控制抗體的o-聯糖基化的方法

專利名稱：控制抗體的o-聯糖基化的方法
技術領域：
本發明涉及用于控制在真菌中重組產生的多肽的0-聯糖基化的方法。具體而言本發明涉及產生具有低糖基化程度的抗體。
背景技術：
重組蛋白現今廣泛用于許多領域，包括商業酶和工業酶、診斷、分析、下游純化、配制、作為疫苗和作為治療劑。傳統上，并且在重組DNA技術出現之前，已經從哺乳動物來源獲得了哺乳動物蛋白。然而，隨著源自哺乳動物來源的蛋白質而來的是不可避免地受到潛在有害的或偶然的 (adventitious)病毒、朊病毒或其他有害物質的感染或污染的風險。已經證實這些方法既昂貴又在許多情況下不可重復。因此，已經使用哺乳動物細胞培養技術作為哺乳動物蛋白的來源，但是培養哺乳動物細胞是昂貴的，在技術上是困難的，并且產率常常差強人意。出于這些以及其他的原因，如簡單的規模放大和快速的生長速率，微生物表達系統在生物藥物和生物治療蛋白包括抗體、抗體片段和抗體融合物等商業相關蛋白的產生方面具有成為可行的替代方式的潛力。抗體和抗體片段的產生在Joosten等，Microbial Cell Factories (2003)，2，1-15和 Gasser 和 Mattanovich,Biotechnol. Lett. (2007)29，201-212 中討論。然而，0-聯糖基化現象作為用于潛在的藥物制備和治療劑的重組蛋白的翻譯后修飾，與產品的異質性(heterogeneity)、穩定性、免疫原性作用(抗原性和免疫抑制性)、結構、功能、活性、分泌、治療效力、淋巴增生作用(lymphoprolific effect)和聚集等有關并對其具有影響。已知在真菌表達的蛋白質中的0-聯糖鏈的結構將其自身以不同于哺乳動物表達系統中所見的呈現。類似地，通常不會被0-聯糖基化的異源蛋白當在真菌中表達時可能會0-聯糖基化。因此，對于產生藥品級蛋白質，例如，治療性單克隆抗體(mAb)，減少在真菌中產生的哺乳動物蛋白的糖基化的量會是理想的。通常已知蛋白質糖基化在原核生物和真核生物二者中均廣泛存在。已將這種修飾與細胞壁完整性、細胞分化、毒力、分泌和發育相聯系。糖基殘基可以借由天冬酰胺(N-糖基化)或借由羥基化氨基酸(主要為絲氨酸和蘇氨酸，而更罕見為酪氨酸、羥脯氨酸和羥賴氨酸)(0-糖基化)與蛋白質連接。多種單糖能夠0-聯于蛋白質，包括半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和甘露糖(Man)。然后可以將這些由通過甘露酰轉移酶或其他特定的糖轉移酶介導的、經由0-糖苷鍵附接的另外的糖來進一步延伸。(參考文獻Lussier，M.等(1999) Biochim. Biophys. Actal426，323-334)。因此，對于提供用于減少真菌中產生的哺乳動物蛋白如抗體的甘露糖型糖基化的方法存在很大的興趣。

發明內容
本發明涉及用于制備包含抗體序列或其片段的多肽的方法，所述多肽具有低 0-聯糖基化程度，所述方法包括以下步驟a.提供編碼包含抗體序列或其片段的多肽的核酸序列；b.修飾所述核酸序列從而將選自S、T和Y并且受到0-聯糖基化的至少一個氨基酸殘基取代或缺失；c.將所述經修飾的核酸序列導入合適的宿主細胞，從而使所述經修飾的核酸序列能夠在所述宿主細胞中進行表達；d.使所述宿主細胞在導致由所述經修飾的核酸序列編碼的多肽表達的條件下生長；和e.回收所述多肽。本發明還涉及可根據本發明的方法獲得的多肽。還公開了包含根據本發明的方法制備的多肽的組合物。附圖簡述

圖1顯示pDB3017的質粒圖。圖2顯示來自表達抗FITC ScFv rHA融合物的DXYl的胰蛋白酶消化物的703. 63+ 離子的 LC-MSMS 譜(180LLIYGNNNRPSGVPDR195)。圖3顯示pDB2777的質粒圖。圖4顯示pAYE587的質粒圖。圖5顯示pDB2779的質粒圖。圖6顯示pDB3070的質粒圖。圖7顯示pDB3088的質粒圖。圖8顯示pDB3979的質粒圖。圖9為來自表達抗FITC scFv S190A突變體rHA融合物的DYP4的胰蛋白酶消化物的 632. 343+ 離子(qEVQLLESGGGLVQPGGSLI 19)的 LC-MS 譜。在 BEMAdl 處理和后續的 LCMSMS 分析之前，將胰蛋白酶解肽(tryptic peptides)進行ConA富集。對含有0_聯甘露糖基化的單一位點的肽的BEMAd 1 —次處理會導致IDa(632.343+)的質量偏移。上述譜確認了從所述肽損失了 IDa。圖10為來自表達抗FITC scFv S190A突變體rHA融合物的DYP4的胰蛋白酶消化物的 632. 343+ 離子(qEVQLLESGGGLVQPGGSLR19)的 LC-MSMS 譜。在 BEMAdl 處理和后續的 LCMSMS分析之前，將胰蛋白酶解肽進行ConA富集。所有主要離子對應于預期的s7脫氫肽的b和y型離子。存在脫氫修飾的B離子10、11和12是存在脫氫絲氨酸且在位置7的診斷劑，并因此是BEMAdl處理前0-聯甘露糖模塊的診斷劑(and therefore pre-BEMAdl treatment an o-linked mannose moiety) 石角認 S7 作為 0_ 聯甘!基化白勺位。圖11為來自表達抗FITC scFv S190A突變體rHA融合物的DYP4的胰蛋白酶消化物的772. 382+離子(2Q1SGTSASLAISGLI 213)的LC-MSMS譜。在LCMSMS分析之前將胰蛋白酶解肽進行ConA富集。譜中所見的大多數離子對應于未糖基化的種類(其中不穩定的甘露糖已經脫落)。然而，仍存在甘露糖的y8、y9和ylO的存在確認了至少一個甘露糖存在于絲氨酸206或絲氨酸210，仍存在于y7、y6、y5或y5的任何甘露糖的缺失，無論不存在甘露糖的碎片離子的高豐度，也高度指明絲氨酸206的0-聯甘露糖的存在。發明詳述如此，術語“抗體”或“抗體分子”如用于本文意在包括完整抗體(例如免疫球蛋白G (IgG)、免疫球蛋白A (IgA)、免疫球蛋白E (IgE)、免疫球蛋白M(IgM)或免疫球蛋白 D(IgD)), (mAbs)，多克隆抗體，和嵌合抗體。免疫球蛋白(Ig)的類別可以基于重鏈恒定區中氨基酸序列中的小差異進一步分成亞類。亞類中的Ig可以具有相似的重鏈恒定區氨基酸序列，其中通過血清學手段檢測差異。例如，IgG亞類包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，其中重鏈由于氨基酸的差異歸類為Yl重鏈、Y 2重鏈等。所述輕鏈也可以是κ或λ型。在另一實例中，所述IgA亞類包括IgAl和IgA2，其中重鏈由于氨基酸的差異歸類為α 1重鏈或 α 2重鏈。在此語境中的抗體還意圖包括缺乏輕鏈的那些，如駱駝、美洲駝(llama)和駝科 (camelidae family)的其他成員，并且有時稱為重鏈抗體(HcAb)。類似地，免疫球蛋白同種型新穎(或新的)抗原受體(IgNAR’s)，天然存在于海洋軟骨動物中，例如須鯊(wobbegong shark)和鉸口鯊(nurse shark)，以及軟骨魚綱(Chondrichthyes class)(軟骨魚類)的其他成員。還包括包含抗原結合域的抗體片段。術語“抗體片段”如用于本文意圖包括展現抗原結合功能的任何合適的抗體片段。幾種這樣的抗體片段已經在本領域中記載并被稱為Fab、F(ab' )2、Fab3、scFv、Fv、 dsFv、ds-scFv、Fd、dAbs、TandAbs、Flexibodies 二聚體、微型抗體(minibody)、雙功能抗體 (diabody)、三功能抗體(tribody)、四功能抗體(tetrabody)、vH域、vL域、VhH域、納米抗體(Nanobody)、IgNAR單可變域(v_NAR域)、其片段、及其多聚體(multimer)和雙特異性抗體片段。抗體可以使用常規技術片段化。例如，F(ab' ) 2片段可以通過用胃蛋白酶處理抗體來生成。所得的F(ab' ) 2片段可經處理以還原二硫鍵來產生Fab片段。木瓜蛋白酶消化能夠導致 Fab 片段的形成。Fab、Fab'和 F(ab' ) 2、scFv、Fv、dsFv、FcU dAbs、TandAbs、 ds-scFv、二聚體、微型抗體、雙功能抗體、雙特異性抗體片段和其他片段也可以通過重組技術合成或者能夠化學合成。用于產生抗體片段的技術是公知的并在本領域中有所描述。所述抗體、抗體片段或抗體融合物根據本發明在合適的宿主細胞中重組產生。所述抗體、抗體片段或抗體融合物可以以其最終形式重組產生，或者可以以能夠通過一個或多個后續步驟轉化成最終期望的抗體、抗體片段或抗體融合物的形式產生。例如，根據本發明的抗體片段可以作為完整抗體在合適的宿主細胞中重組產生，然后使用常規技術例如用蛋白酶切割來轉化成期望的抗體片段。優選地，所述抗體、抗體片段或抗體融合物包含抗體輕鏈可變區(vL)和/或抗體重鏈可變區(vH)，其通常包含抗原結合位點。在某些實施方案中，所述抗體、抗體片段或抗體融合物包含全部或部分的重鏈恒定區，如IgGI、lgG2、lgG3、lgG4、IgAI、lgA2、IgE、IgM或 IgD恒定區。優選地，所述重鏈恒定區是IgGI重鏈恒定區。此外，所述抗體、抗體片段或抗體融合物能夠包含全部或部分的κ輕鏈恒定區或λ輕鏈恒定區。優選地，所述輕鏈恒定區是λ輕鏈恒定區。這些恒定區的全部或部分可以天然產生或者可以是完全或部分合成的。用于這些恒定區的合適序列是公知的并且記載于本領域中。術語“片段”如用于本文指具有生物關聯性的片段，例如能夠促成抗原結合(例如與部分或全部的抗原結合位點的結合)或使其成為可能的片段，或者能夠促成對抗原功能的抑制或減少的片段或者能夠促成預防抗原與其天然配體相互作用的片段。優選的片段因此包含本發明的抗體的重鏈可變區(vH域)和/或輕鏈可變域(vL域)。其他優選的片段包含本發明的抗體的(或本發明的vH域的)互補決定區(CDR)中的一個或多個，或本發明的抗體的(或本發明的vL域的)輕鏈CDR中的一個或多個。當用于核酸分子的語境中時， 術語“片段”包括編碼如本文描述的片段的核酸分子。術語“抗體序列”意圖意指包含CDR和框架區序列二者的抗體的多肽序列。短語“免疫球蛋白單可變域”指不依賴于其他ν區或域而特異性結合抗原或表位的抗體可變區(vH，vhH, VL)；然而，作為本文使用的術語，免疫球蛋白單可變域可以以具有其他可變區或可變域的形式存在(例如，同多聚體或異多聚體)，其中所述其他區或域并非通過所述單免疫球蛋白可變域進行的抗原結合所必需(即，其中所述免疫球蛋白單可變域不依賴所述另外的可變域結合抗原)。“免疫球蛋白單可變域”不僅包括分離的抗體單可變域多肽，還包括更大的包含抗體單可變域多肽序列的一種或多種單體的多肽。“域抗體”或 “dAb”與作為術語用于本文的“免疫球蛋白單可變域”多肽相同。免疫球蛋白單可變域多肽， 如用于本文是指哺乳動物免疫球蛋白單可變域多肽，優選人，但還包括嚙齒動物(例如，如 WO 00/29004中公開的，將其內容通過提述以其整體并入本文)，駝類(camelid)VHH dAb或海洋軟骨動物衍生的免疫球蛋白樣分子，例如如W0/2009/026638和W02005/1186^中公開的，將其內容通過提述以其整體并入本文。駝類dAb是源自包括駱駝、美洲駝(llama)、羊駝 (alpaca)、單峰駝(dromedary)和原駝(guanaco)的物種的免疫球蛋白單可變域多肽，并且包含天然不含輕鏈的重鏈抗體vhH-vhH分子比IgG分子小約10倍。術語“結構域/域”在本發明中就免疫球蛋白而言是獨立于蛋白質的其余部分保持其三級結構的折疊蛋白質結構。通常，域負責蛋白質的不同功能特性，并且在許多情況下可以添加、去除或轉移至其他蛋白質而不喪失所述蛋白質和/或所述域的剩余部分的功能。“單抗體可變域”是包含抗體可變域的特征序列的折疊多肽域。因此其包括完整的抗體可變域和修飾的可變域，例如，其中一個或多個環由抗體可變域的非特征序列替代，或者經過截短或包含N-或C-端延伸的抗體可變域，以及至少部分保留全長域的結合活性或特異性的可變域的折疊片段。術語“免疫球蛋白”指保留抗體分子特征性免疫球蛋白折疊的多肽家族，其含有兩個[β]片層，通常還含有保守的二硫鍵。免疫球蛋白超家族的成員在體內涉及細胞和非細胞相互作用的許多方面，包括在免疫系統中廣布的作用(例如，抗體、T細胞受體分子等)， 參與細胞粘附(例如ICAM分子)和胞內信號傳導(例如，受體分子，如PDGF受體)。本發明可應用于所有免疫球蛋白超家族分子。優選地，本發明涉及抗體。“通用框架”或“框架”是對應于由Kabat定義在序列上保守的抗體區域的單抗體框架序列。Kabat系統/方案(公知并且得到廣泛使用的指南)用于鑒定本發明的框
架區禾口 CDR-參見 Sequences of Proteins of Immunological Interest, E. Kabat 等，
U. S. Department of Health and Human Services, (1987)和(1"1)。鑒定 Kabat 框架序列是公知的，并且因此是常規方案；參見例如，美國專利號5，840，299 ；美國專利申請公開號20050261480。Kabat等為各個亞類的抗體列出了許多氨基酸序列，并且為在該亞類中的各個殘基位置列出了最常出現的氨基酸。Kabat等使用為所列序列中各個氨基酸指派殘基號的方法，并且這種用于指派殘基號的方法已經成為本領域中的標準。通過將所討論的抗體、抗體片段或抗體融合物與Kabat等中的共有序列之一比對，Kabat等的方案可以擴展到不包括在目錄中的其他抗體、抗體片段和抗體融合物。Kabat等的編號系統的使用可容易地鑒定不同抗體、抗體片段和抗體融合物中在等同位置處的氨基酸。例如，在人抗體的L50位置處的氨基酸占據與小鼠抗體的氨基酸位置L50的等同位置。在另一實例中，來自駝類的vHH域的氨基酸殘基(參考文獻=Riechmarm和 Muyldermans (2000) ,J. Immunol. Meth. 240 185-195)可以根據由 Kabat 等提供的 vH 域的一般編號方式編號。根據這種編號方式，納米抗體的FRl包含位置1-30處的氨基酸殘基，納米抗體的⑶Rl包含位置31-35處的氨基酸殘基，納米抗體的FR2包含位置36-49處的氨基酸殘基，納米抗體的⑶R2包含位置50-65處的氨基酸殘基，納米抗體的FR3包含位置66-94 處的氨基酸殘基，納米抗體的⑶R3包含位置95-102處的氨基酸殘基，并且納米抗體的FR4 包含位置103-113處的氨基酸殘基。在這一方面和其他方面，應該注意在本領域公知對于 vH域以及對于vHH域，各個CDR中的氨基酸殘基總數可能不同并且可能與由Kabat編號方式指明的氨基酸殘基的總數不符。即，根據Kabat編號方式的一個或多個位置在實際序列中可能未被占據，或者實際序列可能含有比Kabat編號方式所允許的數目更多的氨基酸殘基。這意味著，通常，根據Kabat的編號方式可能符合或可能不符合實際序列中氨基酸殘基的實際編號方式。然而，通常，可以認為根據Kabat的編號方式并且不論CDR中的氨基酸殘基數，根據Kabat編號方式的位置1對應于FRl的起點并且反之亦然，根據Kabat編號方式的位置36對應于FR2的起點并且反之亦然，根據Kabat編號方式的位置66對應于FR3的起點并且反之亦然，而根據Kabat編號方式的位置103對應于FR4的起點并且反之亦然。這一概念在W02009004066中進一步描述。天然抗體是響應于暴露于變應原或抗原而由生物在體內產生并且能夠分泌到血漿中的多肽，所述多肽具有特異性結合所述抗原的能力。天然抗體包括但不限于Ig，如 IgM, IgD, IgG, IAg 和 IgE。人工抗體是其中CDR與天然不與其連接的框架序列一起存在的抗體。人工抗體包含保持特異性結合抗原的能力的天然抗體的修飾、片段、變體、突變體、同源物和類似物或修飾、片段、變體、突變體、同源物和類似物的組合。人工抗體包括但不限于本領域稱為Fab片段、F(ab) 2片段和scFv片段的片段和變體。全部具有帶有Ig或 Ig樣折疊的域，其由具有希臘鑰匙拓撲結構(Greek-key topolgy)的兩個片層中七條或更多條鏈的β夾心組成。抗體的融合物根據本發明意圖意指包含一種或多種抗體、或抗體片段序列以及一種或多種不衍生自抗體的序列的多肽，所述融合物能夠結合抗原。通常所述一種或多種不衍生自抗體的序列衍生自血漿蛋白如白蛋白、轉鐵蛋白(US2008/0220002)、乳鐵蛋白或黑素轉鐵蛋白。所述不衍生自抗體的序列優選包含至少10個氨基酸、至少20個氨基酸、30個氨基酸，更優選至少50個氨基酸，甚至更優選至少75個氨基酸并且更優選至少100個氨基酸。所述抗體融合物可以是N-端融合物或C-端或N-和C-端融合物，將其理解為其中抗體序列在N-端、在C-端或在N-和C-端融合于非抗體序列的融合物。所述抗體序列也可以在內部插入所述非抗體序列中，如插入在已知包含所述非抗體序列的位于分子表面處的環或結構中。所述融合物可在所述抗體和非抗體序列之間進一步包含接頭序列。這一概念在WO 01/79442中進一步描述。在一個優選的實施方案中，抗體融合物的一個或多個抗體序列是抗體片段，如Fab 片段、F(ab)2片段和scFv片段。在另一優選的實施方案中，所述一個或多個非衍生自抗體的序列是白蛋白或其片段。在一個特別優選的實施方案中，所述抗體融合物包含scFv序列和人血清白蛋白或其片段。根據本發明優選的框架序列是與來自哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔、綿羊、牛、羊、 馬、鳥類、靈長類、人；IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的框架序列中的任一具有至少60%同一性， 優選至少70%同一性，更優選至少80%同一性，更優選至少85%同一性，更優選至少90% 同一性，甚至更優選至少95%同一性，最優選至少97%同一性的序列；或其任何連續25個氨基酸的序列片段。框架序列的實例包括源自IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗體的框架序列及其任何片段，其源自哺乳動物特別是源自小鼠、大鼠、兔、豚鼠和靈長類，特別是靈長類如人(Homo sapiens) 0類似地，源自Ig超家族的框架序列存在于駝科成員中，例如美洲駝，和軟骨魚綱成員中，例如鯊。就本發明而言，兩個氨基酸序列之間的同一性程度使用EMBOSS程序包(EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000, Trends in Genetics 16 :276-277 :http://emboss, org)(優選 3. 0. 0 或更新的版本)的 Needle 程序中執行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48 :443-453)來測定。使用的可選參數為缺口開啟罰分為10，缺口延伸罰分為0. 5，和EBL0SUM62 (BL0SUM62 的EMBOSS版本)取代矩陣。標記為“最長同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)用作百分比同一性并且如下計算(相同殘基數XlOO)/(比對的長度-比對中的缺口總數)就本發明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度使用EMBOSS程序 包(EMBOSS :The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等， 2000，見上;http://emboss. org)(優選3. 0. 0或更新的版本)的Needle程序中執行的 Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，見上)來測定。使用的可選參數為缺口開啟罰分為10，缺口延伸罰分為0. 5，和EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本)取代矩陣。標記為“最長同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)用作百分比同一性并且如下計算(相同的脫氧核糖核苷酸數XlOO)/(比對的長度-比對中的缺口總數)。如本文所用的術語“抗原”以通常方式理解為由根據本發明的結合域結合的分子。 通常，抗原通過抗體(和其中的片段)配體結合。如本領域中所使用的，術語“⑶R”指抗體可變序列中的互補決定區。重鏈和輕鏈的各個可變區中均存在三個⑶R，對于各個可變區稱為⑶R1、⑶R2和⑶R3。由于⑶R代表可變性升高的區域(相對于相似序列的區域)，這些CDR的精確邊界根據不同的系統可以有不同的定義。廣泛使用的系統由Kabat描述(Kabat等)。Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987)禾口 (1991))提供了可應用于抗體的任何可變區的殘基編號系統，并且提供了限定三個CDR的殘基邊界。這些 CDR 可以稱作 “Kabat CDR”。Chothia 等(Nature (1989) 342 :877-883 ； Chothia 和 Lesk, (1987)/. MoI. Biol. 196 :901-917)發現 Kabat CDR 內的某些亞部分采用幾乎相同的肽主鏈構象，盡管在氨基酸序列水平上具有很大的多樣性。這些亞部分命名為 L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”指明輕鏈和重鏈區。這些區稱作Chothia CDR, 其具有與Kabat⑶R重疊的邊界。術語“框架”、“框架區”或“框架序列”指可變區減去⑶R 的剩余序列。由于CDR序列的精確定義可以由不同的系統決定，框架序列的含義相應地也得到不同的解釋。在一個實施方案中，六個⑶R(輕鏈的⑶Rl、2和3以及重鏈的⑶Rl、2和 3)在框架區內的定位有效地將各條鏈的框架區分成四個稱為FR1、FR2、FR3和FR4的亞區。 CDRl位于FRl和FR2之間，CDR2在FR2和FR3之間；而CDR3在FR3和FR4之間。在沒有將特定亞區指定為FR1、FR2、FR3或FR4時，框架區如另外提及，代表單一、天然存在的免疫球蛋白鏈中可變區內的合并的FR1、FR2、FR3或FR4亞區。在一個可選的實施方案中，本發明的框架區(FR)包含或其組成為(代表)整個框架序列的任意部分，包括由四個亞區之一組成的序列。在一個可選的實施方案中，本發明的框架區(FR)包含或其組成為衍生自Kabat 框架區(KF)域的氨基酸，其中所述氨基酸序列源自種系免疫球蛋白序列。在本申請中，Kabat編號系統將用于抗體序列內氨基酸序列的鑒定，其根據 Martin, Α. C. R. Accessing the Kabat Antibody Sequence by Computer. PROTEINS Structure, Function and Genetics，25 (1996)，130-133 中公開的方法進行。在抗體中，鑒定了包含⑶R序列并且牽涉在抗原結合的幾種環。Kabat編號方式為
⑶R指派以下編號
環編號
LlL24-L34
L2L50-L56
L3L89-L97
HlH31-H35B
H2H50-H65
H3 H95-H102根據本發明，將至少一個受到0-聯糖基化的氨基酸殘基用不允許0-聯糖基化的殘基取代，或缺失。將0-聯糖基化定義為糖基團，通常為甘露糖殘基對多肽序列中的氨基酸的附接， 其中所述糖基團通過氨基酸側鏈的0原子附接。例如，這種糖基化類型見于酵母和絲狀真菌。0-聯糖基化發生于氨基酸殘基S、T或Y之一，然而，并非真菌宿主細胞中產生的多肽中的所有S、T或Y殘基均會是糖基化的，而可靠預測是給定多肽序列中的哪些S、T或Y殘基尚不可能。受到糖基化的殘基可以使用本領域已知的不同技術來鑒定。在一種方法中，將多肽用產生具有適當地小尺寸的肽的內肽酶消化。將含有附接的糖模塊的肽從消化物回收， 例如，使用附接有對糖模塊具有親和力的配體的基質，如刀豆蛋白Akocanavalin A ；Con A)，并測序回收的肽以供鑒定附接了糖基團的氨基酸。技術人員知曉的用于鑒定傾向于
90-聯糖基化的殘基的其他技術也可以應用于本發明。一旦鑒定了受到0-聯糖基化的合適殘基，根據本發明將其缺失或取代成不受 0-聯糖基化的氨基酸，即取代成任何選自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、0、R、V或W的氨基酸。優選將S、T或Y殘基取代成具有類似大小的不同殘基，并且還優選不將所述氨基酸取代成荷電的殘基。如此，優選將S或T用A、C、G或V取代，而Y優選取代成F、I、L、M、 N、Q 或 W。受到0-聯糖基化的一個或多個氨基酸殘基的缺失或取代使用熟知的用于修飾核酸序列的技術，例如定點誘變方便地進行。多種用于修飾核酸的技術是本領域已知的并且本領域技術人員會知曉如何將這些技術應用于本發明。受到0-聯糖基化的一個或多個氨基酸殘基理論上可以位于抗體中的任何位置。 優選所述受到0-聯糖基化的一個或多個氨基酸殘基位于抗體的框架區。可提及的合適的受到0-聯糖基化的氨基酸殘基的實例(所述殘基根據本發明可以合適地取代或缺失)是使用Kabat編號體系具有編號L56的殘基。所述具有編號L56的殘基在一個CDR內，意味著此特定殘基位于抗體的高度可變區中。因此，會存在在位置L56 具有不同于S、T或Y的氨基酸殘基的抗體。技術人員會理解該實施方案僅適用于在位置 L56中具有S、T或Y殘基的抗體。合適的受到0-聯糖基化的氨基酸殘基的其他優選實例分別是SEQ ID NO :12中的絲氨酸7和絲氨酸206，抗MUCl scFv ((參考文獻British J. of Cancer (1997) 76 (5) 614-621)中的絲氨酸7和絲氨酸206，抗體2，4_D scFv (參考文獻 Vet. Med. -Czech, 48, 2003 (9) :237-247)中的絲氨酸 7 和絲氨酸 191，和抗 IL-1R1 dAb (參考文獻專利WO 2007/063311)中的蘇氨酸72，以及在其他抗體中在對應于抗MUCl scFv ((參考文獻=British J. of Cancer (1997) 76 (5) 614-621)中的位置 7 或 206，抗 2，4_D scFv (ref :Vet. Med. -Czech, 48, 2003 (9) :237-247)中的位置 7 或 191 的位置中的絲氨酸， 和在對應于抗IL-IRl dAb (參考文件專利W0 2007/063311)中的位置72的位置中的蘇氨酸。特別優選的受到0-聯糖基化的氨基酸殘基(所述殘基根據本發明可以合適地取代或缺失)包括根據Kabat編號體系在位置L56，或在對應于SEQ ID NO 12中的位置7、 72、191或206的位置的氨基酸殘基。與抗體有關的核酸構建體根據本發明意圖理解為編碼抗體、抗體片段或抗體融合物的核酸序列與編碼所述抗體的序列的轉錄和翻譯所必需的調控序列在功能上關聯。表述“與編碼所述抗體的序列的轉錄和翻譯所必需的調控序列在功能上關聯”意圖指將編碼所述抗體、抗體片段或抗體融合物的序列相對于調控序列如啟動子、核糖體結合位點、終止子、多腺苷酸化位點、增強子序列調節位點等以合適的框、距離和取向放置。關于用于在宿主細胞中表達多肽的核酸構建體的教導在現有技術中有很多，并且技術人員會理解如何將這些教導應用于本發明。將與在所選宿主中轉錄和翻譯所必需的調控序列在功能上關聯的編碼抗體、抗體片段或抗體融合物的核酸構建體導入所選的真菌宿主細胞。存在數種用于將核酸導入宿主細胞中的技術，并且技術人員會理解本發明不限于任何特定的這樣的技術，而是原則上可以使用任何這樣的技術，只要該技術能夠將所述核酸導入所述宿主細胞。這樣的技術的實
10例可以包括改良的醋酸鋰法(Sigma酵母轉化試劑盒，YEAST-I，實驗方案2 ；Ito等，(1983) J.Bacteriol. ,153,16 ；Elble, (1992)Biotechniques,13,18)。表述“能夠在宿主細胞中指導抗體、抗體片段或抗體融合物的表達”意圖指為所述編碼抗體、抗體片段或抗體融合物的序列提供在所選宿主細胞中表達所述抗體所必需的必要啟動子、終止子、核糖體結合位點、增強子、聚腺苷酸化序列。為特定宿主細胞選擇合適的調節序列在普通從業者的技能之內。當已經提供了編碼根據本發明的經修飾的抗體、抗體片段或抗體融合物的核酸序列，將其插入本領域已知的合適的表達構建體中。這樣的表達構建體會包含與所述編碼經修飾的抗體、抗體片段或抗體融合物的序列在操作上關聯的調節序列。關于核酸序列在真菌宿主細胞中的表達的教導可在現有技術中獲得，并且技術人員會知曉如何將這些教導應用于本發明。一旦制備了所述構建體，就將其插入合適的真菌宿主細胞。根據本發明，所述真菌宿主細胞可以是能夠表達本發明的抗體、抗體片段或抗體融合物的任何真菌細胞。所述真菌細胞可以是絲狀真菌或酵母。絲狀真菌的實例可以提及曲霉屬菌種(Aspergillus sp.)，如構巢曲霉(A. nidulans)、黑曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A. Awamori)禾口米曲霉(A. oryzae)；木霉屬菌種(Trichoderma sp·)，如里氏木霉(T. reeseii)、長枝木霉(T. Longibrachiatum)和綠色木霉(T. virdee)；青霉屬菌種 (Penicillum sp.)如點青霉(P. notatum)禾口產黃青霉(P. chrysogenum)；梭鏈孢屬菌種 (Fusidium sp.)、鐮孢屬菌禾中(Fusarium sp.)、裂裙菌屬菌禾中(Scizophyllum sp.)、毛霉屬菌種(Mucor sp)和根霉屬菌種(lihizopus sp.)。優選的絲狀真菌宿主細胞包括黑曲霉、米曲霉、構巢曲霉和里氏木霉。酵母宿主細胞的實例可以提及酵母屬菌種(Saccharomyces sp.)如釀酒酵母 (S. cerevisiae)禾口葡萄汁酵母(S. ovarum)、接合酵母屬菌禾中(Zygosaccharomyces sp.)、 裂殖酵母屬菌種(Schizosaccharomyces sp.)如粟酒裂殖酵母(S. pombe)、克魯維酵母屬菌種(Klyveromyces sp.)如乳酸克魯維酵母(K. Iactis)、假絲酵母屬菌種(Candida sp.)如白色假絲酵母(C. albicans)、畢赤酵母屬菌種(Pichia sp)如巴斯德畢赤酵母 (P.pastoris.)和漢遜酵母屬菌種(Hansenula sp.)。優選的酵母宿主細胞包括釀酒酵母、 乳酸克魯維酵母和巴斯德畢赤酵母。所述宿主細胞可以是野生型菌株，意味著它們具有如能夠分離自自然界的遺傳構成，或者它們可以是經遺傳修飾的菌株。優選地，所述宿主菌株經過遺傳修飾經改變以使它們更適合于產生異源蛋白。這類修飾的實例包括減少由宿主菌株表達的蛋白酶的量，增加宿主細胞產生異源蛋白能力(如增加折疊酶(foldase)、伴侶蛋白(chaperone)等)的修飾。本領域中關于在真菌細胞中產生異源蛋白的教導也可以應用于本發明。特別優選的真菌宿主細胞是酵母釀酒酵母(S. cerevisiae)。公開在以 W02009/019314公開的國際專利申請(將其通過提述以其整體納入)中的關于酵母宿主的教導也適用于本發明。當已經提供了包含能夠指導抗體、抗體片段或抗體融合物在所選宿主細胞中表達的核酸構建體的宿主細胞時，將所述宿主細胞在允許所述抗體、抗體片段或抗體融合物表達的條件下培養。應該選擇生長條件以向所述宿主細胞提供充足的營養物以供生長和產生期望的抗體、抗體片段或抗體融合物，并且在指導抗體轉錄的啟動子是誘導型的情況下，即所述啟動子的活性依賴于特定化合物或物理條件的存在或缺乏，則生長條件應該適合于誘導所述抗體、抗體片段或抗體融合物的表達。根據所選宿主細胞和核酸構建體選擇合適的生長條件屬于平均水平從業者的技術。將包含核酸構建體的宿主細胞培養特定的時間直至所述抗體、抗體片段或抗體融合物已經以令人滿意的量產生，然后將所述抗體、抗體片段或抗體融合物使用公知的純化技術回收。為特定的表達蛋白選擇合適的純化方法屬于平均水平從業者的技術。除非另行定義，本文使用的全部技術和科學術語具有與本領域(例如，在細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、發酵、蛋白質生物化學和生物信息學中)一名普通技術人員所通常理解的相同的含義。
實施例實施例1. FITC-rHA融合物的制備構建scFv白蛋白融合物表達質粒FITC (Lantto&Ohlin，2002，J. Biol. Chem. 277 :45108-45114)是已經在巴斯德畢赤酵母和大腸桿菌中得到表達的scFv分子，其特異性結合于異硫氰酸熒光素。其衍生自通過在vHvL框架中改組人⑶R序列構建的合成scFv文庫。將經密碼子優化的編碼這種蛋白質的DNA序列與GeneArt GmbH聯合設計。如US 2006/0M1027中描述的質粒pDB2540用于定點誘變以在重組人白蛋白 (rHA)DNA序列的3，區導入有利的克隆位點Bsu36I。還實現了破壞額外的HindIII位點的額外突變，所述位點通常存在于TAATAA終止密碼子之后。與Mratagene Quickchange 定點誘變試劑盒一起使用的誘變引物是LES21和LES22 ；LES215' -gttggtcgctgcttcccaagctgccttaggtttgtaataagcttaattcttatg-3' (SEQ ID NO 1)LES225' -cataagaattaagcttattacaaacctaaggcagcttgggaagcagcgaccaac-3' (SEQ ID NO 2)這產生了質粒pDB2836。然后用限制性內切核酸酶^CbaI和Bsu36I消化所述質粒 PDB2836并且釋放了 0. 467kb連同來自pDB2575 (如之前在US 2006/0241027中所述)的 Bsu36I/NdeI 1. 437kb片段，然后將二者連接至已經用限制性內切核酸酶)(bal和NdeI類似地消化的載體質粒pDB2541 (如之前在US 2006/0241027中所述)中，以產生3. 353kb載體。該連接產生了質粒PDB2839。將質粒pDB^39用限制性內切核酸酶SphI和NdeI消化以產生5. 6711Λ載體，向該5. 6711Λ載體中連接已經也用限制性內切核酸酶SphI和NdeI自 pDB2M0(如上所述)消化的0. 8671Λ插入物。該連接產生了質粒pDB2843。將寡聚接頭Fwd rHA單.FLAG 和Rev rHA單FLAG 退火并連接至已經用限制性內切核酸酶HindIII部分地(在位置300 和Bsu36I消化的6. 179kb pDB2843載體。該連接產生了質粒pDB2975。Fwd rHA 單FLAG 5，-TTAGGCTTAGATTATAAAGATGATGACGATAAATAATA-3，(SEQ ID NO :3)
Rev rHA 單FLAG 5，-AGCTTATTATTTATCGTCATCATCTTTATAATCTAAGCC-3，(SEQ ID NO 4)使用重疊的寡核苷酸引物來創建合成DNA，其編碼可操作地連接于針對在釀酒酵母中的表達進行了密碼子優化的FITC(vHvL)的轉化酶前導序列的3’，所述FITC(vHvL)再可操作地連接于所述rHA的5’。SEQ ID No. 5是基于如下的DNA序列轉化酶前導序列的3，，其可操作地連接于針對在釀酒酵母中的表達進行了密碼子優化的FITC(vHvL)，所述FITC(vHvL)再可操作地連接于所述rHA的5’。所述序列的側翼為BglII和ClaI限制性內切核酸酶位點以促進克隆。 SEQ ID No. 5包含BglII限制性內切核酸酶克隆位點于所述3’轉化酶前導(信號)蛋白編碼序列(核苷酸1-11)；針對在釀酒酵母中的表達進行了密碼子優化的FITC(vHvL)蛋白編碼序列(核苷酸12-743) ；5’ rHA蛋白編碼序列直到ClaI限制性內切核酸酶克隆位點(核酸酶 744-770)。將編碼轉化酶前導序列的3’與針對在釀酒酵母中的表達進行了密碼子優化的 FITC(vHvL)可操作地連接、后者再可操作地連接于所述rHA的5’的合成DNA用限制性內切核酸酶BalII和ClaI消化以產生0. 796kb片段；將pDB^75用限制性內切核酸酶ClaI 和SphI消化以產生1. 950kb片段；將pDB^23用限制性內切核酸酶BglII和SphI消化以產生4. 2141Λ載體；在三向連接(three way ligation)中使用全部三種以產生亞克隆質粒 PDB3006。如下創建載體pDB2923 ；將pDB2M3(如之前在WO 00/44772中所述)用限制性內切核酸酶Bsu36I和NdeI消化以產生1. 0881Λ片段，將pDB2836 (如之前所述)用限制性內切核酸酶Bsu36I和^CbaI消化以產生0. 467kb片段，將這二者連接至已經限制性內切核酸酶NdeI和^CbaI消化的載體pDB2541 (如之前所述)中以產生3. 353kb載體。該三向連接產生了質粒PDB2840。將該質粒pDB^40用限制性內切核酸酶SphI和NdeI消化以產生 5. 3 載體，向該載體中連接來自pDB2M0(如之前所述)的0. 8851Λ Sphl/Ndel插入物。 該連接產生了質粒PDB2844。將寡聚接頭CF138和CF139退火并連接至已經用限制性內切核酸酶HindIII部分消化并且用小牛堿性磷酸酶處理的6. 193kbpDB2844載體。該連接產生了上文所用的質粒pDB^23。CF1385 ’ -AGCTTAACCTAATTCTAACAAGCAAAGATGCTTTTGCAAGCCTTCCTTTTCCTTTTGGCTGGTTTT GCAGCCAAGATCTCTGCAGAAGACA-3’ (SEQ ID NO 6)CF1395 ’ -AGCTTGTCTTCTGCAGAGATCTTGGCTGCAAAACCAGCCAAAAGGAAAAGGAAGGCTTGCAAAAGC ATCTTTGCTTGTTAGAATTAGGTTA-3，(SEQ ID NO 7)將所述亞克隆質粒PDB3006用限制性NotI消化，并且將3. 732表達盒連接至已經用限制性內切核酸酶NotI并且使用小牛腸磷酸酶消化的PSAC35中以產生16. 303kb質粒 pDB3017(圖1)，其具有與LEU2基因的取向相同的FITC(vHvL)-rHA表達盒。使用的宿主菌株為DXY1，公開于 S. M. Kerry-Williams 等(1998Keastl4 161-169。將DXYl用所述FITC(vHvL)-rHA表達質粒pDB3017轉化成亮氨酸原養型。使用經改良的醋酸鋰法(Sigma酵母轉化試劑盒，YEAST-I，方案2 ； Ito等，(1983), J. Bacteriol.， 153，16 ；Elble, (1992), Biotechniuques, 13，18)轉化酵母。在 BMMD 瓊脂板上選擇轉化體，然后再貼片到BMMD瓊脂板上。BMMD的組成由Sleep等，(2002)，Yeast, 18，403描述。從 IOmL BMMD搖瓶培養物Q4小時，30°C，200rpm)在20% (w/v)海藻糖中制備冷凍保存的原種。實施例2.糖定位(Glycomapping)將微型管(BioquoteLimited，York，UK)設置為在 50mM Tris-HCl (Sigma-Aldrich Company Ltd, Dorsett, UK) ■ 7中 ^ pH8. 0+2mM EDTA(Sigma-Aldrich Company Ltd, Dorsett, UK)中含有 80 μ L 6M 超級鹽酸胍(Guanidine HCl Ultragrade) (Sigma-Aldrich Company Ltd,Dorsett,UK)，并將 20 μ L 的FITC_rHA(實施例 1)樣品( 30mg/mL)添加至該管。然后通過向每個管添加 5 μ LlOOmM DTT 99% (Sigma-Aldrich Company Ltd,Dorsett, UK)(約5mM，實際為4. 76mM終濃度)將樣品還原，將樣品混合并置于溫箱于37°C在黑暗中保持174小時。然后通過向每個管添加10 μ L的IOOmM超級碘乙酰胺(iodoacetamide Ultragrade) (Sigma-Aldrich Company Ltd, Dorsett, UK)(約 10mM，實際為 8. 69mM終濃度) 將樣品烷基化以封閉游離半胱氨酸。然后將所述烷基化混合物混合并于37°C在黑暗中溫育 174小時。在還原和燒基化之后，將100 μ L的50mM Tris-HCl (Sigma-Aldrich Company Ltd, Dorsett, UK)緩沖液pH8. 0和400 μ L的實驗室級水添加至所述反應混合物以確保消化物中的胍的終濃度為1Μ。用于消化的經改良的測序級胰蛋白酶(ftOmega，Southampton, UK)按照生產商的指導制備成lmg/mL。簡言之，將22 μ L提供的重懸緩沖液添加至需要的各20 μ g的胰蛋白酶小瓶。在重懸之后，將胰蛋白酶溶液匯集，然后消化。將10 μ L所述胰蛋白酶溶液添加至每個樣品管，然后將消化混合物混合并脈沖離心(pulse centrifuge) 0然后將所述反應混合物置于37°C的振蕩溫箱中M小時。消化完成之后將樣品冷凍。胰蛋白酶解糖肽的ConA提取在重力下將3mL 的 ConA-kpharose 漿(GE Healthcare, Bucks, UK)(通過顛倒混合)填充至2mL聚苯乙烯層析柱(Pierce，Loughborough, UK)以產生約1. 5mL柱床體積。將該柱用8倍或更多倍柱床體積的平衡緩沖液IOOmM NaAcUOOmM NaClUmM MgCl2, ImM MnCl2>ImM CaCl2 pH5. 5(All Fisher Scientific Analytical Grade, Loughborough, UK)洗滌。將胰蛋白酶消化物用5mL的平衡緩沖液稀釋并且使其通過該柱3次。然后將該柱用10倍或更多倍柱床體積的平衡緩沖液洗滌。保留的ConA結合肽用& 4mL洗脫緩沖液 IOOmM NaAcUOOmM NaCl、0. 5M 甲基-α-D-吡喃甘露糖苷，pH 5. 5 (All Fisher Scientific Analytical Grade，Loughborough，UK)洗脫。然后將洗脫液通過固相提取(SPE)提純(clean up)。簡言之，每個樣品使用一個SPE柱，其含有25mg/mL 1000A Styrene-Divinylbenzene (苯乙烯-二乙烯基苯；SDVB)樹脂(Biotage，Hertford，UK)。將每個柱用 70% (ν/ν)乙腈、0. 1% (ν/ν)三氟乙酸 TFA(Riedel-deHa6n, Loughborough，UK) 潤濕。然后將柱用 ο. 1% (v/v) TFA(Riedel--deHaen, Loughborough,UK)平衡。然后將 8mL 的ConA洗脫液加樣至所述柱并使其以不超過lmL/min緩慢通過。一旦所有樣品均通過了所述柱，就將它們用0. 1% (ν/ν)甲酸(Riedel-deHaSn, Loughborough，UK)洗滌。然后將結合的肽用 0. 5mL 70% (ν/ν)乙腈、0.1% (ν/ν)甲酸(Riedel-deHa6n, Loughborough,UK)洗脫并收集在低結合微型管中。在SPE之后，將提純樣品干燥并在質譜分析之前儲存在-20°c。nanoHPLC msms 分析將糖肽通過nanoESI-HPLC-MS/MS鑒定。將所述干燥的消化混合物重懸在40 μ L
0.1% (ν/ν)甲酸 98-100% (Merck Chemicals limited, Nottingham, UK)中，并使用帶有 Famos 自動采樣儀(Dionex UK Ltd)的 UltiMate nanoHPLC 系統以 300nL/min 的流速將 5 μ L 的所述肽混合物在 75 μ M C18 10θΑ P印Map 柱(Dionex UK Ltd, Camberley, UK)上分離。使用從5% (v/v)B至60% (v/v)B的60分鐘梯度。(緩沖液A 0. 1% (ν/ν)甲酸， 緩沖液 B 0. 1% (ν/ν)甲酸和 70% (ν/ν)乙腈(Rathburn Chemicals, ffalkerburn, UK.) 在QSTAR XL 質譜儀上(AppliedBiosytems，Warrington, UK)使用 Analyst QS
1.1軟件包在數據依賴性獲取模式中以對帶有兩個電荷和三個電荷的離子的自動先驅離子 (precursor ion)選擇來獲取ESI-MS/MS數據。在質量范圍470_1800m/z獲取MS調查掃描，并且在質量范圍100-1600m/z獲取MSMS譜。在任意時間可以對于ms/ms選擇三種先驅離子的最大值。對于離子在被排除之前可以在60秒被選擇兩次。將獲取的質譜通過Analyst QS 1. 1軟件包使用提供的Mascot腳本處理。然后 Mascot 一般質量列表提交至內部MASCOT (Matrix Science, London, UK)服務器進行MS/MS 離子數據庫檢索。將數據針對含有幾種Novozyme表達的蛋白的用戶創建數據庫進行檢索。 使用的主要檢索參數為±1.2Da肽離子質量允差和0. 6Da碎片離子質量允差；質量為單同位素的；通過胰蛋白酶進行蛋白水解；兩處遺漏的切割是容許的；檢索半胱氨酸的氨甲酰甲基化作為固定修飾；且可變修飾為肽的N端從Gln變成pyroGlu ；Met的氧化；蛋白質N 端的乙酰化；和絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的甘露糖基化，每個位點容許1-4個甘露糖。對匹配所述抗FITC白蛋白融合蛋白并且含有至少一個甘露糖修飾的任何肽進行手動驗證以確認肽和甘露糖基化位點二者均正確。結果所述糖位點定位實驗產生了許多來自所述抗FITC scFv白蛋白融合物的甘露糖基化的肽。甘露糖基化的一個位點(S190)已經詳細至(down to)氨基酸位置得到了確認。在LCMSMS分析之前將胰蛋白酶解肽ConA富集。在譜中所見的大多數離子對應于未甘露糖基化的類別(其中不穩定的甘露糖已經脫落)。然而，仍然存在甘露糖的yll和 yl2的存在確認了至少一個甘露糖存在于絲氨酸190。該譜示于圖2。實施例3.發酵在10L Sartorius Biostat C發酵罐中在30°C進行分批發酵；監測并通過視需要添加氨或硫酸來調節PH。氨還向培養物提供了氮源。監測溶解氧水平并與攪拌器速度關聯， 以將水平保持在>20%的飽和度。將接種物在搖瓶中在緩沖的基本培養基中培養。對于分批階段(batch-phase)，將培養物接種至含有2% (w/v)蔗糖的發酵罐培養基(發酵罐體積的約50%)中。補料階段通過溶解氧水平的急速升高自動觸發。通過將補料速率控制在設定的額定生長速率來將蔗糖保持在生長限制濃度。所述補料由含有50% (w/v)蔗糖的發酵培養基組成，基本上全部如 Collins所述。(Collins，S. H.，(1990) Production of secreted proteins in yeast, in :T. J. R. Harris (編)Protein production by biotechnology, Elsevier, London,pp.61-77)。
全部發酵成功完成，并且為良好或完全的(perfect)發酵(表1)。表1.抗 FITC (vHvD-rHA-g^gg發酵
權利要求
1.一種用于制備包含抗體序列的多肽的方法，所述多肽具有低0-聯糖基化程度，包括以下步驟a.提供編碼包含抗體序列的多肽的核酸序列；b.修飾所述核酸序列從而取代或缺失選自S、T和Y并且受到0-聯糖基化的至少一個氨基酸殘基；c.將所述修飾的核酸序列導入合適的宿主細胞從而使所述修飾的核酸序列能夠在所述宿主細胞中得到表達；d.將所述宿主細胞在導致由所述修飾的核酸序列編碼的多肽表達的條件下培養，并且e.回收所述多肽。
2.權利要求1的方法，其中所述抗體序列包含框架序列。
3.權利要求1或2的方法，其中所述多肽選自抗體、其片段或變體、或包含抗體、其片段或變體的融合蛋白。
4.根據權利要求1-3中任一項的方法，其中所述受到0-聯糖基化的至少一個氨基酸殘基選自根據Kabat編號具有以下位置的氨基酸L56和對應于SEQ ID NO 12中位置7、72、 191或206的位置的氨基酸。
5.權利要求4的方法，其中將根據Kabat編號編為L56的氨基酸用選自G、A、V的另一氨基酸取代。
6.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述宿主細胞是真菌宿主細胞。
7.權利要求6的方法，其中所述宿主細胞選自曲霉屬菌種(Aspergillussp.)，如構巢曲霉(A. nidulans)、黑曲霉(A. niger)、泡盛曲霉(A. awamori)和米曲霉(A. oryzae)；木霉屬菌禾中(Trichoderma sp·)，如里氏木霉(T. reeseii)、長枝木霉(T. Longibrachiatum) 和綠色木霉(T. virdee)；青霉屬菌種(Penicillum sp.)如特異青霉(P. notatum)和產黃青霉(P. chrysogenum)；梭鏈孢屬菌種(Fusidium sp.)、鐮孢屬菌種(Fusarium sp.)、裂褶菌屬菌種Gcizophyllum sp.)、毛霉屬菌種(Mucor sp)、根霉屬菌種(Rhizopus sp.)、酵母屬菌種(Saccharomyces sp.)如釀酒酵母(S. cerevisiae)和葡萄汁酵母(S. ovarum)、 接合酵母屬菌禾中(Zygosaccharomyces sp.)、裂殖酵母屬菌禾中(Schizosaccharomyces sp.) 如粟酒裂殖酵母(S.pombe)、克魯維酵母屬菌種(Klyveromyces sp.)如乳酸克魯維酵母 (K. Iactis)、假絲酵母屬菌種(Candida sp.)如白色假絲酵母(C. albicans)、畢赤酵母屬菌種(Pichia sp.)和漢遜酵母屬菌種(Hansenula sp)。
8.權利要求7的方法，其中所述宿主細胞選自釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、構巢曲霉、黑曲霉、米曲霉和里氏木霉。
9.能夠根據權利要求1的方法獲得的多肽。
10.一種包含根據權利要求1-5中任一項的方法制備的多肽的組合物。
11.權利要求10的組合物，其中所述多肽是抗體、其片段或變體、或包含抗體、其片段或變體的融合蛋白。
全文摘要
提供一種用于在真菌宿主細胞中產生抗體的方法，其中產生的抗體具有低糖基化程度。
文檔編號C07K16/00GK102459330SQ201080030803
公開日2012年5月16日 申請日期2010年5月7日 優先權日2009年5月7日
發明者D.J.圖思, D.斯里普, J.P.瓦特斯, J.海, L.R.埃文斯, M.J.薩克斯頓, M.休斯, N.多茲沃思, S.阿思瓦爾 申請人:諾維信生物制藥丹麥公司