗體。所述抗體可例如為能夠中和一種以上甲型流感病毒亞型的單克隆抗體，所述亞型包括H1、H3和/或H9亞型，H5、H7和/或H9亞型，諸如Hl與 H3 ；H5 與 Hl ；H5 與 H2 ；H5 與 H3 ；H5、Hl 禾口 H2 ；H5、Hl 禾口 H3 ；H5、H2 禾口 H3 ；HI、H2 禾口 H3 等亞型，和/或同一亞型的一種以上菌株(分離株)。為產生噬菌體抗體文庫，將從任何來源獲得的cDNA文庫(包括以上討論的庫)克隆到噬粒載體中。因此，將如上所述利用RT-PCR從淋巴細胞或骨髓獲得的抗體重鏈和輕鏈譜的集合重新裝配成融合于ml3pIII蛋白質的scFv庫。組合的庫將含有約IO6以上、或IO7以上、 或IO8以上或IO9以上個不同成員，優選為IO7以上個不同成員或以上。關于質量控制，對隨機克隆進行測序以評估整個譜復雜性。類似地，最初從天然或免疫的人或高免疫的非人靈長類動物抗體文庫通過PCR獲得重鏈和輕鏈可變區之后，組合PCR產物與連接子低聚物以產生scFv文庫，以便與M13pIII 外殼蛋白直接克隆于框中。所述文庫將含有約IO6以上、或IO7以上、或IO8以上或IO9以上個不同成員，優選為IO7以上個不同成員或以上。作為質量控制步驟，對隨機克隆進行測序以評估整個譜尺寸和復雜性。抗體噬菌體展示文庫可含有各種形式的抗體，諸如呈單鏈Fv(ScFv)或Fab形式。 關于綜述，參看例如 Hoogenboom，Methods Mol. Biol. 178 :1-37(2002)。腿鑒別具有所需中和性質的抗體的篩選方法在上文已有描述。反應性可基于與所需血凝素蛋白質直接結合來評估。血凝素(HA)SaJlT^^.血凝素(HA)蛋白質可利用DNA重組技術產生。在這一方法中，將HA基因克隆到適當載體中，優選桿狀病毒表達載體以在感染桿狀病毒的昆蟲細胞中表達，諸如草地貪夜娥(Spodoptera frugiperda, Sf9)細胞。將編碼HA蛋白質的核酸插入有或無C末端附加表位(諸如poly-his (六聚組氨酸標記))的桿狀病毒表達載體中，諸如Bac-to-Bac (Invitrogen)。poly-his標記可通過鎳螯合色譜法容易地純化。克隆通常包括通過裝配PCR從個別合成的低聚物制備參考cDNA。通過將適當突變低聚物取代為另外的裝配PCR或通過誘變技術(諸如通過Kimkel誘變)，制備相應的分離株變體HA蛋白質。通過使用脂質體(可商購自Gibco-BRL)將上述Bacmid轉染于Sf9細胞(ATCC CRL 1711)中產生重組桿狀病毒。在下孵育4-5天后，采集釋放的病毒且用于進一步擴增。如0' Reilley Baculovirus Expression Vectors :A Laboratory Manual (Oxford Oxford University Press, 1994)所述進行病毒感染和蛋白質表達。然后可如下通過例如Ni2+螯合親和力色譜法純化所表達的poly-His標記的HA多肽。如Rupert等，Nature 362 :175-179(1993)所述從感染重組病毒的Sf9細胞收集上清液。用5mL床體積制備Ni2+-NTA瓊脂糖柱(可商購自Qiagen)，用25mL水洗滌，且用25mL上樣緩沖液平衡。將過濾的細胞提取物以每分鐘0.5mL裝載于柱上。用上樣緩沖液洗滌柱到基線A28tl,此時開始組分收集。接著，用二次洗滌緩沖液(50mM磷酸鹽；300mM NaCl，10%甘油，PH 6.0)洗滌柱，此洗脫非特異性結合的蛋白質。再次達到~8(|基線之后，用0至500mM 于二次洗滌緩沖液中的咪唑梯度使柱顯色。收集ImL組分并利用SDS-PAGE分析和用與堿性磷酸酶綴合的Ni2+-OTVUQiagen)進行銀染或蛋白質印跡。匯集含有洗脫的Hisltl標記的 HA多肽的組分并針對上樣緩沖液進行透析。或者，IgG標記(或Fc標記)HA多肽的純化可使用已知的色譜技術(包括例如蛋白質A或蛋白質G柱色譜)進行。作為使用Sf9細胞的替代，HA蛋白質還可在其它重組宿主細胞、原核生物、酵母或高等真核生物細胞中產生。合適的原核生物包括但不限于真菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科(EntercAacteriaceae)，諸如埃希氏菌屬Escherichia)(例如大腸桿菌、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、 變形菌屬(Proteus))；沙門菌屬(Salmonella)(例如鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium))；沙雷氏菌屬(Serratia)(例如粘質沙雷菌(Serratia marcescans))禾口志賀氏菌屬(Shigella)以及芽孢桿菌屬(Bacilli)(諸如枯草桿菌(B. subtilis)和地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis))(例如1989年4月12日于DD 266, 710中公開的地衣芽孢桿菌41P)；假單胞菌屬O^seudomonas)(諸如銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)) 和鏈霉菌屬(Str印tomyces)。多種大腸桿菌菌株可公開獲得，諸如大腸桿菌K12菌株 MM294 (ATCC 31，446)；大腸桿菌 X1776 (ATCC 31，537)；大腸桿菌菌株 W3110 (ATCC 27,325) 和 K5772(ATCC 53，635)。除原核生物以外，真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母)是含有編碼HA多肽的核酸的載體的合適的克隆或表達宿主。釀酒酵母是常用的低等真核宿主微生物。然而，通常可獲得許多其它屬、種和菌株且適用于本文中，諸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe) (Beach 和 Nurse, Nature 290 :140(1981) ； 1985 年5 月 2 日公開的 EP139, 383 ； 克魯維斯酵母(Kluyveromyces)宿主(美國專利No. 4，943，529 ；Fleer等，Bio/ Technology 9 :968-975 (1991))，諸如乳酸克魯維斯酵母(K. lactis) (MW98-8C、CBS683、 CBS4574 ;Louvencourt 等，J. Bacteriol 737 (1983))、脆壁克魯維斯酵母(K. fragilis) (ATCC 12，424)、保加利亞克魯維斯酵母(K. bulgaricus) (ATCC 16，045)、維克漢姆克魯維斯酵母(K. wickeramii) (ATCC 24，178)、克魯維斯雄酵母(K. waltii) (ATCC 56，500)、果蠅克魯維斯酵母(K. drosophilarum) (ATCC 36, 906 ；Van den Berg 等，Bio/ Technology 8 :135 (1990))、耐熱克魯維斯酵母(K. thermotolerans)和馬克斯克魯維斯酵母(K. marxianus)；耶氏酵母(yarrowia) (EP402, 226)；畢赤酵母(Pichia pastoris) (EP 183，070 ；Sreekrishna 等，J. Basic Microbiol. 28 :265-278 (1988))；假絲酵母屬 (Candida) ； (Trichoderma reesia) (EP 244, 234) ； | fjc Iil 3 M (Neurospora crassa) (Case 等，Proc.Natl Acad. Sci. USA 76 :5259-5263(1979)) ； (Schwanniomyces)(諸如 (Schwanniomyces occidentalis)) (1990 年 10 月 31 日公開的 EP 394，538)；和絲狀真菌 (諸如脈孢菌(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、彎頸霉菌(Tolypocladium)) (1991 年 1月10日公開的W091/00357)和曲霉屬(Aspergillus)宿主(諸如構巢曲霉(A. nidulans)) (Ballance 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 112 :284-289(1983) ；TiIburn 等，Gene 26 205-221 (1983) ；Yelton 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :1470-1474(1984))和黑曲霉
26(A. niger) (Kelly 和 Hynes，EMBO J. 4 :475-479 (1985))。甲醇酵母適合于本文且包括但不限于能夠于甲醇上生長的酵母，選自由漢遜酵母屬(Hansenula)、假絲酵母屬、克勒克酵母屬(Kloeckera)、畢赤酵母屬(Pichia)、植酵母屬(Saccharomyces)、球擬酵母屬 (Torulopsis)和紅酵母屬(Iihodotorula)組成的屬。示例性的這類酵母的具體物種的列表 nTBT C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs 269(1982)。用于表達HA蛋白質的適當宿主細胞包括多細胞生物體的細胞。無脊椎動物細胞的實例包括上述昆蟲細胞(諸如果蠅S2和夜蛾Sf9)以及植物細胞。適用的哺乳動物宿主細胞細胞系的實例包括中國倉鼠卵巢(CHO)和COS細胞。更具體的實例包括被SV40轉化的猴腎CVl細胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細胞系(亞克隆以在懸浮培養物中生長的 HEK 293 或 HEK 293 細胞)(Graham 等，J. Gen Virol36 :59(1977))；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR (CHO，Urlaub 和 Chasin，Proc. Natl. Acad. ki. USA 77 :4216(1980))；小鼠足細胞 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23 :243-251(1980))；人肺細胞(W138, ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2、HB 8065)；和小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCCCCL51)。適當的宿主細胞的選擇被認為在本領域的技術范圍內。血凝素(HA)蛋白質淘選將HA蛋白質固定于微量測試孔或磁性微珠的表面上以淘選上述文庫。在一特定實施方案中，使各文庫在4°C結合一種或多種H蛋白質2小時，然后用冷PBS徹底洗滌，之后用0. 2M甘氨酸-HCl緩沖液(pH2. 5)洗脫HA特異性結合克隆。回收的噬菌體是pH被中和的且通過感染易感宿主大腸桿菌而擴增。接著，可誘導噬粒制備以重復陽性克隆的富集，接著分離克隆得到篩出物。充分富集之后，通過將整個池感染到非琥珀抑制基因大腸桿菌菌株(諸如HB2151)中以表達可溶的scFv蛋白質使之轉移。或者，可將池亞克隆到單體scFv 表達載體(諸如PBAD)中，且表達重組的可溶scFv蛋白質以用于如下所述的體外分析和表征。表征如上所述測試克隆對一種或多種H蛋白質的結合親和力。舉例來說，測試對Hl蛋白質(Refseq ABQ10137，分離株新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)和 / 或 Refseq ABU99069，分離株索羅門群島/3/06 (Hmi))的結合，且并行測試對H3蛋白質的結合(Refseq ACC67032, 分離株威斯康星州/67/05和/或Refseq CAAM^9、香港/68 (H3N2))的結合，但也可僅使用其它分離株或其任何組合。可測試基于所證明的結合而獲得的陽性克隆的中和能力。關于中和的典型功能測試涉及使用與紅細胞結合的整個病毒的血細胞凝集抑制測定。 或者，利用重組血凝素蛋白質和紅細胞的血細胞凝集測定也是可能的。為消除對全血的需要，可在氣道上皮細胞上進行血凝素結合抑制測定。結合測定可以任何配置進行，包括但不限于基于任何流式細胞術或細胞ELISA (cELISA)的測定。使用cELISA的優點在于，它不使用昂貴的流式細胞術設備且可提供更自動的克隆評估和更強大的數據收集。另一方面，流式細胞術可提供更高的靈敏度、一致性和速度。在一方面，本發明抗體對含有HlHA的流感病毒和/或含有H3HA的流感病毒具有結合親和力。本發明抗體的結合親和力可利用本領域技術人員已知的方法測定，例如利用 Munson 等，Anal. Biochem.，107 :220(1980) Wkatchard 分析。在一個實施方案中，結合親和力< ΙΟΟρΜ。在其它實施方案中，抗體的結合親和力為從約1X10_7到約1X10_13M，從約1X10—8到約1X10-1或從約1X10—9到約1X10-"M。在其它實施方案中，抗體的結合親和力為約 ι χ 1(Γ7Μ、約 1 X 1(Γ8Μ、約 1 X 1(Γ9Μ、約 1 X 1(T1CIM、約 1 X 1(Γ"Μ、約 1 X IO^12M 或約 1Χ10 Μ。優化誘變文庫對于流感流行病和大流行(包括與由非人動物病毒引起的人感染相關的潛在大流行)的有效管理，需要有效中和H蛋白質的當前分離株以及未來突變的抗體。為實現這一目標，需要鑒別結合靶血凝素亞型的所有已知分離株的各種Η(例如，Η1、Η3、Η5等)中和克隆。在一些情況下，交叉反應性抗體通過針對單一抗原的定向篩選而顯現。為增加分離交叉反應性克隆的可能性，應通過針對多種抗原漸進篩選應用多種選擇壓力。在任一情況下，交叉反應性都可利用本領域已知的抗體優化方法進一步改進。舉例來說，可對本文所述的免疫球蛋白鏈的可變區的某些區進行一種或多種優化策略，包括輕鏈改組、目的性誘變、CDR合并和所選CDR和/或骨架區的定向誘變。一種設計為以有意引入具有一種以上甲型流感亞型和/或同一亞型的一種以上分離株的本文抗體的交叉反應性的誘變方法在本文中稱為“目的性”誘變。目的性誘變可用于基于一種或多種優選具有不同反應性的抗體克隆而合理地使抗體集合工程化。在本發明的情況下，目的性誘變用于編碼由類同序列(諸如抗體的個別CDR)上的類似位置界定的單個或多個殘基。在此情況下，這些集合使用低聚簡并度產生以捕獲可比較位置可見的殘基范圍。預期，在這一集合內，親本克隆之間或甚至之外，將存在特異性連續性。目的性誘變的目標在于在兩個或多個離散的實體或集合之間產生不同的多功能抗體集合或庫。在流感的情況下，可利用這一方法使用識別兩個不同表位、分離株或亞型的兩種抗體和將這兩種功能質量融于單個抗體。舉例來說，第一甲型流感抗體可對Hl亞型的分離株具有特異性且第二抗體對甲型流感病毒的Η3亞型的分離株具有特異性。為建立目標誘變文庫，首先獲得這兩個抗體的CDR序列并比對。接著用單個密碼子將保守身份的所有位置固定到匹配的殘基。在非保守位置處，合并簡并密碼子以編碼這兩個殘基。在一些情況下，簡并密碼子應僅編碼這一位置處的這兩個親本殘基。然而，在一些情況下產生另外的副產物。取決于尺寸限制或目標，可撥入副產物產生的水平以迫使副產物產生或消除這一產生。因此，舉例來說，如果兩個抗體的第一位分別是蘇氨酸和丙氨酸，那么頭兩個位置為A/G-C的簡并密碼子應僅編碼蘇氨酸或丙氨酸，而不管第三個位置的堿基如何。如果例如下一位置的殘基是賴氨酸和精氨酸，那么簡并密碼子A-A/G-A/G將僅編碼賴氨酸或精氨酸。然而，如果使用簡并密碼子MC-A/G-A/G/C/T，那么還將產生天冬酰胺、組氨酸、谷氨酰胺和絲氨酸副產物。為方便起見，更簡單地使用僅具有匹配⑶R長度的抗體。一種促使達成此的方法是基于CDR長度和起初發現的抗體賦予的可能甚至骨架限制而針對第二抗原篩選尺寸限制的文庫。然而，應注意，使用等長度的CDR僅是方便，而不是要求。顯而易知，雖然這一方法將適用于建立甲型流感病毒中和抗體的大型功能多樣的文庫，但它的適用性寬廣得多。 這一誘變技術可用于產生任何抗體的功能多樣的文庫或集合(參看2008年1月17日公開的美國申請公開No. 20080014205，且其全文以引用的方式并入本文)。因此，本文包括圖3 以說明目的性誘變方法的用途，其使用TNF- α抗體和CDlla抗體的CDR作為誘變的親本序列。因為通常不能容易地選擇交叉反應性，所以執行典型的誘變策略可能不能夠產生有效的交叉反應性。設計目的性誘變作為定向方法以產生具有交叉反應潛能的抗體范圍。 或者，CDR合并可提供建立和/或優化交叉反應性抗體的另一快速且有效的策略。已十分明確，抗原結合和特異性嚴重受選自任一鏈或兩個鏈的CDR的不同組合的影響。因為先前存在的抗體中所含的CDR可能已經針對靶標預先優化，所以可建立單一抗體或包含來自多個抗體的CDR混合物的抗體集合，如圖6中所描繪，其可證明有效針對不均一的靶。在圖6中，雖然將CDR合并抗體描繪為CDR基于單個骨架的組合疊加，但其可基于多個相關和無關骨架或甚至其嵌合骨架疊加，從而增加所得合并抗體的整體多樣性和生產力。混合庫具有平衡現有抗體中可見的生產多樣性與鑒別每合并集合的眾多新抗體的能力的益處。另外的重鏈骨架的這一拓寬的應用允許獲取使得在可衍生更高交叉反應性和效能的常規B細胞成熟中不可得到組合的CDR和骨架變體情況下的結合樣本。因為CDR充當相互作用的環而嚙合靶，所以可通過按相應原始安排或不管原始安排混合重鏈與輕鏈之間的 ⑶R建立更廣泛的組合。如果更常規的優化足以增加效能或活性范圍，那么可利用靶向隨機誘變、飽和誘變或甚至易于出錯的PCR。使用不明確合成的寡核苷酸的靶向隨機誘變(Matteuchi和Heyneker，Nucleic Acids Research 11 :3113-3121 (1983))是以特定比率相對彼此在指定位置處產生預期密碼子以及所有可能的密碼子的技術。不明確合成的寡核苷酸通過在指定位置特定添加非 “野生型”堿基或通過特定添加密碼子導致核苷酸添加的準確性降低。此通常通過在寡核苷酸合成儀中固定野生型與非野生型堿基的比率且在合成時指定兩種試劑的混合來進行。飽和誘變(Hayashi等，Biotechniques 17 :310-315(1994))是所有 20 種氨基酸在蛋白質的特定位置取代的技術，且測定對應于各變體的克隆的特定表型。(還參看美國專利 No. 6，171，820、No. 6，358，709 和 No. 6，361，974。)易于出錯的PCR(Leung 等，Technique 1 :11-15(1989) ；Cadwe 11 和 Joyce, PCR Method Applic. 2 :28-33(1992))是在克隆的基因中引入隨機點突變的修改的聚合酶鏈反應(PCR)技術。可克隆所得PCR產物以產生隨機突變體文庫，或如果在適當PCR引物內并入T7啟動子，那么直接轉錄。也熟知其它誘變技術且描述于例如In Vitro MutaRenesis Protocols, J. Braman Ili^, Humana Press，2001。優化誘變文庫篩選的選擇考慮因素在此情況下，主要目標之一是使抗體工程化和從集合中分離抗體以有效處理當前 Hl和/或H3(或H5或H9)分離株以及未來突變。為使具有能夠識別新分離株H1/H3中的突變的耐性的抗體工程化，需要鑒別結合多種H1/H3分離株的中和克隆。預期，如果在第一 H1/H3分離株上選擇克隆，那么它應以較小的程度結合/中和第二 H1/H3分離株。在此情況下，目標在于在改進(或至少維持)第一 H1/H3分離株結合的范圍內，顯著改進對第二 Hl/ H3分離株的識別。因此，首先選擇第二 H1/H3參考蛋白質的改進，接著選擇第一 H1/H3蛋白質。如此可有關新菌株提供更高的選擇壓力，同時維持第二參數的壓力。其它H中和抗體可以類似方式優化。在此情況下，可使用來自其它分離株(例如，H5、H9等)的任何參考蛋白質序列且當前用作起點或終點來選擇和優化。另外，用中和抗體克隆測試中間類型(intertype)識別。中間類型識別的實例是結合非Hl來源或優化的克隆的相符或工程HI。總之，多個誘變集合和篩選可基于C5和All抗體、C5樣和All樣抗體、C5和All 樣分子、C5和C5樣替代抗體和All和All樣替代抗體。借此，可對各上述分子進行任何和全部上述選擇以分離具有寬范圍反應性和高效力的適當反應性的分子。中和抗體的表位定位一旦已鑒別出具有所需性質的中和抗體，即可希望鑒別由大多數所述抗體識別的顯性表位。表位定位的方法在本領域中眾所周知且公開于例如Morris，Glenn Ε.， Epitope MappinR Protocols,Totowa, N. J.編，Humana Press,1996 禾口 Epitope MappinR A Practical Approach, Westwood 禾口 Hay 編，Oxford University Press, 2001。表位定位涉及抗體結合的表位的鑒別。存在許多本領域技術人員已知測定蛋白質上表位位置的方法，包括抗體-抗原復合物的結晶學分析、競爭測定、基因片段表達測定和基于合成月太的測定(參看例如 Harlow 禾口 Lane，Using Antibodies,a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1999 的第 11 章；美國專利No. 7，332，579，各文獻的全文以引用的方式并入本文)。當兩種抗體識別相同或空間上重疊的表位時，抗體結合與參考抗體“本質上相同的表位”。確定兩種抗體是否結合相同或空間上重疊的表位的常用方法是競爭測定，所述測定可使用標記的抗原或標記的抗體以所有不同格式配置。通常，抗原固定于96孔板上，且使用放射性或酶標記測量未標記抗體阻斷標記抗體的結合的能力。中和抗體的制備一旦鑒別出具有所需中和性質的抗體，即可利用本領域中熟知的方法(包括例如雜交瘤技術或DNA重組技術)制備所述抗體，包括抗體片段。在雜交瘤方法中，使小鼠或其它適當的宿主動物(諸如倉鼠)免疫以得到產生或能夠產生將特異性結合用于免疫的蛋白質的抗體的淋巴細胞。或者，可在體外使淋巴細胞免疫。然后，使用合適的融合劑(諸如聚乙二醇)使淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以形成
(Goding, Monoclonal Antibodies principles and Practice, H 59-103 M (Academic Press,1986))。接種所制備的雜交瘤細胞，并使之在優選含有一種或多種抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的物質的合適的培養基中生長。舉例來說，如果親本骨髓瘤細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤轉磷酸核糖基酶(HGPRT或HPRT)，那么用于雜交瘤的培養基通常應包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培養基)，所述物質阻止缺乏HGPRT的細胞生長。優選的骨髓瘤細胞是那些有效融合，支持通過所選擇的抗體產生細胞的穩定高水平抗體產生，且對培養基(諸如HAT培養基)敏感的骨髓瘤細胞。在這些細胞系中， 優選的骨髓瘤細胞細胞系是鼠類骨髓瘤細胞系，諸如源自可以從Mlk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA 獲得的 M0PC-21 和 MPC-11 小鼠腫瘤的細胞系和可以從 American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA 獲得的SP-2或X63-Ag8-653細胞。也已描述人骨髓瘤和小鼠人雜骨髓瘤細胞系用于產生人單克隆抗體(Kozbor，J. Immunol. 133 :3001(1984)；和 Brodeur 等，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,第51-63頁(Marcel Dekker,Inc. ,New York, 1987))。測定融合瘤細胞生長所在的培養基的針對抗原的單克隆抗體的產生。優選地，由免疫沉淀法或體外結合測定(諸如放射免疫測定(RIA)或酶聯免疫吸附測定(ELISA))測定雜交瘤細胞產生的單克隆抗體的結合特異性。可例如通過分離編碼所需抗體鏈的DNA和利用熟知的重組表達載體使用用于共表達的編碼序列共轉染重組宿主細胞來產生重組單克隆抗體。重組宿主細胞可為原核和真核細胞，諸如上述細胞。用于制備人源化抗體的人可變域輕鏈與重鏈的選擇對降低抗原性來說是非常重要的。根據所謂的“最佳擬合”方法，針對已知的人可變域序列的整個文庫篩選嚙齒動物抗體的可變域的序列。然后接受與嚙齒動物的序列最接近的人序列作為人源化抗體的人骨架區(FR) (Sims 等，J. Immunol. 151 :2296 (1993) ；Chothia 等，J. Mol. Biol. 196 :901 (1987))。 重要的是，抗體保留對抗原的高親和力和其它有利的生物性質而被人源化。為實現這一目標，根據優選的方法，利用親本序列和人源化序列的三維模型通過親本序列和各種概念上人源化的產物的分析方法制備人源化抗體。另外，可根據本領域已知的方法產生人抗體。舉例來說，可產生在無內源性免疫球蛋白產生的情況下在免疫之后能夠產生人抗體的全譜的轉基因動物(例如，小鼠)。 參看例如 Jakobovits 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :2551(1993) Jakobovits 等， Nature 362:255-258(1993) ；Bruggermann 等，Year in Immuno. 7 :33(1993)；和美國專利 No. 5，591，669、No. 5，589，369 和 No. 5，545，807。中和抗體已通過使用本文所述的技術已鑒別許多中和抗體，包括下文實施例中描述的技術。在一方面，本發明提供結合血凝素蛋白質表位的中和抗體。在一個實施方案中，中和抗體結合血凝素蛋白質HAl亞單位上的至少一個表位。在另一實施方案中，中和抗體結合血凝素蛋白質HAl亞單位上的至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或至少六個表位。在一些實施方案中，本發明抗體中和含有H3和/或Hl的病毒。在其它實施方案中，抗體中和H3與HI。在一個實施方案中，本發明的抗體防止血細胞凝集。在其它實施方案中，抗體阻止甲型流感病毒結合欲感染的靶細胞。在另一實施方案中，抗血凝素抗體阻止甲型流感病毒的HA的球狀頭部區上的受體結合位點附著于靶細胞，從而具有HA的血凝素活性。基于下文實施例中所述的實驗，鑒別了許多抗血凝素抗體重鏈/輕鏈配對。在另一實施方案中，本發明抗體可與兩種或兩種以上甲型流感病毒亞型交叉反應。在一個實施方案中，抗體含有包含如SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的重鏈多肽和包含如SEQ ID NO 3,SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6所示氨基酸序列的輕鏈多肽。 在一個優選實施方案中，本發明的中和抗體結合與針對如下的表位基本上相同的表位(i) 包含如SEQ ID NO :2所示的重鏈氨基酸序列和如SEQ ID NO :6所示的輕鏈氨基酸序列的抗體(下文實施例中的克隆1286-A11且如表1中所示)；(ii)包含如SEQ ID NO 1所示的重鏈氨基酸序列和如SEQ ID NO :3所示的輕鏈氨基酸序列的抗體(下文實施例中的克隆 U86-C5且如表1中所示)；(iii)包含如SEQ ID NO 1所示的重鏈氨基酸序列和如SEQ IDNO 4所示的輕鏈氨基酸序列的抗體(下文實施例中的克隆U86-C5且如表1中所示)；或 (iv)包括如SEQ ID NO 1所示的重鏈氨基酸序列和如SEQ ID NO 5所示的輕鏈氨基酸序列的抗體(下文實施例中的克隆U86-C5且如表1中所示)。表 權利要求
1.一種結合分子，其包含一個、兩個或三個選自由SEQ ID NO 7, SEQ ID NO :8和SEQ ID NO 9組成的組的來自重鏈的高變區序列，或其功能活性片段。
2.一種結合分子，其包含一個、兩個或三個選自由SEQ ID NO 10,SEQ ID N0:11和SEQ ID NO 12組成的組的來自重鏈的高變區序列，或其功能活性片段。
3.根據權利要求1所述的結合分子，其包含來自SEQID N0:7、SEQ ID NO :8或SEQ ID NO 9的所有高變區序列，或其功能活性片段。
4.根據權利要求2所述的結合分子，其包含來自SEQID NO 10,SEQ ID N0:11或SEQ ID NO 12的所有高變區序列，或其功能活性片段。
5.根據權利要求1所述的結合分子，當與輕鏈締合時其能夠結合靶標。
6.根據權利要求2所述的結合分子，當與輕鏈締合時其能夠結合靶標。
7.根據權利要求5所述的結合分子，其中所述輕鏈包含多肽序列的一個、兩個或三個高變序列SEQ ID NO 13, SEQ ID N0:14或SEQ ID NO :15，或其功能活性片段。
8.根據權利要求5所述的結合分子，其中所述輕鏈包含多肽序列的一個、兩個或三個高變序列SEQ ID NO 16, SEQ ID N0:17或SEQ ID NO 18，或其功能活性片段。
9.根據權利要求5所述的結合分子，其中所述輕鏈包含多肽序列的一個、兩個或三個高變序列 SEQ ID NO :19、SEQ ID NO 20 或 SEQ ID NO :21。
10.根據權利要求6所述的結合分子，其中所述輕鏈包含多肽序列的一個、兩個或三個高變序列SEQ ID NO :22、SEQ ID NO 23或SEQ ID NO :24，或其功能活性片段。
11.根據權利要求7所述的結合分子，其包含所有高變區序列SEQID NO 13, SEQ ID NO 14或SEQ ID NO 15，或其功能活性片段。
12.根據權利要求7所述的結合分子，其包含所有高變區序列SEQID NO 16, SEQ ID NO 17或SEQ ID NO 18，或其功能活性片段。
13.根據權利要求7所述的結合分子，其包含所有高變區序列SEQID NO 19, SEQ ID NO 20或SEQ ID NO :21，或其功能活性片段。
14.根據權利要求8所述的結合分子，其包含所有高變區序列SEQID NO 22, SEQ ID NO 23或SEQ ID NO :24，或其功能活性片段。
15.根據權利要求1或2所述的結合分子，其還包含含有VpreB序列和/或λ5序列的多肽，或其功能活性片段。
16.根據權利要求1或2所述的結合分子，其還包含含有與λ5序列融合的VpreB序列的多肽，或其功能活性片段。
17.根據權利要求1或2所述的結合分子，其還包含含有Vκ樣和/或JCk序列的κ 樣替代輕鏈(SLC)構建體，或其功能活性片段。
18.根據權利要求1或2所述的結合分子，其是抗體或其功能活性片段。
19.一種結合分子，其包含重鏈，所述重鏈包含如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，或其功能活性片段。
20.一種結合分子，其包含重鏈，所述重鏈包含如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，或其功能活性片段。
21.根據權利要求19所述的結合分子，其還包含輕鏈，所述輕鏈包含選自由SEQID NO :3、SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5組成的組的氨基酸序列，或其功能活性片段。
22.根據權利要求20所述的結合分子，其還包含輕鏈，所述輕鏈包含如SEQID NO :6所示的氨基酸序列，或其功能活性片段。
23.根據權利要求19所述的結合分子，或其功能活性片段，其(i)中和甲型流感病毒的一種以上亞型和/或一種以上分離株，(ii)結合所述病毒的血凝素(HA)抗原，和(iii)抑制血細胞凝集。
24.根據權利要求20所述的結合分子，或其功能活性片段，其(i)中和甲型流感病毒的至少一種亞型和/或至少一種分離株，和(ii)結合所述病毒的血凝素(HA)抗原。
25.根據權利要求19或20所述的結合分子，或其功能活性片段，其結合HA抗原的Hl 亞型的表位。
26.根據權利要求19或20所述的結合分子，或其功能活性片段，其結合HA抗原的H3 亞型的表位。
27.根據權利要求19或20所述的結合分子，或其功能活性片段，其結合HA抗原的Hl 亞型的表位和HA抗原的H3亞型的表位。
28.根據權利要求19或20所述的結合分子，或其功能活性片段，其結合HA抗原的H9 亞型的表位。
29.根據權利要求20所述的結合分子，或其功能活性片段，其結合HA抗原的H5亞型的表位。
30.根據權利要求25-29中任一項所述的結合分子，或其功能活性片段，其中所述表位呈現于甲型流感病毒的表面上。
31.根據權利要求19或20所述的結合分子，或其功能活性片段，其可與HlHA抗原和 H3抗原交叉反應。
32.根據權利要求19所述的結合分子，或其功能活性片段，其中和Hl和H3甲型流感病毒亞型中的至少一者。
33.根據權利要求19所述的結合分子，或其功能活性片段，其中和Hl和H3甲型流感病毒亞型。
34.根據權利要求20所述的結合分子，其中和所述HlHA抗原，或其功能活性片段。
35.根據權利要求20所述的結合分子，其中和所述H5HA抗原，或其功能活性片段。
36.根據權利要求20所述的結合分子，其中和所述Hl和H5甲型流感病毒亞型，或其功能活性片段。
37.根據權利要求25所述的結合分子，其中所述Hl亞型是，或所述HA來自Hl病毒的新喀里多尼亞/20/99分離株，或其功能活性片段。
38.根據權利要求25所述的結合分子，其中所述Hl亞型是，或所述HA來自Hl病毒的索羅門群島/3/06分離株，或其功能活性片段。
39.根據權利要求沈所述的結合分子，其中所述H3亞型是，或所述HA來自H3病毒的威斯康星州/67/05分離株，或其功能活性片段。
40.根據權利要求沈所述的結合分子，其中所述H3亞型是，或所述HA來自H3病毒的香港/68分離株，或其功能活性片段。
41.根據權利要求觀所述的結合分子，其中所述H9亞型是，或所述HA來自H9病毒的香港/1073/99分離株，或其功能活性片段。
42.根據權利要求四所述的結合分子，其中所述H5亞型是，或所述HA來自H5病毒的越南/1203/04分離株，或其功能活性片段。
43.根據權利要求23所述的結合分子，其阻止所述甲型流感病毒的所述球狀頭部區結合細胞的表面，或其功能活性片段。
44.根據權利要求23所述的結合分子，其阻止所述甲型流感病毒附著于欲感染的細胞，或其功能活性片段。
45.根據權利要求23或M所述的結合分子，其中至少一種所述病毒具有感染人的能力，或其功能活性片段。
46.根據權利要求23或對所述的結合分子，其中至少一種所述分離株已從人受試者獲得，或其功能活性片段。
47.根據權利要求23或對所述的結合分子，其中至少一種所述分離株已從非人動物獲得，或其功能活性片段。
48.根據權利要求47所述的結合分子，其中所述非人動物是禽類，或其功能活性片段。
49.根據權利要求48所述的結合分子，其中所述禽類是野禽或雞，其功能活性片段。
50.根據權利要求47所述的結合分子，其中所述非人動物是豬，或其功能活性片段。
51.根據權利要求19所述的結合分子，其結合HlHA抗原，或其功能活性片段。
52.根據權利要求51所述的結合分子，其結合至少一種另外的HA抗原，或其功能活性片段。
53.根據權利要求52所述的結合分子，其中所述另外的HA抗原是H3，或其功能活性片段。
54.一種抗體，其結合與對于包含重鏈多肽的抗體的表位實質上相同的表位，所述重鏈多肽包含如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；或基于所述氨基酸序列的共有或變體序列。
55.根據權利要求M所述的抗體，其結合與對于包含輕鏈多肽的抗體的表位實質上相同的表位，所述輕鏈多肽包含選自由SEQ ID NO 3,SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5組成的組的氨基酸序列；或基于所述氨基酸序列的共有或變體序列。
56.一種抗體，其結合與對于包含重鏈多肽的抗體的表位實質上相同的表位，所述重鏈多肽包含如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列；或基于所述氨基酸序列的共有或變體序列。
57.根據權利要求56所述的抗體，其結合與對于包含輕鏈多肽的抗體的表位實質上相同的表位，所述輕鏈多肽包含如SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列；或基于所述氨基酸序列的共有或變體序列。
58.根據權利要求M或55所述的抗體，其(i)中和甲型流感病毒的一種以上亞型和/ 或一種以上分離株，(ii)結合所述病毒的血凝素(HA)抗原，和(iii)抑制血細胞凝集。
59.根據權利要求56或57所述的抗體，其(i)中和甲型流感病毒的一種以上亞型和/ 或一種以上分離株，和(ii)結合所述病毒的血凝素(HA)抗原。
60.一種組合物，其包含根據權利要求1-59中任一項所述的結合分子或抗體。
61.一種用于預防和/或治療受試者的甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括對所述受試者施用有效量的根據權利要求60所述的組合物。
62.一種治療受試者的甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括對所述受試者施用有效量的根據權利要求1-59中任一項所述的中和抗體或結合分子。
63.根據權利要求61或62所述的方法，其中所述受試者是人患者。
64.一種有效針對甲型流感病毒的疫苗，其包含在功能上模擬由根據權利要求1-59中任一項所述的抗體或結合分子所結合的中和表位的肽或多肽。
65.根據權利要求64所述的疫苗，其是合成疫苗。
66.根據權利要求64所述的疫苗，其包含減毒的甲型流感病毒或其一部分。
67.根據權利要求64所述的疫苗，其包含滅活的甲型流感病毒或其一部分。
68.根據權利要求64所述的疫苗，其中所述抗體或結合分子選自由以下組成的組(a)結合與對于包含重鏈多肽的抗體的表位實質上相同的表位的抗體或結合分子，所述重鏈多肽包含如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；或基于所述氨基酸序列的共有或變體序列；(b)包含含有重鏈多肽的重鏈多肽的抗體，所述重鏈多肽包含如SEQID N0:1所示的氨基酸序列；或基于所述氨基酸序列的共有或變體序列；(c)結合與對于包含重鏈多肽的抗體的表位實質上相同的表位的抗體或結合分子，所述重鏈多肽包含如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；或基于所述氨基酸序列的共有或變體序列，或其片段；和(d)包含重鏈多肽的抗體，所述重鏈多肽包含如SEQID NO :2所示的氨基酸序列；或基于所述氨基酸序列的共有或變體序列，或其片段。
69.根據權利要求64所述的疫苗，其中所述抗體或結合分子結合HA抗原。
70.根據權利要求69所述的疫苗，其中所述HA抗原是H3亞型。
71.根據權利要求69所述的疫苗，其中所述HA抗原是Hl亞型。
72.根據權利要求69所述的疫苗，其中所述HA抗原是Hl亞型和H3亞型。
73.根據權利要求69所述的疫苗，其中所述HA抗原是H5亞型。
74.根據權利要求69所述的疫苗，其中所述HA抗原是H9亞型。
75.根據權利要求69所述的疫苗，其中所述抗原呈現于甲型流感病毒的表面上。
76.根據權利要求64至75中任一項所述的疫苗，其中所述肽或多肽包含募集中和抗體的抗原決定簇。
77.根據權利要求64所述的疫苗，其適于口服施用。
78.根據權利要求64所述的疫苗，其適于經粘膜遞送。
79.根據權利要求78所述的疫苗，其中所述經粘膜遞送是鼻內施用。
80.根據權利要求64所述的疫苗，其適于腸胃外施用。
81.根據權利要求64所述的疫苗，其適于經皮施用。
82.根據權利要求64所述的疫苗，其中所述疫苗用于兒童期免疫。
83.—種中和抗體或結合分子，其結合能夠感染人的甲型流感病毒的血凝素，中和甲型流感病毒的至少一種分離株，包含長度經修飾的重鏈環。
84.根據權利要求83所述的抗體或結合分子，其中所述延長的重鏈環是CDR3環。
85.根據權利要求84所述的抗體或結合分子，其中所述CDR3環包含氨基酸序列SEQID NO :9。
86.根據權利要求85所述的抗體或結合分子，其中所述延長的重鏈環是CDRl環。
87.根據權利要求86所述的抗體或結合分子，其中所述CDRl環包含氨基酸序列SEQIDNO :7。
88.根據權利要求83所述的抗體或結合分子，其中所述長度修飾包括延長的重鏈環。
89.根據權利要求83所述的抗體或結合分子，其中所述長度修飾包括所述重鏈環中的缺失。
90.一種具有降低的氧化電位的工程抗體或結合分子，其結合能夠感染人的甲型流感病毒的血凝素，中和甲型流感病毒的至少一種分離株，在重鏈可變域中包含一個或多個蛋氨酸取代。
91.根據權利要求90所述的工程抗體或結合分子，其中所述重鏈可變域是CDR3區。
92.根據權利要求90所述的工程抗體或結合分子，其中所述蛋氨酸取代根據Kabat編號系統位于位置96處。
93.根據權利要求90所述的工程抗體或結合分子，其中所述蛋氨酸取代根據Kabat編號系統位于位置98處。
94.根據權利要求90所述的工程抗體或結合分子，其中所述蛋氨酸取代根據Kabat編號系統位于位置96和98處。
95.根據權利要求90至94中任一項所述的工程抗體或結合分子，其中所述蛋氨酸被亮氨酸取代。
96.根據權利要求90所述的工程抗體或結合分子，其中所述重鏈可變域包含氨基酸序列 SEQ ID NO :29ο
全文摘要
本發明涉及鑒別、制備和工程化針對甲型流感病毒的中和抗體的方法和手段以及所制備的中和抗體。具體來說，本發明涉及針對各種甲型流感病毒亞型的中和抗體，和制備所述抗體的方法和手段。
文檔編號C07K16/10GK102482345SQ201080030975
公開日2012年5月30日 申請日期2010年5月12日 優先權日2009年5月13日
發明者A.卡什亞普, L.霍羅維茨, R.巴特 申請人:航道生物技術有限責任公司